Extracto
Antecedentes
Sobre regulación de la endógena humana más abundante de la familia H retrovirus (HERV-H), especialmente los relacionados con las transcripciones env-, se correlaciona con el cáncer de colon. Sin embargo, el patrón de expresión de las transcripciones empalmados de HERV-H no codificante no está claro.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, las transcripciones de expresión de HERV-H empalmados en el cáncer de colon se investigó por una estrategia de RT-PCR usando cebadores dirigidos a la tRNA
Su sitio de unión a cebador y la región R en la repetición terminal larga 3 (LTR), seguido por la clonación y secuenciación de los amplicones. Las secuencias se asignan a los loci HERV-H individuo mediante el empleo de diferencias de nucleótidos privadas entre loci. Los diferentes patrones de expresión de HERV-H transcripciones longitudinalmente desde distintos elementos activos se encuentran en líneas celulares de cáncer de colon HT29, LS 174T, RKO, SW480 y SW620. Además, los patrones de expresión en SW480 y RKO se cambiaron significativamente por el tratamiento de desmetilación. Curiosamente, no se encontraron más elementos HERV-H para ser transcripcionalmente activo en los tejidos tumorales de colon que en los tejidos normales adyacentes (14
vs. Página 7).
Conclusiones /Importancia
Esta es la primera investigación para estudiar el carácter de expresión de no codificante transcripciones longitudinalmente de elementos HERV-H en el cáncer de colon. Los patrones de expresión de HERV-H transcripciones longitudinalmente diferían entre líneas celulares de cáncer de colon y podrían verse afectados por los niveles de metilación de ADN genómico. Más importante aún, además de la opinión comúnmente aceptada de la regulación de la expresión de HERV-H en los tejidos tumorales de colon, encontramos más activa loci HERV-H en tumor de colon en comparación con los tejidos normales adyacentes
Visto:. Liang Q , Xu Z, R Xu, Wu L, S Zheng (2012) Patrones de expresión de las transcripciones no codificante empalmadas de retrovirus endógeno HERV-H Elementos humano en el cáncer de colon. PLoS ONE 7 (1): e29950. doi: 10.1371 /journal.pone.0029950
Editor: Klaus Roemer, Universidad de la Escuela de Medicina Sarre, Alemania |
Recibido: 15 Septiembre, 2011; Aceptó 7 de diciembre de 2011; Publicado: 6 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Liang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Cooperación Internacional de Ciencia y Tecnología Fundación clave de la provincia de Zhejiang (2009C14010), Fundación de Ciencias Naturales Provincial de Zhejiang (R2090353), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30973382 y 81101488). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
retrovirus endógenos humanos (HERV) constituyen 8% del genoma humano [1]. Se supone procedentes de la infección de células germinales por retrovirus exógenos durante la evolución de los primates [2]. La estructura proviral de elementos HERV se compone principalmente de 5 'LTR
gag CD -
Pro Trial -
pol CD -
env
3' LTR, en el cual los cuatro genes (
gag
: antígeno de grupo específico,
Pro Trial: proteasa,
pol
: polimerasa, y
env
: sobre) codificar proteínas estructurales /funcionales esenciales de un retrovirus competentes para la replicación, y las repeticiones terminales largas (LTR) en ambos extremos difieren HERVs de otros retrotransposones, tales como elementos nucleares largos períodos de actividad (líneas). La mayor parte de los restos de HERV están aislados simplemente copias LTR, con la secuencia interna de haber sido perdido en la integración o a través de recombinación homóloga. familias HERV están definidos por diferentes criterios, tales como la homogeneidad de sus homólogos exógenos, la similitud de secuencia de los
pol
genes, y el sitio de unión del cebador (PBS) inmediatamente aguas abajo de la LTR 5 '. HERV familia H (HERV-H) contiene un PBS con una secuencia similar al ARNt humana
Su. Hay alrededor de mil elementos HERV-H en todo el genoma humano, y la mayoría de ellos (800-900) carecen de casi todo el
env
región [3], [4]. Se ha informado de que sólo 18 elementos HERV-H en el genoma humano son relativamente completo [5], y sólo tres fueron identificados para contener intactos
env
marcos de lectura abierta (ORF) [6].
a pesar de que la mayor parte de los elementos HERV-H son estructuralmente incompleta debido a la mutación y su eliminación durante la evolución, hay cientos de ellos de retención completos 5 'y 3' LTR y una PBS-ARNt
Su inmediatamente aguas abajo de los 5 ' LTR [7]. La expresión de elementos HERV es sobre todo bajo el control de sus LTRs [8]. Un elemento completo LTR tiene una estructura de U3-R-U5 (5 '→ 3'), que contiene tanto iniciar la transcripción y señales de terminación. La transcripción de elementos HERV por lo general comienza a partir de la región R en el 5 'LTR y termina en el extremo de la región R en el 3' LTR. También se propone que las células de expresión dependiente del tipo de elementos HERV se controla normalmente por secuencias reguladoras específicos localizados principalmente en la región U3 [9].
Debido a la propiedad inmunosupresora de la proteína de cubierta de HERV-H, muchos estudios se centraron en los
env transcripciones
relacionados con la PI [10], y los que no
env
transcripciones fueron relacionados con la PI rara vez prestado atención a. Sobre regulación de los más abundantes HERV H familia, especialmente
env transcripciones
relacionados con la PI, se ha informado que se asocia con el cáncer colorrectal [5], [11], [12]. En nuestro estudio anterior, se observó que había muchas líneas celulares de cáncer de colon no codificantes de ARN transcrito a partir de elementos HERV-H, tanto en tejidos normales y cancerosas de colon, así como empalmados. Sin embargo, el patrón de expresión de los transcritos empalmados no codificantes de HERV-Hs no está claro. Durante los estudios de los tres genes relacionados con el HERV-H recientemente identificados [13], [14], [15] en nuestro laboratorio, se observó que la expresión general de los elementos HERV-H en el cáncer de colon fue compleja y diferente entre las muestras tumorales y muestras normales adyacentes. También se observó que muchos
env
-eliminado HERV-Hs eran transcripcionalmente activo, y muchos empalmado no codificante de ARN se transcribe en los tejidos tanto de tumor y normales, así como líneas celulares de cáncer. En este estudio, se inició el primer estudio para averiguar los lugares exactos de los elementos HERV-H más activos en el cáncer de colon.
Resultados
La estrategia de RT-PCR-secuenciación para enganchar HERV -H no codificante transcripciones
Puesto que hay más de mil miembros de la familia HERV-H en todo el genoma humano, con secuencias de baja complejidad y homólogos entre sí, es difícil de estudiar su perfil de transcripción por teniendo cada miembro en consideración. Con el fin de perfilar la expresión de HERV-H en líneas celulares de cáncer de colon, tumor de colon y los tejidos normales adyacentes, y para identificar los loci exacta de los elementos HERV-H más activos, hemos desarrollado una estrategia de RT-PCR de clonación para enganchar una grupo seleccionado de transcripciones relacionadas con H HERV. La transcripción de elementos HERV es generalmente iniciado desde el 5 'de la región R y termina en el final de la región 3' R [16]. Hemos diseñado los cebadores haciendo referencia a la secuencia del consenso HERV-H construido por Jern
et al.
[5], con el cebador directo dirigidas a la PBS-ARNt
Su aguas abajo de la LTR 5 ' y el cebador inverso la orientación de la región R de 3 'LTR (Fig. 1A). Este par de cebadores se suponía para generar productos de PCR de los transcritos HERV-H de tamaños distintos. En consecuencia, el total de productos de RT-PCR se clonaron en los vectores pGEM-T Easy y se transfectaron en
E. coli
. Más de treinta colonias de cada muestra fueron seleccionados al azar y los plásmidos fueron secuenciados. resultados de secuenciación se asignan a específica loci HERV-H basado en diferencias de nucleótidos privadas entre loci individuales (uno o varios nucleótidos que son característicos de un locus HERV-H). resultados de la secuenciación de todas las colonias seleccionadas al azar indicaron que no estaban insertos de las transcripciones no HERV-H, lo que demuestra nuestra estrategia funcionó bien.
A. demostración esquemática de los lugares de cebadores. TSS, sitio de inicio de la transcripción; TTS, la transcripción sitio de terminación. B. RT-PCR se realizó para detectar HERV-H transcripciones longitudinalmente en líneas celulares de cáncer de colon con /sin tratamiento acetilación desmetilación /histona utilizando el agente de desmetilación del ADN DAC y el TSA inhibidor de histona desacetilasa. H2O y la mezcla de ADN genómico (gDNA mezcla) se utilizaron como controles. mezcla de ADN genómico producido bandas distintas a partir de muestras de cDNA, que se transcribe de forma inversa a partir de ARN tratado con DNasa.
transcripciones expresión de HERV-H empalmados en líneas celulares de cáncer de colon, y la expresión alterada en respuesta a la desmetilación del ADN tratamiento
ensayos de RT-PCR se realizaron en cinco líneas celulares de cáncer de colon HT29, incluyendo, LS 174T, RKO, SW480 y SW620. Diferentes patrones de bandas se obtuvieron a partir de estas líneas celulares (Fig. 1B izquierda). Se observó un nivel relativamente bajo de expresión de HERV-H en la RKO. Se ha informado de que no es la metilación del ADN a nivel genómico mundial por direccionamiento de secuencias repetitivas [17], por lo que investigar más a fondo si el tratamiento desmetilación sería cambiar el patrón de transcripción de elementos HERV-H. Las células cancerosas fueron tratados con inhibidores de la metilación del ADN y la histona desacetilasa (DAC y TSA respectivamente). RT-PCR resultados mostraron que los patrones de expresión de HERV-H se han cambiado de manera significativa en SW480 y células RKO (fig. 1B derecha). Estos resultados sugirieron que el contexto epigenética de un genoma afectó a la expresión de algunos de los elementos HERV-H.
producto de RT-PCR de cada línea celular de cáncer de colon se analizó adicionalmente por secuenciación después de la clonación. resultados de la secuenciación fueron asignados a loci genómicos por Blat búsquedas contra el conjunto del genoma humano (hg19). secuencias de ADN genómico fueron entonces recuperados y analizados con RepeatMasker para determinar las secuencias de HERV-H. Sólo se encontraron un número limitado de elementos HERV-H para ser transcripcionalmente activo en cada una de estas líneas celulares, con seis loci (siete elementos) en HT29 y dos o tres en cada una de las otras líneas celulares (Tabla 1).
Caracterización de los elementos HERV-H activos y sus transcripciones longitudinalmente en líneas celulares de cáncer de colon
alineaciones por parejas, se realizaron con el 9,0 kb consenso HERV-H construido por Jern
et al.
para determinar los patrones de los fragmentos-borrar de cada elemento HERV-H. resultados de la alineación muestran todos los elementos HERV-H activos en líneas celulares de cáncer de colon eran estructuralmente incompleta, con la más larga de ser 6488 pb de largo (Tabla 1 y la Fig. S1). Se encontraron seis fragmentos que han resultado comúnmente borrado en estos elementos, incluyendo una corta en el
gag
región, cuatro de la
pol
región, y casi la totalidad de
env
región (Fig. 2A). Hubo algunas excepciones. El elemento situado en 16q24.1 (activo en HT29) y el situado en 22q11.1 (activo en LS 174T) eran extraordinariamente corto (Fig. 2B). El que está en 16q24.1 fue sólo 3.185 pb de longitud, con el conjunto
gag
región y un gran fragmento que abarca el
pol
y
env
eliminado. El que está en 22q11.1 era 3.842 pb de largo, con
pol
y
env
regiones casi todo el eliminadas. La mayor parte de los amplicones (& gt; 90%) a partir de LS 174T contenían secuencias correspondientes a los ARN empalmados del elemento HERV-H 3,8-kb en 22q11.1, la mayor parte de los cuales (& gt; 60%) fueron empalmados se multiplican. Curiosamente, dos elementos HERV-H encuentra en 1p32.3 (2,8 kb separado) se encontró que eran activos en las células HT29, haciendo uso de 5 'LTR de la primera HERV-H y 3' LTR de la segunda (transcripción secuencia representativa JK017392). El análisis de secuencia reveló que el 5 'LTR le faltaba a este último elemento de 2.298 pb HERV-H (Fig. 2C).
A. Esquema de las seis regiones comúnmente eliminados en los elementos HERV-H activos en líneas celulares de cáncer de colon. B. Esquema de los dos elementos HERV-H extraordinariamente cortos y sus transcripciones. alineamientos por pares para cada elemento HERV-H se llevaron a cabo con el consenso HERV-H construido por Jern P,
et al
. Los resultados de la alineación acortadas se muestran para indicar las regiones que faltan con precisión. la densidad del color representa el grado de homología con el consenso HERV-H. zonas grises representan las regiones de los elementos HERV-H eliminan en comparación con el consenso HERV-H. empalmados transcripciones se muestran por encima de los resultados de la alineación en consecuencia. barras gruesas representan los exones, y las líneas representan los intrones. Regiones del LTR, pre-gag,
gag
,
Pro Trial,
pol
y
env ¿Cuáles son marcados a continuación. C. Esquemas de los dos elementos HERV-H activos de forma combinada situados en 1p32.3 en HT29.
Más elementos HERV-H fueron transcripcionalmente activo en tumores de colon que en los tejidos normales adyacentes
Expresión de las transcripciones HERV-H en el tumor de colon y los tejidos normales adyacentes fueron analizados por RT-PCR. Se observó una ligera diferencia entre los productos de RT-PCR de tumor de colon y muestras normales adyacentes, con algunos productos de tamaños más grandes presentes en muestras de tumor (Fig. 3). Después de la secuenciación y análisis de secuencias de los productos de PCR, se encontró que 14 elementos HERV-H para ser transcripcionalmente activo en muestras de tumores de colon. Por el contrario, sólo se encontraron 7 elementos HERV-H que es activo en las muestras de colon normales adyacentes. Los detalles de estos elementos HERV-H se indican en la Tabla 2. El análisis de secuencia por la alineación por pares contra el consenso HERV-H reveló que todos los elementos HERV-H activos eran estructuralmente incompleta, con seis fragmentos comúnmente eliminados como se indica en la figura. 2A (Fig. S2)
M, escalera de DL2000.; T, tumor; N, normal.
Cuatro elementos HERV-H, que se encuentra en 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 y 5q23.2 respectivamente, se activa tanto en el tumor y los tejidos normales adyacentes . Además, se analizó la abundancia de transcripción de cada elemento HERV-H activa. Curiosamente, tres de los elementos activos (comúnmente situados en 1q42.2, 16q24.1 y 19q13.31) cada uno contribuyó a más de 10% de las transcripciones, tanto en muestras tumorales y normales adyacentes. Había otro elemento, situado en 1p31.3, produciendo más de 10% de las transcripciones de tumor. Los cuatro elementos más activos en la muestra de tumor, es decir, los situados en 1q42.2, 16q24.1, 19q13.31 y 1p31.3, en total contribuyeron a 68,89% de las transcripciones en la muestra de tumor. Por el contrario, los tres elementos más activos en muestras normales (que se encuentra en 1q42.2, 16q24.1 y 19q13.31) contribuyeron al 85,71% de las transcripciones generales. Estos resultados indicaron que había más elementos HERV-H activos en los tejidos tumorales de colon que en los tejidos normales adyacentes. Además, la mayoría de las transcripciones en muestras normales adyacentes se produce a partir de menos elementos HERV-H en comparación con muestras tumorales.
Discusión
Debido a la abundancia de elementos HERV-H en el genoma humano y su alta similitud de secuencia entre sí, no parece haber ningún enfoque adecuado para investigar el perfil de transcripción de todo el genoma de los elementos HERV-H, mientras que al mismo tiempo teniendo en cuenta cada elemento individual. Aunque los resultados de este estudio no representan el perfil expressional de todo el genoma real global de elementos HERV-H, tomamos la ventaja de la estrategia de enriquecimiento PCR para enganchar los elementos HERV-H más activos que produjeron transcripciones que contienen el PBS-ARNt
Sus y 3 'R, y con éxito identifican los loci proviral exacta de estos elementos en las líneas celulares de cáncer de colon y muestras de tejido. Los patrones de expresión de HERV-H empalmados transcripciones de elementos HERV-H fueron diferentes entre los tumores de colon, muestras normales adyacentes, y las líneas celulares de cáncer de colon.
Los patrones de expresión de HERV-H empalmados transcripciones de elementos HERV-H fueron diferentes entre las líneas celulares de cáncer de colon de cinco probados, evidenciado por tanto electroforesis en gel de los productos de RT-PCR (Fig. 1B izquierda) y la secuenciación de los amplicones después de la clonación (Tabla 1). El análisis de secuencias por comparación con el consenso HERV-H construido indicó que los elementos HERV-H activos que se encuentran en este estudio fueron todos estructuralmente incompleta en cierta medida. Esto también se puede deducir de las longitudes, todos los cuales eran mucho más corta que la longitud completa HERV-H consenso (9,0-kb). Los patrones de bandas eran diferentes entre las células SW480 y SW620. A pesar de que se originaron a partir de los tumores primarios y metastásicos del mismo paciente, esta diferencia entre SW480 y SW620 puede ser simplemente debido al cultivo a largo plazo. Del mismo modo, el número limitado de elementos HERV-H activos en cada línea celular también puede deberse a la cultura a largo plazo en
in vitro
condiciones definidas. También es interesante que el tratamiento por desmetilación usando inhibidores de la metilación del ADN y la histona desacetilasa, los patrones de expresión en RKO y células SW480 se cambiado significativamente, lo que sugiere que la transcripción de algunos elementos HERV-H están regulados epigenetically
.
Aunque ninguna diferencia obvia se observó en las bandas de productos de RT-PCR entre tumor y las muestras normales adyacentes, los números totales y loci de elementos HERV-H activos fueron significativamente diferentes (Fig 3;. Tabla 2). Se encontraron siete elementos HERV-H para ser transcripcionalmente activo en las muestras de colon normales adyacentes. En comparación, se encontraron 14 elementos para ser activo en los tejidos tumorales de colon ensayados. La expresión de los tres elementos comúnmente más activos (& gt; 10%) parecía ser normal; el situado en 1q24.2 produjo 17,78% y el 26,19% de los productos de tumor y las muestras normales, y los productos de la ubicada en 16q24.1 consistía en 26,67% en el tumor y 16,67% en las muestras normales, respectivamente. Curiosamente, el uno de los elementos situados en 19q13.31 fue el más activo en los tejidos normales adyacentes, produciendo 42,86% de los productos, mientras que sólo el 11,11% de muestras de tumores pertenecía a 19q13.31. Estos resultados demostraron que la mayoría de los HERV-H empalmados transcripciones en tejidos de colon normales adyacentes eran de 19q13.31, mientras que las transcripciones en los tejidos tumorales de colon participan más elementos.
Todos los elementos HERV-H activos que se encuentran en este estudio son estructuralmente incompleta, con seis fragmentos comúnmente eliminados, que se distribuyen a través de la
gag
,
pol
y
env
regiones (Fig. 2A); Aún así, algunos de ellos (40%) retienen los marcos de lectura abiertos putativos (ORF) (Tablas 1 y 2; Fig. S1 y S2). Aunque algunos de estos ORFs putativos han sido sometidas a la secuencia de eliminación en cierta medida cuando se compara con la región correspondiente en el consenso HERV-H, siete de las secuencias de péptidos putativos (codificada por 6 elementos HERV-H) contienen dominios conservados, con una dominio conservado de la proteasa, una CREB5 conservada (respuesta de cAMP proteína de unión de elemento-5) de dominio y cinco conservadas de la transcriptasa inversa (RT) dominios similares. Curiosamente, todos los tres elementos HERV-H comúnmente más activos (localizado en 1q42.2, 16q24.1 y 19q13.31) en el tumor y los tejidos normales adyacentes contienen ORFs putativo con dominios conservados (Tabla 2; Fig. S2). Ya sea que estos ORFs en realidad producen proteínas en tejidos de colon y qué papel juegan en la carcinogénesis de colon son cuestiones que deben abordarse.
Se desconoce la razón de la diferencia en la transcripción elementos HERV-H entre el tumor de colon y los tejidos normales adyacentes. Las células en el tumor y las muestras normales adyacentes son diferentes en muchos aspectos. las células tumorales de colon en una muestra son heterogéneos y cubren más fases del ciclo celular, mientras que las células no tumorales son por lo general en G0. Sin embargo, no ha habido ningún estudio para abordar si HERVs se expresan en un ciclo celular de manera dependiente todavía. Además, las células tumorales están en un estado más diferenciado, en comparación con las células no tumorales, que recuerda el estado de las células embrionarias. La expresión de HERVs de una manera específica de tejido y de desarrollo dependiente etapa ha informado [18]. También se han encontrado elementos HERV ser altamente expresado en los tejidos reproductivos tales como los testículos y la placenta, que contienen células no diferenciadas [5], [19]. Si los elementos HERV-H se expresan en una forma dependiente de la diferenciación, causando posteriormente la diferencia entre el tumor de colon y los tejidos normales adyacentes, también hay que investigar. Estos dos puntos pueden indicar direcciones para estudios sobre el mecanismo por el cual los elementos HERV-H están regulados diferencialmente entre los tumores de colon y los tejidos normales adyacentes.
Este es el primer intento de estudiar las características de expresión de HERV-H transcripciones longitudinalmente en el cáncer de colon. En resumen, nuestros resultados indican que los patrones de expresión de los elementos HERV-H diferían entre líneas celulares de cáncer de colon y podrían verse afectados por el tratamiento desmetilación. Más importante aún, nuestros resultados demostraron que la expresión de HERV-H involucrado elementos HERV-H más activos en tumores de colon que en los tejidos normales adyacentes.
Materiales y Métodos
Ética declaración
este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Zhejiang, y consentimientos por escrito se obtuvo de todos los pacientes que participan.
las muestras de tejido, cultivo celular y preparación de ARN
tumor de colon y muestras de tejidos normales adyacentes eran obtenido después de la resección quirúrgica en el segundo hospital afiliado de la Universidad de Zhejiang y se almacena congelado a -80 ° C hasta la extracción de ARN. tipos de tejido (tumorales o normales) se evaluaron mediante la tinción histológica. Se obtuvieron células de cáncer de la American Type Culture Collection y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal 10%. Se preparó ARN total con el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. RNA siempre se trató con DNasa RQ1 RNasa libre (Promega) antes de la síntesis de ADNc para eliminar la contaminación de ADN genómico.
tratamiento con inhibidores de la desmetilación de metilación del ADN y la histona desacetilasa
Las células se trataron con la metilación del ADN inhibidor de la 5-aza-2 'desoxicitidina (DAC; Sigma) y el inhibidor de histona desacetilasa tricostatina a (TSA; Beyotime) como se describe [20]: el tratamiento inicial con DAC (200 nM) durante 48 h, con la droga y medio sustituye 24 h después del comienzo del tratamiento, seguido de la sustitución del medio que contiene TSA (300 nM) durante otras 24 h. El ARN total a partir de células tratadas con fármaco o las células no tratadas se aisló con reactivo Trizol y se trató con ADNasa antes de la síntesis de ADNc.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
El ARN se transcribe inversa en cDNA utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega) de acuerdo con la guía del fabricante. Los ensayos de PCR se realizaron con
Taq
ADN polimerasa (Promega) en los sistemas de reacción que contienen 0,2 mmol /L adelante y atrás primers cada uno. parámetros del ciclador térmico fueron 94 ° C 5 min, (94 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 90 s) x 36 ciclos, 72 ° C 10 min. productos de PCR de cada muestra de células, mezcla de productos de PCR de seis muestras de tumor y la mezcla de producto de PCR de seis muestras normales adyacentes se purificaron con el kit de AxyPrep PCR Cleanup (Axygen), clonado en el fácil vector pGEM-T (Promega) y se transfectaron en
E. coli
bacterias. Más de 30 colonias de cada muestra de células y 100 colonias a partir de muestras de tejido normal o tumor se sometieron a secuenciación de Sanger. Los objetivos de los cebadores se indican en la figura. 1A y sus secuencias de nucleótidos son los siguientes: hacia adelante (con el objetivo de PBS-ARNt
Su): 5'-TGGTGCCGTGACTCGGAT-3 ', inversa (con orientación a la región R): 5'-GCTGAGTCCGAAAAGAGAGTC-3'. Los cebadores se diseñaron con referencia al consenso HERV-H construido por Jern
et al.
[5], con "G" en el cebador directo modificados de acuerdo a análisis de la secuencia de todo el genoma de HERV-H-relacionada sitios en nuestra propia unión del cebador (no se muestra).
análisis de secuencias
las secuencias se buscaron con el método de Blat contra el genoma humano utilizando el servidor en línea (http://genome.ucsc.edu/cgi -bin /hgBlat? = comando de inicio). resultados de la secuenciación fueron excluidos si las secuencias en-entre los cebadores tenían más de cinco diferencias en el ADN genómico. secuencias de ADN genómico fueron recuperados de la asamblea del genoma humano (hg19) en http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway. Las secuencias fueron analizadas con el RepeatMasker herramienta a http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker para identificar elementos de repetición. alineamientos por pares se realizaron con GeneDoc. ORF predicción se realizó mediante el programa en línea ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). A continuación, las secuencias de aminoácidos putativa fueron destruidas contra la base de datos de secuencias de proteínas no redundante utilizando el programa BLASTP en línea (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Secuencia de presentación
Un total de 92 secuencias de nucleótidos de las transcripciones longitudinalmente HERV-H recientemente identificados se han depositado en dbEST con los números de acceso de JK017330-JK017415 y JK475044-JK475049 (con 7 números biblioteca de adhesión EST de LIBEST_027280 - 027286).
Apoyo a la Información
Figura S1.
alineaciones por parejas, para cada elemento HERV-H se llevaron a cabo con el consenso HERV-H construido por Jern P,
et al
. Los resultados de la alineación acortadas se muestran para indicar las regiones que faltan precisamente. la densidad del color representa el grado de homología con el consenso HERV-H. Las líneas representan regiones de los elementos HERV-H eliminan en comparación con el consenso HERV-H. rectángulos rojos indican las regiones donde se albergaban los ORF putativo, mientras que los rectángulos rojos con líneas gruesas indican ORFs con dominios conservados. Regiones del LTR, pre-gag,
gag
,
Pro Trial,
pol
y
env ¿Cuáles son marcados a continuación. locus genómico de cada elemento HERV-H se indica correspondientemente en el lado derecho
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029950.s001 gratis (TIF)
figura S2.
alineaciones por parejas, para cada elemento HERV-H se llevaron a cabo con el consenso HERV-H construido por Jern P,
et al
. Los resultados de la alineación acortadas se muestran para indicar las regiones que faltan precisamente. la densidad del color representa el grado de homología con el consenso HERV-H. Las líneas representan regiones de los elementos HERV-H eliminan en comparación con el consenso HERV-H. rectángulos rojos indican las regiones donde se albergaban los ORF putativo, mientras que los rectángulos rojos con líneas gruesas indican ORFs con dominios conservados. Regiones del LTR, pre-gag,
gag
,
Pro Trial,
pol
y
env ¿Cuáles son marcados a continuación. locus genómico de cada elemento HERV-H se indica correspondientemente en el lado derecho. El número de cada elemento se muestra a la izquierda, como se indica en la Tabla 2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0029950.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
La se agradece a la Sra Heather Simkin para la corrección del manuscrito.