Extracto
La transición (EMT) epitelio-mesenquimal es un proceso de diferenciación que ha sido implicado en la metástasis y la generación de cáncer de células iniciadoras (AIC) en tumores sólidos. Para examinar EMT en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), se utilizó un sistema de tres dimensiones (3D) de cultivo celular en el que las células se co-estimuladas con el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) y la transformación del factor de crecimiento beta (TGF). culturas NSCLC esferoide muestran una expresión elevada de factores de EMT-interruptor principal de transcripción,
TWIST1
,
Snai1 /snail1
,
SNAI2 /Slug
y
ZEB2 /Sip1
, y son altamente invasiva. culturas mesenquimales NSCLC muestran las características de la CIC, mostrando una expresión elevada de factores de transcripción
KLF4
,
Sox2
,
POU5F1 /Oct4
,
MYCN
, y
KIT
. Como resultado, estos putativo CIC mostrar un cáncer fenotipo "tallo-como" mediante la formación de metástasis pulmonares bajo dilución limitante de células. El factor de transcripción pleiotrópica, NF-KB, se ha implicado en EMT y la metástasis. Por lo tanto, nos propusimos desarrollar un modelo de CPNM para caracterizar mejor el papel de la activación de NF-kB en el desarrollo de los AIC. Aquí, nos demuestran que la inducción de la EMT en culturas resultados 3D en la actividad de NF-kB constitutiva. Además, la inhibición de NF-kB como resultado la pérdida de
TWIST1
,
SNAI2
, y
ZEB2
inducción, y un fracaso de las células para invadir y metastatizar. Nuestro trabajo indica que NF-kB se requiere para el NSCLC metástasis, en parte, por factores de transcripción-interruptor maestro transcripcionalmente upregulating requeridos para la EMT
Visto:. Kumar M, Allison DF, Baranova NN, Wamsley JJ, Katz AJ , Bekiranov S, et al. (2013) NF-KB Regula mesenquimales transición para la inducción de células de Iniciación de células no pequeñas del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (7): e68597. doi: 10.1371 /journal.pone.0068597
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Enero, 2013; Aceptado: 30-may de 2013; Publicado: July 30, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kumar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo era apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01CA132580, R01CA104397 (a MWM), y R01CA136705 (a DRJ). Todos los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el desarrollo del cáncer de neoplasia maligna previa temprano para la enfermedad metastásica completo es un proceso de múltiples etapas que implica interacciones de tumores epiteliales del estroma, la angiogénesis y la infiltración de células pro-inflamatorias asociadas a tumores [1], [2]. Una hipótesis emergente propone que este medio de interacciones célula-célula, factores de crecimiento y citoquinas conocida como el microambiente tumoral, estimula la morfogénesis dentro de las células tumorales que se hace referencia como la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [3] - [5]. EMT induce una redistribución de la arquitectura intracelular, disminución de la adhesión célula-célula, y la pérdida de la polarización celular. carcinoma de células que han sido objeto de EMT son característicamente móviles, invasivo y altamente metastásico. En los últimos años, EMT también ha sido reconocido como un programa de-diferenciación atribuido a la generación de células iniciadoras del cáncer o iniciadoras del tumor (AIC) que son importantes en el mantenimiento de cáncer "stemness" [6] - [9] .
Aunque múltiples citocinas y factores de crecimiento inducen EMT, uno de los factores mejor estudiados se factor de crecimiento transformante beta (TGF) [2], [3], [10] - [13]. La estimulación de las células con TGF resultados en la expresión de los factores de transcripción cortacircuitos de EMT, TWIST1, Snai1 /Caracol, SNAI2 /Slug, y ZEB2 /Sip1 que juntos regulan diferencialmente los genes para promover el fenotipo mesenquimal [10], [12]. Si bien una amplia investigación detalla la capacidad de TGF para inducir EMT, la evidencia indica que el factor de necrosis tumoral (TNF) potencia aún más la transición [14], [15]. Durante la progresión del cáncer, la secreción de TGF dentro del microambiente del tumor se produce a través de muchos tipos de células diferentes, incluyendo los fibroblastos asociados al tumor, mientras que la secreción de TNF se origina a partir de macrófagos asociados al tumor M2 [3], [16], [17]. Una hipótesis que prevalece en el campo es que la exposición de las células cancerosas a estas citoquinas en el microambiente tumoral promueve la EMT, de-diferenciación, y la formación de CICs [2], [5], [17].
TNF es un potente pro-inflamatoria citocina que estimula las cascadas de señalización para activar el factor nuclear kappa B (NF-kB). Como factor de transcripción, NF-kB juega un papel clave en la expresión de genes implicados en la iniciación y progresión del cáncer. La regulación positiva de la actividad de NF-kB se produce con frecuencia en los tumores sólidos y hematológicos primarios, en correlación directa con la morfología de-diferenciado, estadio tumoral avanzado, y el mal pronóstico clínico [18]. Es importante destacar que, NF-kB se ha relacionado con CICs mamarias [19], [20]. NF-B induce y mantiene la EMT en sistemas modelo a través de dos mecanismos, la regulación positiva de la EMT-interruptor general de factores de transcripción [21] - [24] y la estabilización de caracol [25]. NF-kB se compone de cinco miembros de la familia Rel de RelA: /p65, RelB, CREL, p50 y p52. En las células no estimuladas, las subunidades de I? B inhibitorios asocian con los dímeros NF-kB y secuestran en el citoplasma. Tras la estimulación celular por las citoquinas pro-inflamatorias, I? B? Es fosforilado por el complejo de I? B quinasa (IKK), ubiquitinada por el SCF de tipo E3 ligasa, E3RS
I? B /β-TrCP y degradados por el proteasoma 26S [26]. Liberado NF-kB se transloca al núcleo para activar la expresión génica mediante el reclutamiento de coactivadores transcripcionales [27]. Nuestro laboratorio ha demostrado que se requieren modificaciones postraduccionales en de RelA para la actividad transcripcional completa NF-kappa B [27] - [30]
Aunque EMT en modelos de cáncer de mama requiere la actividad de NF-kappa B [31], el papel de. este factor de transcripción en la estimulación de la EMT y el desarrollo de los CIC en NCSLC no ha sido examinado a fondo. Sin embargo, existe una fuerte evidencia de la presencia de células madre /progenitoras de NSCLC en los adenocarcinomas primarios y líneas celulares establecidas [32] - [35]. Aquí, demostramos que la activación coordinada de TNF y TGF cascadas de señalización induce efectivamente EMT y la expresión de genes relacionados con la desdiferenciación y stemness. Además, se muestra que las células mesenquimales de NSCLC poseen constitutivamente activa NF-kB, y que la inhibición de NF-kB disminuye la EMT, la formación de la CIC, y el potencial metastásico.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
CPNM líneas A549, H359, H1299, H157 y se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron como cultivos 2D en DMEM (Cellgro), 10% de SFB (Invitrogen) y penicilina /estreptomicina (Invitrogen). Los anticuerpos utilizados incluyen: E-cadherina (BD Pharmingen- 610.404), N-cadherina (BD Pharmingen- 610920), vimentina (V6630), fibronectina (BD Pharmingen- 610078), α-tubulina (Sigma T6793), HMGA2 (BioCheck 59170AP ), TWIST1 (señalización celular 4119), Snail 1 (señalización celular 4719), Sip1 (SCBT sc-48789), Slug (Abcam ab27568), I? B? (PS32, señalización celular 2859), I? B? (SCBT sc-371), de RelA (pS536 , señalización celular 3031), de RelA (SCBT sc-372), y M2-Flag (Sigma F1804). inhibidores de la proteasa BaculoGold se obtuvieron de BD Biosciences. TGF (PHG 9204) y TNF (PHG 3015) fueron adquiridos de las tecnologías de Invitrogen /Life. Todos los demás productos químicos fueron de Sigma.
cultivos tridimensionales esferoide multicelular
cultivos esferoides multicelulares tridimensionales fueron creados usando un método modificado de gota colgante [36]. Las células fueron cultivadas a aproximadamente el 80% de confluencia en placas de cultivo de tejidos estándar. Las células se tripsinizaron, posteriormente, se resuspendieron en DMEM /10% FBS, y se contaron. Para crear 25.000 esferoides de células, la suspensión celular se diluyó a una concentración de 1.000.000 células /ml, y 25 l de la suspensión celular se pipetearon sobre el lado inferior de un 10 cm tapa placa de cultivo de tejidos estéril. Cada tapa tiene aproximadamente cincuenta gotas. Después de cargar las gotas, la tapa se colocó sobre una placa de cultivo de tejido que contiene 6 ml de PBS estéril y se incubó durante 48 horas para facilitar la agregación celular y la formación de esferoides. Los esferoides recién formados se transfieren a continuación a 10 placas de suspensión cm que contenían DMEM y FBS al 2% para evitar la unión de las células a la placa. placas de suspensión se hicieron mediante la adición de 8 ml de la solución de poli-de HEMA (Sigma-Aldrich P3932, 10 mg /ml) en 95% de etanol a placas petri estériles placa de poliestireno (Fisher Scientific). Las placas se incubaron a continuación durante 24 horas en un ambiente estéril para permitir que el etanol se evapore. Antes de su uso, las placas se lavaron con PBS estéril para eliminar cualquier etanol residual u otros contaminantes. Cada placa de suspensión puede contener hasta 100 esferoides. Después de la transferencia, los esferoides se trataron con vehículo o con 10 ng /ml de TNF y 2 ng /ml TGF, y se incubaron durante 48 horas. Después de la incubación, las células fueron sometidas a un segundo tratamiento de vehículo o TNF y TGF, y se incubaron 48 horas adicionales. Los esferoides fueron luego recogidos y analizados mediante diversos ensayos.
Microscopía de inmunofluorescencia
Las células A549 se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se sometió a EMT inducción o se deja sin tratamiento. Después de la inducción, las células se fijaron en 100% de metanol y posteriormente se incubaron con anticuerpos primarios al dominio extracelular de E-cadherina (SCBT, SC-7870). Se ha realizado una AlexaFlour conjugado, anticuerpo de cabra anti-conejo (Invitrogen) como anticuerpo secundario, y la inmunofluorescencia indirecta de E-cadherina Se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon E3800.
migración y la invasión
in vitro
migración y la invasión ensayos se llevaron a cabo En acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences). culturas 2D y 3D se desglosaron por tripsina y posteriormente se contaron. 1 × 10
5 células (migración) o 1 × 10
4 células (invasión) se sembraron en DMEM sin formato en el pozo superior de una placa de control transwell (BD 354578) o la placa de invasión Matrigel (BD 354480). El fondo del pozo se cargó con DMEM que contiene 10% de FBS como un quimioatrayente, y las placas se incubaron durante ocho horas (migración) o veinticuatro horas (invasión) a 37 ° C y 5% de CO
2. Después, se eliminaron las células en el lado superior de la membrana, y las células restantes se fijaron en 100% de metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Las células teñidas fueron imágenes y se cuantificó usando Adobe Photoshop.
Modelo de tumor
monocapa (2D) y 3D culturas A549 que habían quedado sin tratar o tratadas con TNF y TGF se tripsinizaron, se resuspendieron en DMEM /FBS al 0,5%, y contó cuidadosamente y se diluye en el volumen apropiado para inyección. Las células fueron por vía subcutánea (SC) inyectados en consanguínea femenina Crl: nu /nu ratones desnudos (Charles River). Se inyectaron cinco ratones por condición experimental. Se realizaron todos los estudios en animales como tres experimentos independientes. Los ratones fueron sacrificados cuarenta días después de la inyección. Los tumores SC primarios se retiraron y se pesaron. Además, se extrajeron los pulmones, se fijaron en formalina, y se contaron las metástasis pulmonares superficie. Para cuantificar la cantidad de carga total de tumor en el tejido con formalina pulmón fija, se extrajo ADN genómico [37] y se ensayaron para la presencia de material genómico humano como se describe usando la reacción en cadena de tiempo real de la polimerasa cuantitativa (QRT-PCR) cebadores específicos para humanos retrovirus endógeno-3 (ERV3, el cuadro S1) [38], [39].
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la recomendación del Comité de Cuidado y uso de Animales (ACUC) de la Universidad de Virginia. El protocolo fue aprobado por ACUC Nº 3914. Todos los experimentos se terminaron después de 40 días en el cual los tumores SC momento eran menos de 1,0 cm
3 en tamaño; Por lo tanto, la restricción de la carga tumoral. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el sufrimiento.
QRT-PCR, inmunotransferencias, y ensayos de movilidad electroforética (EMSA) guía
QRT-PCR y experimentos de inmunotransferencia se llevaron a cabo como se describe anteriormente [28 ]. cebadores de PCR se muestran en la Tabla S1. Los extractos nucleares se prepararon utilizando esferoides de A549.V y líneas celulares A549.I tratados con o sin TNF y TGF. ensayos de EMSA y supershift se realizaron como se describe anteriormente [40].
Estadísticas
En su caso, las comparaciones entre los grupos experimentales se llevaron a cabo mediante la realización de Student de una cola
t
prueba en Microsoft Excel. Los datos para todos los experimentos se consideraron estadísticamente significativas cuando p. & Lt; 0,05
Resultados
Un modelo para estudiar la EMT en el CPNM
TNF se ha demostrado potenciar la EMT TGF-mediada a través la activación de las vías coestimuladoras [15]. Para confirmar esta observación en nuestro modelo en tres dimensiones (3D), una timecourse se realizó utilizando ambas citoquinas en tándem y solo. culturas esferoides multicelulares fueron creados usando un método modificado de gota colgante [36]. Después de dos días, los esferoides se suspendieron en placas recubiertas con poli-HEMA y tratados cada dos días con las citoquinas indicadas para inducir EMT (Figura 1A). Se recogieron muestras de no tratados (0 días) y las culturas de citoquinas tratados (1-8 días). Epitelial (E-cadherina) y mesenquimales (N-cadherina, vimentina, y fibronectina) marcadores se midieron mediante inmunotransferencia. El tratamiento con TNF resultó en un aumento modesto en la N-cadherina y fibronectina, pero no logró mostrar diferencias en otros marcadores (Figura 1B). Consistente con la inducción de EMT, el tratamiento TGF resultó en una pérdida de la expresión de E-cadherina y un aumento de la N-cadherina, vimentina, y fibronectina. Además, la co-estimulación con TNF y TGF produjo un fenotipo más mesenquimal y persistió a lo largo del curso de tiempo 8 dia (Figura 1B). Es importante destacar que la estimulación con TNF y TGF induce efectivamente EMT en ambas líneas celulares A549 y H358 dentro de los cuatro días de tratamiento, en comparación con H1299, que ya muestra los cambios en E-cadherina y vimentina (Figura 1C). Sobre la base de resultados de la Figura 1, se utilizó el período de cuatro días durante nuestros experimentos restantes.
(A) Una línea de tiempo ilustra el procedimiento utilizado para crear una población de células mesenquimales tridimensional a partir de monocapas confluentes. Se trataron cultivos de (B) Esferoide de las células A549, con TNF, TGF, o ambas citoquinas cada cuarenta y ocho horas para los tiempos indicados. El análisis por inmunotransferencia cambios medidos en epitelial (E-cadherina) y mesenquimales (N-cadherina, vimentina y fibronectina) marcadores de más de un transcurso de tiempo de ocho días. culturas (C) en 3D de múltiples líneas celulares de NSCLC (A549, H358, H1299) se incubaron durante noventa y seis horas en ausencia o presencia de TNF y TGF. marcadores epiteliales y mesenquimales se midieron posteriormente por inmunoblot. Los resultados de la Figura 1B y 1C son ejemplos representativos de al menos tres experimentos independientes; α-tubulina actúa como un control de la carga de proteínas.
3D culturas someterse a EMT de manera más eficiente que los cultivos 2D
Para determinar si las culturas A549 3D someterse a EMT manera más eficiente que en dos dimensiones (2D ) cultivos monocapa, se midió la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales en respuesta a la estimulación con TNF y TGF como se describe en la Figura 1. Después del tratamiento de citoquinas, los cultivos 3D muestran una pérdida significativa de
CDH1 /e-cadherina
expresión cuando se compara a cultivos 2D (Figura 2A). Por otra parte, los esferoides también poseen una mayor expresión de marcadores mesenquimales
VIM
,
HMGA2
, y el maestro-switch EMT factores de transcripción,
TWIST1
,
Snai1 /snail1
,
SNAI2 /Slug
y
ZEB2 /Sip1 gratis (Figuras 2A y 2B). El análisis por inmunotransferencia de las culturas esferoide confirmar que la expresión diferencial de mRNA dio lugar a un cambio correspondiente en los niveles de proteína (Figura 2C). Además, se examinaron los cambios en la morfología celular y la localización E-cadherina por microscopía. Ambos cultivos 2D y 3D fueron tratados con citoquinas que se describen, tripsina, se re-chapada en cubreobjetos de vidrio, y la tinción de inmunofluorescencia indirecta se llevó a cabo dieciocho horas más tarde. Como era de esperar, monocapa sin tratar y las muestras A549 esferoide mostraron robusta expresión de E-cadherina, aunque la localización de la unión parecía disminuida en las células de las culturas 3D (Figura S1). Además, las células derivadas de esferoides de citoquinas tratados muestran una mayor pérdida de E-cadherina en comparación con 2D muestras tratadas, lo que sugiere que los cultivos 3D fueron sometidos a EMT más eficiente. Los resultados mostrados en la Figura 2 y Figura S1 ilustran la inducción de EMT significativo en 3D culturas medida por los cambios en los marcadores mesenquimales,-interruptor general de la expresión del factor de transcripción EMT, y la morfología celular.
(A y B) en monocapa (2D) y cultivos 3D de células A549 fueron dejados solos (No Agregar) o tratadas con TNF y TGF (TNF /TGF) durante noventa y seis horas. La expresión de marcadores epiteliales (
CDH1
), marcadores mesenquimales (
VIM, HMGA2
) y EMT-factores de transcripción (interruptor general
TWIST1, Snai1, ZEB2, SNAI2
) se midieron mediante QRT-PCR. (C) El análisis por inmunotransferencia de las culturas A549 3D, deja solo (No Agregar) o tratado con TNF y TGF (TNF /TGF), se realizó en la E-cadherina, vimentina, HMGA2, TWIST1, snail1, Sip1, Slug, y α- tubulina. Los resultados en la figura 2A y 2B se normalizaron a
GAPDH
, y se calculan la media ± SD, * p & lt; 0,05, n = 3. Las inmunotransferencias de la Figura 2C son ejemplo representativo de al menos tres experimentos independientes
.
células mesenquimales NSCLC son genes invasivos y expresan endógenamente conocidos para promover propiedades madre-como
fenotípicamente, las células mesenquimales tienen altas tasas de migración y secretan enzimas que degradan la matriz extracelular para facilitar la invasión celular. El uso de
in vitro
transwell ensayos, que mide las características de la migración y la invasión de las células A549 cultivadas, ya sea como cultivos 2D o 3D. Curiosamente, los cultivos de esferoides 3D no tratados mostraron tasas de migración más altas que los cultivos en monocapa en 2D (Figura 3, izquierda). Sin embargo, el tratamiento de las culturas 3D con TNF y TGF potenció aún más la migración en comparación con los cultivos no tratados en 3D. Esferoides tratados con citoquinas invadido a través de Matrigel más eficazmente que cualquier otra condición (Figura 3A, derecha). Además, se trató de citoquinas esferoides A549 muestran la expresión regulada por incremento de
MMP9
,
LOX
, y
COL22A1 gratis (Figura 3B), los genes conocidos para potenciar la invasión [41], [42 ]. Estos resultados demuestran que el cultivo de esferoides 3D en la presencia de TNF y TGF establece una población mesenquimales altamente invasiva. Por último, esferoides citoquinas tratados mostraron upregulation endógeno de marcadores asociados con la desdiferenciación y el mantenimiento de los CIC [43] - [48], incluidos los
KLF4, Sox2, POU5F1 /Oct4, MYCN
, y
KIT gratis (Figura 3C). Los datos mostrados en la Figura 3 indican que la co-estimulación de esferoides con TNF y TGF promueve cambios fenotípicos en las células A549 que resultan en aumento de la invasión y la expresión de productos génicos asociados a propiedades madre similar.
Culturas A549
monocapa y 3D fueron dejados solos (No Agregar) o tratadas con TNF y TGF (TNF /TGF) de noventa y seis horas. (A) Las células fueron desglosados y posteriormente se sometieron a ensayos de migración e invasión. (B y C) Expresión de la invasión (
MMP-9, LOX, COL22A1
) y marcadores de células madre (
KLF4, Sox2, POU5F1, MYCN y KIT
) se midió mediante QRT PCR. Resultados en la Figura 3 se calculan la media ± SD, * p & lt;. 0,05, n = 3. Los resultados de 3B y 3C se normalizaron a
GAPDH
Las células mesenquimales son altamente metastásico y fenotipos que inician el cáncer pantalla
Para examinar si la inducción de la EMT promueve el desarrollo de los AIC
in vivo
, se utilizó un modelo de tumor de xenoinjerto en ratones desnudos. TNF y TGF cultivos tratados 2D y 3D fueron desagregados y suspensiones celulares fueron SC inyecta en el flanco derecho de ratones desnudos. Cuarenta días más tarde, los animales se sacrificaron y los tumores se resecaron SC y se pesaron mientras que los pulmones se extirparon y se obtuvieron para las metástasis de superficie. Para nuestra sorpresa, TNF y las células tratadas con TGF no forman tumores SC en la misma medida como cultivos 2D de citocinas tratadas (Figura 4A, izquierda). Sin embargo, el examen de la superficie del pulmón en estos ratones reveló extensa metástasis (Figura 4A, derecha). La única explicación plausible para estos resultados es que las células mesenquimales a partir de cultivos 3D invadido y metástasis en el pulmón sin el desarrollo de tumores SC
.
(A) en monocapa y 3D culturas A549 se trataron con TNF y TGF por noventa y seis horas . Las células fueron desglosados y SC inyectan en ratones desnudos (1 × 10
6 células /animal). Cuarenta días después, los tumores primarios SC se resecaron y se pesaron. Además, los pulmones fueron extirpados y el número de metástasis de superficie fueron determinar. (B) en monocapa y 3D culturas A549 se dejaron sin tratar o tratadas con el número de células que limitan TNF y TGF y (1 × 10
3 /animal) fueron SC inyecta en ratones desnudos para evaluar la presencia de AIC. La metástasis se evaluó mediante el recuento de tumor de pulmón de la superficie y la carga tumoral pulmonar se evaluó utilizando genómica QRT-PCR para detectar el ADN humano en el tejido pulmonar total. Peso y metástasis pulmonares datos de la Figura 4 son la media ± S. D. de cinco ratones por condición, * P & lt; 0,05, n = 3 experimentos independientes. datos genómicos QRT-PCR de la Figura 4B se normalizan a tejido pulmonar total (mg).
derivan-epitelial Medición de la extensión de la metástasis en virtud de dilución limitante de células demuestra una prueba fiable para la presencia de CICs enriquecidas en tumores [49]. Por lo tanto, los experimentos se repitieron utilizando un mil células por inyección subcutánea. Las suspensiones celulares, derivadas de esferoides tratados TNF y TGF, producen más metástasis pulmonares superficie bajo dilución limitante que las células monocapas tratadas con citoquinas o cultivos 3D sin tratar (Figura 4B izquierda). La limitación de ensayos de dilución de células indican que la inducción de la EMT en 3D culturas produce una población CIC que hace metástasis eficazmente a los pulmones. Como era de esperar, el análisis de ADN aislado de los pulmones del ratón confirmaron la presencia de la carga metastásica y verificaron que las lesiones eran de origen humano (Figura 4B derecha). Llegamos a la conclusión de los experimentos de la Figura 4 que la desdiferenciación, la formación CIC, y el potencial metastásico son todos significativamente mayor en cultivos de esferoides inducida por EMT.
NF-kappa B es constitutivamente activa en cultivos 3D y se requiere para la inducción de la EMT
TNF, un potente activador de NF-kB, aumenta la inducción de la EMT en líneas celulares de cáncer. Por lo tanto, se evaluó si los resultados de inducción de la EMT en la activación de la señalización de NF-kB por inmunoblot. Curiosamente, esferoides A549 mesenquimales muestran la actividad IKK constitutiva medida por fosfato anticuerpos específicos que detectan I? B? PS32 y de RelA pS536 (Figura 5A y Figura S2A). Cambio en la E-cadherina y niveles Vimentina confirmaron EMT eficientes en los esferoides de citoquinas tratados. Por otra parte, QRT-PCR experimentos demostraron incremento en la expresión de los genes regulados NF-kB
IL8
y
BIRC3 /cIAP2 Hoteles en culturas mesenquimales 3D (Figura 5B). En conjunto, estos datos indican que la citoquina tratamiento de 3D culturas A549 resultados en el aumento de la fosforilación de sustratos de IKK-regulada y activación de la transcripción NF-kB constitutiva.
Los cultivos monocapa y 3D de las células A549 se incubaron con citoquinas durante noventa -seis horas. A549 células mesenquimales (A) muestran constitutiva NF-kB activado vías, como se determina utilizando fosfato anticuerpos específicos a I? B? y de RelA. (B) Sin tratamiento y TNF y TGF estimularon cultivos 2D y 3D de las células A549 se recogieron y analizaron para la expresión de NF-kB genes regulados por QRT-PCR. (C y D) Tres culturas dimensionales de A549.V (control vector) y A549.I (SR-I? B) se incubaron durante noventa y seis horas en ausencia o presencia de TNF y TGF. (C) Las inmunotransferencias confirmar la expresión de la Bandera de etiquetado SR-I? B? En la línea A549.I, que bloqueó con éxito la translocación nuclear y unión al ADN, tal como se mide por la EMSA. (D) QRT-PCR confirmó la incapacidad de las células A549.I regular al alza los genes regulados por NF-kB después del tratamiento TNF y TGF. Las inmunotransferencias de la Figura 5A son un ejemplo representativo de tres experimentos independientes. Resultados en la Figura 5B y 5D se calculan la media ± SD, * p & lt; 0,05, N = 3. Los valores de ARN se normalizaron a
GAPDH
Para determinar la importancia de NF. actividad kappa B durante la inducción de la EMT en líneas celulares de cáncer, se generaron piscinas clonales estables que expresan el super-represor I? B? (SR-I? B?). El SR-I? B? Es resistente a la degradación proteasomal y, en consecuencia secuestra NF-kappa B en el citosol. Las células que expresan la proteína SR-I? B? Por lo tanto mostrar una inhibición de la transcripción mediada por NF-kappa B [50]. Figura 5C (arriba) confirma la expresión de la Bandera de etiquetado SR-I? B en células A549 estables (A549.I) en comparación con las células control de vector vacío (A549.V). Además, los extractos de proteínas nucleares procedentes de cultivos esferoides A549.I, tratadas con TNF y TGF, carecían de actividad de unión a ADN de NF-kappa B en comparación con los extractos de A549.V (Figura 5C, abajo). Supershift experimentos confirman que la actividad de NF-kB se compone en su mayor parte de un complejo de RelA-p50 heterodímero (Figura S2 B). ensayos de QRT-PCR muestran la inducción de citoquinas mediada reprimida de
IL8
y
BIRC3 /cIAP2 Hoteles en células A549.I en comparación con las células control A549.V (Figura 5D). En contraste con las altas dosis de TNF (100 ng /ml), dosis bajas (10 ng /ml) no dio como resultado una pérdida de la viabilidad celular en líneas A549.I, ya que la expresión de la gen de mantenimiento, HPRT, no cambió y se utilizó para la normalización en la Figura 5D. Estos datos verifican que la expresión SR-I? B? En la línea celular A549.I efectivamente bloquea la actividad transcripcional de NF-kB.
Caracterización de NF-kB en la potenciación del fenotipo mesenquimal
NF-B ha sido demostrado que regulan la expresión de EMT-interruptor general de factores de transcripción en varios sistemas modelo [21] - [24]. Por lo tanto, la hipótesis de que la inhibición de la actividad de NF-kB en la línea celular A549.I frenaría la inducción de la EMT. El análisis por inmunotransferencia confirmó que las células A549.I fallan para regular hacia abajo la expresión de E-cadherina o regular por incremento marcadores mesenquimales (vimentina, N-cadherina y fibronectina) en comparación con las células control (Figura 6A). Por otra parte, las células tratadas con citoquinas A549.I sólo mostró regulación al alza mínima de
TWIST1
,
ZEB2
y
SNAI2
la expresión génica después de TNF y TGF tratamiento (Figura 6B). Estos resultados indican que NF-kB es necesario para regular al alza
TWIST1
,
ZEB2
y
SNAI2
, mientras que la expresión de
Snai1
parece independiente de NF la transcripción kappa B dependiente en la línea celular A549.I. Estos resultados sugieren que la expresión de la EMT-interruptor general de los factores críticos de transcripción requiere la actividad de NF-kB.
Células
(A) A549.I no muestran cambios en los marcadores mesenquimales, según lo determinado por análisis de inmunoblot. (B) NF-kB es necesario para regular positivamente la expresión del ARNm de factores de transcripción-interruptor principal. (C) los cultivos esferoide A549 y líneas celulares H157, que expresan el vector vacío o el super-represor Bandera-I? B, se quedaron solos (No Agregar) o tratadas con TNF y TGF (TNF /TGF) de noventa y seis horas. Las células se desagregan y se sometieron a ensayos de invasión. (D) A549.V y culturas A549.I 3D se quedaron solos (No Agregar) o tratadas con TNF y TGF (TNF /TGF) durante noventa y seis horas. Las células fueron desglosados y SC inyectan en ratones desnudos (1 × 10
6 /animal). Cuarenta días más tarde, los animales fueron sacrificados y el número de metástasis de pulmón eran superficie determinada. Además, los tumores fueron extirpados y SC peso del tumor húmedo determinados. Peso y metástasis pulmonares datos de la Figura 6 son la media ± S. D. de cinco ratones por condición, * P & lt; 0,05, n = 3 experimentos independientes. Los gráficos de la Figura 6 son la media ± S.D., * p & lt; 0,05, de tres experimentos independientes. Los datos con
P
los valores superiores a 0,05 se consideró no significativa (
ns
). QRT-PCR experimentos se normalizan a
GAPDH
expresión.
A continuación, se evaluó si el CPCNP requiere NF-kB para la invasión Transwell usando ensayos. actividad inhibido NF-kB en las células A549.I abolió invasión a través de Matrigel en comparación con las líneas de control (Figura 6C). Este efecto no fue la línea celular específica ya que otra línea de NSCLC que expresa el SR-I? B (H157.I) mostró resultados similares a los de las células A549.I. Dado que los datos mostrados en la Figura 6 indican que NF-kappa B se requiere para el NSCLC a someterse a EMT, hemos probado la A549.V y celular A549.I por su capacidad para producir metástasis en pulmón utilizando un modelo de ratón desnudo. Como era de esperar, las células A549.I citoquinas tratados no lograron formar metástasis pulmonares (Figura 6D, izquierda). La incapacidad de estas células para producir metástasis en pulmón no era debido a una pérdida de la viabilidad celular o la incapacidad de formar tumores primarios, ya que A549.I no tratada formó tumores SC con tasas de crecimiento similares a las células A549.V (Figura 6D, a la derecha). Por lo tanto, los datos mostrados en la Figura 6 indica que los cultivos tratados con TNF y TGF 3D NSCLC requieren NF-kappa B para regular positivamente factores-interruptor principal de transcripción, inducir EMT, y promover propiedades invasivas. Por otra parte, sin actividad transcripcional de NF-kB células A549 pierden su capacidad de producir metástasis en pulmón sin afectar el crecimiento del tumor primario.
Discusson
NF-kB regula la EMT para potenciar la progresión metastásica del NSCLC
Hemos implementado un sistema de cultivo 3D sencillo y relativamente rápido para examinar la importancia de la señalización de NF-kB EMT durante la inducción y propagación CIC dentro de las líneas celulares de cáncer. En respuesta a la exposición TNF y TGF, culturas A549 esferoide muestran una pérdida de E-cadherina y elevada expresión de marcadores mesenquimales, N-cadherina, vimentina, y fibronectina. El aumento de la expresión de marcadores de proteínas mesenquimales se produce probablemente debido a la inducción de los factores cortacircuitos de EMT de transcripción,
TWIST1
,
Snai1
,
SNAI2
y
. Por otra parte, las poblaciones de esferoides de células mesenquimales A549 muestran una expresión elevada de factores de transcripción endógenos conocidos para potenciar la desdiferenciación, incluyendo
KLF4
,
Sox2
,
POU5F1
,
MYCN
y
KIT
. Curiosamente, las células A549 mesenquimatosas a partir de cultivos de esferoides no generaron tumores SC grandes, en comparación con cultivos 2D. A pesar de este efecto, las células A549 3D de citoquinas tratados muestran pulmonares lesiones metastásicas superficie elevadas. Estos resultados apoyan la hipótesis de que los AIC extravasada en el sistema circulatorio y metástasis a los pulmones sin la formación de tumores SC. Además, demostró que las culturas 3D A549 inducida por EMT metástasis pulmonar efectiva a bajo diluciones celulares limitantes, lo que confirma la presencia de una población enriquecida "tallo-como" CIC.