Extracto
El ácido betulínico es un triterpeno pentacıclico que exhibe funciones contra el cáncer en las células cancerosas humanas. Este estudio proporciona evidencia de que el ácido betulínico es muy eficaz contra la línea celular de cáncer cervical humano HeLa mediante la inducción de apoptosis de la dosis y dependiente del tiempo. El proceso de apoptosis se investigó adicionalmente usando un enfoque de la proteómica para revelar la expresión de proteínas en células HeLa cambios después del tratamiento ácido betulínico. El análisis proteómico reveló que había seis arriba y treinta-regulado por proteínas en células HeLa inducida por ácido betulínico, y estas proteínas se sometieron a análisis de la vía funcional utilizando software de análisis múltiple. UDP-glucosa 6-deshidrogenasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa descarboxilar, cadena A Horf6-a nueva enzima peroxidasa humano que participa en el proceso redox, se encontró que se baja regulado durante el proceso de apoptosis de la vía de respuesta al estrés oxidativo. De acuerdo con nuestros resultados a nivel de proteína, se observó un aumento de las especies de oxígeno reactivo intracelular en las células tratadas con ácido betulínico. La proteína TIP47 y de cargos y la selección de proteínas reguladas por glucosa en proteínas, que están involucrados en la vía retículo endoplásmico, fueron reguladas por tratamiento con ácido betulínico. Mientras tanto, 14-3-3 proteínas de la familia, incluyendo 14-3-3β y 14-3-3ε, se redujeron reguladas en respuesta a tratamiento con ácido betulínico, lo que es consistente con la disminución de la expresión de la diana genes
14 -3-3β
y
14-3-3ε
. Por otra parte, se encontró que la antiapoptótico
Bcl-2
gen se había reducido regulado mientras que el proapoptótico
Bax
gen es regulada hasta después de tratamiento con ácido betulínico en células HeLa. Estos resultados sugieren que el ácido betulínico induce apoptosis de las células HeLa mediante la activación tanto de la vía retículo endoplásmico y la vía mitocondrial mediada por ROS
Visto:. Xu T, Pang Q, Zhou D, Zhang A, Luo S, Wang Y, et al. (2014) proteómico Investigación sobre la apoptosis inducida por ácido betulínico de células cervicales cáncer humano HeLa. PLoS ONE 9 (8): e105768. doi: 10.1371 /journal.pone.0105768
Editor: Daniela Hozbor Flavia, Universidad Nacional de La Plata, Argentina
Recibido: 18 de abril de 2014; Aceptado: July 26, 2014; Publicado: 22 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada financieramente por el Fondo de Investigación de la Industria Forestal Especial de Bienestar Público (201004069) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Central ( DL13EA02-03). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el ácido betulínico (3β-hidroxi-LUP-20 (29) -en-28-oico) (BA) es un triterpeno de tipo Lupane natural que se encuentra en la corteza de los árboles de abedul blanco. BA juega un papel crucial como fuente de compuestos potenciales contra el cáncer [1]. Los estudios in vitro han demostrado que este agente es potencialmente eficaz contra una amplia variedad de células cancerosas, incluyendo melanoma, leucemia, carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, carcinoma de próstata y mieloma múltiple [2] - [8], al mismo tiempo, BA y sus análogos podrían utilizarse como agentes terapéuticos potenciales para la infección por VIH-1 [9], [10]. Es bien sabido que las mitocondrias desempeñan un papel importante en la vía intrínseca de la apoptosis de mamíferos. Una disminución en el potencial transmembrana mitocondrial interna está asociada con el tratamiento con BA, lo que sugiere que la vía mitocondrial intrínseca está implicado en la apoptosis inducida por BA-. La vía mitocondrial es precedida por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y está regulado por la familia Bcl-2 de proteínas, que consiste en prosurvival (por ejemplo, Bcl-2, Bcl-XL y MCL-1) y proapoptótico (Bax , proteínas y Bad BH3-only) miembros [10], [11]. BA se ha demostrado que induce la apoptosis de una manera CD-95 y independiente de p53 por un efecto directo sobre las mitocondrias [4], [12], [13]. Formaciones de ROS y la proteína neosıntesis se han notificado a ser necesarios para la muerte celular inducida por BA [14], [15], [16]. Un estudio previo de la apoptosis por BA encontró que la vía mitocondrial fue inhibida por Bcl-2 /Bcl-xL sobreexpresión en células de mieloma múltiple humano [15], BA induce apoptosis principalmente a través de una vía mitocondrial con especificidad tumor.
el cáncer cervical es el tercer tipo más común de tumor en las mujeres [17]. Se usan varios tratamientos para el cáncer de cuello de útero, pero cada uno de ellos tiene efectos adversos graves. Por lo tanto, todavía es necesario encontrar un tratamiento más seguro y más eficiente. BA es una triterpenoides pentacíclicos de origen vegetal que es tóxico para las células cancerosas, pero no tiene efecto sobre las células no transformadas [1], [2], [8]. Se ha informado de que BA induce la actividad antiproliferativa sobre el cáncer de cuello de útero [18], pero los mecanismos moleculares de este proceso no se entiende completamente.
El objetivo principal del presente estudio es investigar los mecanismos moleculares subyacentes de la potenciales efectos anticancerígenos de BA en las células de cáncer cervical humano. perfiles proteoma mundial llevó a la identificación de varias vías que responden al tratamiento de BA y ayudaron a entender mejor los mecanismos relacionados con la apoptosis de BA. En este trabajo, que caracteriza el perfil de proteínas relacionadas con la apoptosis de las células HeLa tratadas con BA utilizando un enfoque de la proteómica comparativa 2-DE. Se discutirán las funciones moleculares y procesos biológicos implicados en el mecanismo de la apoptosis inducida por BA. Los cambios en la expresión de cuatro genes que codifican proteínas relacionadas con la apoptosis se analizaron mediante la realización de análisis de PCR en tiempo real (qRT-PCR).
Materiales y Métodos
Cultivo de células y ensayo de proliferación
BA fue adquirido de Boyle química CO., LTD (Shanghai, china). La línea celular de cáncer humano HeLa se adquirió en el Centro de Tumores (Pekín, China). Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) con 10% de SFB (PAA, Austria), penicilina 100 U /ml y 100 mg /ml de estreptomicina (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.). Las células se sembraron en 96 pocillos se incubaron las microplacas y luego a 37 ° C en 5% de CO
2. Después de 24 h, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco que contenía varias concentraciones de BA. A continuación, se añadió 30 l de 3 mg /ml de MTT (Amresco, EE.UU.) en PBS a cada pocillo, y después la placa se incubó adicionalmente durante 4 h. El sobrenadante restante se eliminó, y se añadió 150 ml de DMSO a cada pocillo y se mezcló a fondo para disolver los cristales de formazán que se formaron. Después de 10 minutos de incubación, la absorbancia de cada pocillo se leyó a 490 nm usando un lector de placas de ELISA BioTek-(BioTek Instruments, Winooski, EE.UU.). La concentración de BA inhibir el crecimiento celular en un 50% (valor de CI50) se calculó a partir de curvas de dosis-respuesta. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
Los cambios morfológicos
Para detectar los cambios morfológicos que se produjeron durante la apoptosis, la tinción nuclear se realizó con un 5 mg /ml Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO , EE.UU.), y las muestras de manchas se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon (ECLIPSE Ti-S, Nikon, Tokio, Japón) [19].
análisis de flujo de la apoptosis celular
citometría
BA apoptosis inducida fue observada por AnnexinV-FITC /PI tinción (Beyotime Biotech, Beijing, china) según las instrucciones del fabricante. La citometría de flujo (Partec citometría de flujo, Alemania) se utilizó para analizar las diferencias en la apoptosis entre el control y BA-tratado (15 mmol /L, 30 mmol /L y 50 mmol /L) en las células 48 h post-tratamiento. Las células se recogieron y se analizaron por recuento de las células normales, las células apoptóticas en etapa temprana, y células de la fase tardía de la apoptosis /necrosis en tres campos de visión del microscopio. La adquisición y análisis de datos se realizaron utilizando el software FloMax. Las células se procesaron tal como se describe en el protocolo del fabricante y se analizaron por triplicado.
Preparación
Proteína de 2-DE
células Hela tratados con 30 mmol /L BA se recogieron después de 48 h de incubación. Las células se lavaron dos veces con hielo frío PBS, después se extrajo con tampón de lisis que contiene 7 mol /L de urea, 2 mol /L de tiourea, 4% de CHAPS, 2% pH 3-10 /4-7 tampón IPG lineal (GE Healthcare, EE.UU. ), 20 mmol /L dithiothreilol (TDT, Sigma, EE.UU.), 40 mmol /l de Tris (Sigma, EE.UU.) y completa el mini cóctel de inhibidores de proteasa libre de EDTA (Roche, EE.UU.). Después de sonicating10 veces durante 30 s con 30 s pausas en un baño de hielo-agua y después de incubar a 4 ° C durante 1 h, los lisados celulares se centrifugaron a 14.000 rpm durante 1 hora a 4 ° C. Las proteínas en el sobrenadante resultante se cuantificaron de acuerdo con reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad de acuerdo con el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.) [19].
Two-dimensional electroforesis en gel de
Los lisados de proteínas de la célula (130 g) se mezclaron con solución de rehidratación que contiene 7 mol /L de urea, 2 mol /L tiourea, 2% CHAPS, tampón IPG 0,5% y 0,002% de azul de bromofenol y DTT a un volumen final de 450 mL. Precast 24-cm inmovilizado tiras de pH gradiente (IPG, pH 3-10, pH 4-7, GE Healthcare) fueron rehidratadas durante 12 horas a 30 V. La separación en una Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, Alemania) se realizó con el siguientes parámetros: 100 V durante 2 h, a 200 V durante 1 h, a 500 V durante 1 h a 1000 V durante 1 h y 8000 V durante 3 horas, seguido de un patrón de paso y retención de 8000 V durante 8 h. Después de enfocar isoeléctrico, las tiras se incubaron durante 15 min en solución de equilibrado I (6 mol /L de urea, 2% SDS, 30% de glicerol, 1% de DTT, 0,002% de azul de bromofenol, 50 mmol /L de Tris-HCl, pH 8,8) y durante otros 15 min en solución de equilibrado II (1% de DTT se reemplazó con 2,5% yodoacetamida). Posteriormente, las tiras de IPG fueron trasladados a la parte superior de los geles de poliacrilamida y se incluyeron utilizando 0,5% (w /v) de solución de agarosa que contiene azul de bromofenol. Two-dimensional SDS-PAGE se llevó a cabo a 25 ° C y 3,5 w /gel durante 30 min y luego 17,5 w /gel para 4 h 30 min hasta que el frente colorante azul de bromofenol llegó al fondo de los geles utilizando el Ettan DALT seis sistema (GE Healthcare). Los geles se fijaron en una mezcla de 40% de etanol y ácido acético glacial al 10% durante la noche. Las proteínas se visualizaron por tinción con plata, y gel de imágenes fueron adquiridas mediante un ImageScanner (GE Healthcare) con imagen principal 2D Platinum Software Version 7.0 (GE Healthcare). Con el fin de obtener resultados fiables a partir de 2-DE imágenes, anuncios fueron bien resueltos en los tres réplicas biológicas. Una medición se llevó a cabo para cada réplica biológica, y volúmenes normalizados fueron calculados usando el volumen total de punto de procedimiento de normalización del software. Se supuso que el volumen normalizado de cada punto para representar a su abundancia expresión. Sólo aquellos puntos que cambiaron de manera consistente y significativamente (más de 1,5 veces y
p Hotel & lt; 0,05). Se seleccionaron para el análisis de espectrometría de masas
La espectrometría de masas y la proteína de clasificación
péptido MS y MS /MS se realizaron en un 5800 MALDI-TOF /TOF espectrómetro de masas Plus ABI (Applied Biosystems, EE.UU.). Los datos fueron adquiridos en un reflector MS positivo utilizando un estándar de CalMix5 para calibrar el instrumento (ABI5800 calibración Mezcla). Tanto los datos de la MS y MS /MS se integraron y se procesan mediante el software V3.6 GPS Explorer (Applied Biosystems, EE.UU.) con los parámetros por defecto. Sobre la base de combinado MS y MS /MS espectros, las proteínas con éxito fueron identificados en base a 95% o mayor intervalo de confianza de sus puntuaciones en el motor MASCOTA V2.3search (Matrix Science Ltd., Reino Unido), utilizando los siguientes parámetros de búsqueda: NCBInr-humandatabase ; tripsina como la enzima de digestión; un sitio de escisión se perdió; modificaciones fijos de Carbamidomethyl (C); modificaciones parciales de acetilo (proteína N plazo), desamidada (NQ), Dioxidation (W), la oxidación (M); 100 ppm para la tolerancia ion precursor y 0,5 Da para la tolerancia de iones fragmento.
Basado en la clasificación PANTHER (versión 7.2, http://www.pantherdb.org/), la función molecular y el proceso biológico de los correspondientes identificado proteínas se clasifican [20]. La red de interacción proteína generada con CADENA (versión 9.05, http://string-db.org) reveló los vínculos funcionales entre las diferentes proteínas [21], [22].
Medición del estrés oxidativo
los niveles de ROS intracelular se determinó utilizando un kit de ensayo de ROS (Beyotime Biotech, china) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se recogieron después de 48 h de /L tratamiento BA 30 mol y después se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con DCFH-DA (10 mmol /L) a 37 ° C durante 40 min en un cuarto oscuro para el análisis final por citometría de flujo. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
El aislamiento de ARN y QRT-PCR análisis
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó usando un PrimeScriptTM transcriptasa inversa (Takara, Tokio, Japón), y las transcripciones se sometieron entonces a QRT-PCR usando un equipo de SYBR Green PCR Reactivos (Takara, Tokio, Japón). ensayos cuantitativos se realizaron por triplicado usando 1 l de cDNA (dilución 1:10) y una mezcla SYBR Green Master (Takara, Tokio, Japón) y se analizaron usando un sistema de detección de secuencias ABI 7500 (Applied Biosystems, EE.UU.). La amplificación de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control interno y para normalizar los datos. Los detalles de los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 1 [23].
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) de muestras por triplicado. El análisis estadístico se realizó con el software de estadísticas (SPSS versión 17.0). Los datos se analizaron utilizando el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de comparaciones múltiples de Bonferroni. Un valor de
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efecto de la BA en la proliferación y la apoptosis de las células HeLa
células
HeLa fueron. tratado con diferentes concentraciones (15 mmol /L, 30 mmol /L, 50 mmol /L) de BA durante 24 h, 48 h, y 72 h. La viabilidad de las células muestra una disminución general con concentraciones crecientes de BA en la duración media y tratamiento tal como se analizó mediante un ensayo MTT (Fig. 1A). Este resultado sugiere que BA inhibe la proliferación de las células HeLa de una manera dosis-y dependiente del tiempo. El IC
50 fue 30,42 ± 2,39 mM cuando las células HeLa fueron tratados con BA durante 48 h.
(A) Efecto de la BA hacia las células Hela según lo determinado por el ensayo MTT. Las células fueron tratadas con concentraciones de BA (0 mol /L, 15 mmol /L, 30 mmol /L, 50 mmol /L) durante el tiempo indicado (24 h, 48 h, 72 h). Los valores para cada concentración de BA probados representan la media de tres experimentos, Datas se presentan como media ± SD media; **
p
& lt; 0,01 comparado con el grupo control (0 mol /L BA). (B) Hoechst 33258-tinción de células HeLa tratado con 15 mmol /L, 30 mmol /L BA. Las flechas rojas indican varias células apoptóticas con la condensación de la cromatina típico.
Para determinar si la actividad antiproliferativa inducida por BA en células HeLa fue mediada por la inducción de la apoptosis, se evaluó la apoptosis mediante examen morfológico mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Después del tratamiento con 15 mmol /L y 30 mmol /L BA durante 48 h, las células HeLa se tiñeron con 5 mg /ml de Hoechst 33258 y se visualizaron mediante microscopía fluorescente. Se detectó la morfología típica de la apoptosis en las células HeLa tratadas con BA (Fig. 1B). Esto reveló que había un aumento significativo en el porcentaje de células apoptóticas después del tratamiento BA en comparación con las células de control. Además, BA causó apoptosis dependiente de la dosis como se indica por AnnexinV-FITC /PI usando citometría de flujo. El porcentaje total de células apoptóticas fue 20,53 ± 0,81% (13,45 ± 0,80% de las células temprana de apoptosis y 7,07 ± 0,51% de las células finales de apoptosis) y 38,56 ± 1,79% (30,92 ± 1,22% de las células temprana de apoptosis y 7,64 ± 0,53% de células apoptóticas tarde) para las células tratadas con 30 mmol /L y 50 mmol /L de BA a las 48 h, respectivamente (como se muestra en la Fig. S1).
2-dE análisis de las diferencias en la expresión de proteínas inducidos por BA
la proteómica es una poderosa plataforma para la investigación de la expresión de proteínas y la modificación en respuesta a las condiciones fisiológicas específicas en los sistemas biológicos. Los proteomas de Control y células HeLa tratadas con BA /L 30 mu mol fueron analizados por 2-DE. Dos de rango gradiente de tiras IPG (pH 3-10 y 4-7) fueron utilizados como la primera dimensión. Representativos patrones de proteínas 2-DE en la región pI de 3 a 10 mostraron que las proteínas se centraron principalmente en el intervalo de pH 4,2 a 7,0 (Fig. 2A). Para separar aún más esta muestra, se utilizaron de rango estrecho gradientes de pH (4-7) (Fig. 2B), lo que nos permite aumentar tanto la carga de proteínas en los geles y la resolución de las proteínas en ese rango. Las manchas de proteínas con alteraciones más de 1,5 veces (
p Hotel & lt; 0,05) y luego se sometieron a la identificación de proteínas por MALDI TOF /TOF-MS análisis (Tabla S1). geles a base de IPG Un total de 18 puntos de proteínas a partir de la amplia gama 2D (pH 3-10) y 19 puntos de proteínas a partir de geles 2D basados en IPG rango más estrecho de pH (4-7) mostraron cambios reproducibles y estadísticamente significativas en las muestras tratadas con BA en comparación con las muestras de control (Fig. 2). Las proteínas de todas las manchas de proteínas se identificaron con éxito por búsquedas de bases de datos MS y la mascota con el alto grado de confianza (Tabla 2). perfiles de proteínas (pH 3-10) reveló 5 proteínas hasta reguladas y 13 proteínas reguladas por BA en las células tratadas. Además, perfiles de proteínas (pH 4-7) reveló 1 hasta reguladas proteínas y 18 proteínas reguladas por BA en las células tratadas. Inesperadamente, sólo había 1 proteína (gi4826760) en la superposición entre el pH 3-10 geles (Spot NO. 868) y pH 4-7 (Spot NO. 626).
(A) 2-DE se realizó con 130 g de proteína usando 24-cm pH 3-10 tiras IPG NL y 12,5% de SDS-PAGE. (B) 2-DE se realizó con 130 g de proteína usando 24-cm pH 4-7 tiras NL IPG y 15% de SDS-PAGE. Los geles se visualizaron por tinción con plata y se analizaron con el software de imagen principal.
categorías funcionales de proteínas expresadas diferencialmente
Para clasificar mejor las proteínas identificadas, dos categorías independientes de gen ontologías se utilizaron para describir la función de los productos génicos: la función molecular y procesos biológicos, como se identifica por el sistema de clasificación PANTHER. Debido a EEF (gi530425157, SPOT 932) se determinó que era el mismo que eEF2 (gi4503483, detectar 673) y GLOD4 (gi4929769, SPOT 146) no fue identificado por el sistema de clasificación de la PANTERA, 34 proteínas modificadas fueron analizados por el software. Las proteínas identificadas se clasifican en 9 grupos sobre la base de los procesos biológicos: los procesos metabólicos (31,90%), los procesos celulares (19.10%), la organización del componente celular o la biogénesis (14,90%), los procesos de desarrollo (10,60%), localización (10,60%), regulación biológica (4,30%), la respuesta al estímulo (4,30%), los procesos de organismal multicelulares (2,10%) y los procesos del sistema inmunitario (2,10%) (Fig. 3A). tratamiento BA inhibe el plegamiento de proteínas (spot 81, 655, 1109, 613, 981), que es importante para la biosíntesis de proteínas. Además, la glucólisis (manchar 372), traducción (punto 673, 885) y empalme de ARNm (local 868) están involucrados en los procesos metabólicos y se redujeron regulado por BA-tratamiento. BA suprime procesos más biológicos para bloquear procesos normales del metabolismo, tales como los procesos celulares (mancha 361, 128, 1087, 970, 823, 991, 842), los procesos de desarrollo (mancha 361, 128, 1087, 970), localización (detectar 120, 970, 991), las respuestas a los estímulos (punto 81), procesos multicelulares organismal (punto 81), y los procesos del sistema inmune (punto 81). De hecho, algunas proteínas están involucradas en múltiples procesos biológicos, y las proteínas que estaban involucrados en los procesos celulares también contribuyeron a la organización de los componentes celulares (punto 361, 128, 1087, 970). De acuerdo con su función molecular, las proteínas moduladas se clasificaron en 5 grupos: actividad catalítica (36,00%), la actividad molécula estructural (32,00%), la unión (20,00%), regulador de la actividad de traducción (8,00%), y la actividad antioxidante (4,00% ) (Fig. 3B). En la categoría de actividad catalítica, la proteína disulfuro isomerasa actividad (local 655, 1109) y la actividad oxidorreductasa (local 542, 526, 1120, que están en la cadena de transporte electrónico mitocondrial) fueron inhibidos por el tratamiento de BA. Al mismo tiempo, la actividad antioxidante (detectar 542) también se redujo mediante el tratamiento BA. Además, la mayoría de las proteínas implicadas en la actividad de la molécula estructural (punto 81, 361, 1085, 1087, 970), de unión (local 128, 573, 868) y el regulador de la actividad de traducción (SPOT 673, 885) se redujeron significativamente en BA trataron células HeLa .
sobre la base de la clasificación PANTHER y el gen de la categoría, proceso biológico (a) y la función molecular (B) de las correspondientes proteínas identificadas se clasifican.
se generó una red de interacción de proteínas por cadena, que ofrece una mejora en el análisis funcional (Fig. 4). La red de interacción de proteínas proporciona una plataforma para el análisis de las funciones de las proteínas identificadas ', interacciones proteína-proteína, vías biológicas y moleculares funciones. En consecuencia, se generaron cuatro redes principales: (1) la vía de señalización de neurotrofinas, (2) la depresión a largo plazo, (3) la miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho, y (4) la vía de señalización VEGF. Map2k2 (punto 942), ywhab (detectar 823) y ywhae (detectar 842) fueron las proteínas centrales de las redes que interactúan, y sus niveles se redujeron mediante tratamiento BA, que puede jugar un papel importante en la vía de señalización de neurotrofina. De las proteínas identificadas, las proteínas 14-3-3 están involucrados en muchas vías fisiológicas, y estas proteínas han demostrado ser responsables del crecimiento y la capacidad de apoptosis de muchos tumores malignos.
Las proteínas modificadas de proteómica el análisis se ha subido a la cadena instrumento para identificar las redes de señalización funcionales. Los enlaces funcionales previstos consisten en hasta ocho líneas:. Un color para cada tipo de pruebas
generación de ROS en células HeLa tratadas con BA
ROS juegan un papel importante en la inducción de la apoptosis ya que está involucrado en permeabilización de la membrana mitocondrial y la inducción de muerte celular. De acuerdo con el perfil de proteínas de las células Ba-tratada, UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (SPOT 526), 6-fosfogluconato deshidrogenasa (spot 1120) y la enzima peroxidasa (detectar 542) estaban implicados en el proceso biológico de la respuesta al estrés oxidasa, que se correlaciona con la apoptosis inducida por BA-de las células HeLa. El nivel de la producción de ROS se detectó después del tratamiento de las células HeLa con BA (15 mmol /L, 30 mmol /L) durante 48 h. El nivel de ROS en las células tratadas con BA aumentó significativamente. El nivel de ROS en células Ba-tratado fue de 9,28 veces y 12,77 veces mayor que el nivel de ROS en células de control para los tratamientos de 15 mmol /L y 30 mmol /L, respectivamente, y se observó una tendencia-up regulados en toda el experimento (Fig. 5). Estos resultados sugieren que BA induce la apoptosis a través de la activación de los mecanismos de muerte celular mediada por ROS en células HeLa.
células HeLa se trataron con 15 mmol /L, 30 mmol /L BA durante 48 h y después se incubaron con 10 mmol /L DCFH-DA para 40 min. La intensidad fluorescente de DCFH se midió por citometría de flujo. (A) los espectros reales de un solo experimento representativo. (B) La intensidad de fluorescencia de las células teñidas se determinó por citometría de flujo. Columnas muestran los valores medios de tres experimentos (± SD). **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con el grupo control (0 mmol /L de BA) guía empresas
QRT-PCR análisis de genes implicados en la apoptosis inducida por BA-celular
.
Debido a 14-3-3 proteínas están implicadas en muchas vías fisiológicas, incluyendo el crecimiento y la apoptosis, se seleccionaron los cambios de expresión de los dos genes que codifican la identificada 14-3-3 familia de proteínas para su posterior análisis mediante qRT-PCR. La regulación a la baja de los dos genes seleccionados (
14-3-3β
y
14-3-3ε
) a nivel de la transcripción fue consistente con los datos de 2-DE. Los niveles de expresión de
14-3-3β
y
14-3-3ε
fueron significativamente las reguladas por el tratamiento de BA. Los genes
Bcl-2 y
Bax
fueron investigados para explorar aún más las funciones de acumulación de ROS en la apoptosis inducida por BA-debido a que la vía mitocondrial está regulada por prosupervivencia Bcl-2 y Bax proapoptóticos. El nivel de expresión de
se observó Bcl-2
sea significativamente más bajo que el nivel de control. Por el contrario, la expresión de proapoptótico
Bax
se incrementó significativamente en comparación con los controles de QRT-PCR (Fig. 6).
Las células HeLa fueron tratados con 30 mmol /L de BA durante 24 h y luego el ARN total se aisló usando un reactivo Trizol. Columnas muestran los valores medios de tres experimentos (± SD). *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,01 en comparación con el grupo control (0 mmol /L) guía empresas
Discusión
BA, una triterpenoides pentacíclicos de origen natural con el potencial de matar células de melanoma [1], se ha demostrado que induce la apoptosis en muchas líneas celulares de cáncer [2] - [8]. BA se ha informado de que carece de efectos citotóxicos contra las células sanas. Las células normales, como los fibroblastos dérmicos, linfoblastos de sangre periférica [2], [14] melanocitos y astrocitos humanos [15], se han mostrado resistentes al tratamiento BA in vitro. Varios estudios han proporcionado mayor conocimiento de la citotoxicidad inducida por BA. BA también suprimió el crecimiento del tumor in vivo en un número de estudios con animales. En un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de ovario administración de BA aumentado de manera significativa el tiempo de supervivencia [25]. Schettino, M T se aprovechó de BA en el tratamiento del virus del papiloma humano que se considera necesario para el desarrollo de cáncer de cuello uterino, los resultados sugieren BA puede ser una de fármacos prometedores para tratar el cáncer de cuello de útero [26]. El objetivo del presente estudio fue dilucidar el mecanismo molecular (s) de los efectos apoptóticos de BA en una línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa) y para investigar los efectos de BA en el crecimiento de las células HeLa.
para determinar la concentración apropiada de BA para los experimentos proteómicos, las células HeLa se trataron con una serie de concentraciones de BA durante 24 h, 48 h y 72 h, y a continuación, la viabilidad celular se midió mediante un ensayo de MTT y la tasa de apoptosis se analizó por el flujo de citometría. El resultado reveló la BA inhibe la proliferación de las células HeLa de una manera dosis-y dependiente del tiempo, y el CI
50 era 25,93 ± 1,87 M durante 72 h, que era consistente con el IC
50 (26,0 ± 2,1 M) de Rita C probó células HeLa expuestas al tratamiento BA durante 72 h [24]. se observaron inhibición significativa del crecimiento y la apoptosis de células cuando las células fueron expuestas a 30 mol /L BA durante 48 h. Para cumplir con una norma que la apoptosis celular se debe inducir células vivas, pero también suficientes debe mantenerse para la extracción de proteínas y estudio proteómico, 30 mmol /L de BA fue elegido para el tratamiento de las células HeLa.
Proteómica ofrece un método para la identificación de proteínas que median en las vías de apoptosis en las células tratadas con agentes quimioterapéuticos [27] - [29]. Debido a que el mecanismo molecular implicado en la inducción de la inhibición de la proliferación y la apoptosis por BA todavía no está claro, se implementó un esquema de proteómica globalmente búsqueda de proteínas expresadas diferencialmente en células HeLa afectadas por BA. La mayoría de las proteínas (30 puntos) se redujeron y pocas proteínas (6 puntos) fueron mejorados por el tratamiento de BA. análisis categoría funcional sugiere que las alteraciones en la expresión de proteínas después del tratamiento BA están asociados con diferentes procesos biológicos y funciones moleculares. Estos resultados sugieren que la apoptosis inducida por BA-de células HeLa se basa principalmente en la inhibición de las proteínas implicadas en la síntesis y el metabolismo.
Entre las proteínas relacionadas con los procesos metabólicos de quince, dos de las proteínas hasta reguladas (HSPA5, Spot 613 y PLIN3, detectar 248) están implicados en la vía de retículo endoplásmico (ER), que está implicado en las respuestas apoptóticas complejos. La respuesta de estrés ER puede promover la reparación celular y la supervivencia sostenida mediante la reducción de la carga de proteínas desplegadas a través de la atenuación global de la síntesis de proteínas o la regulación de chaperones, enzimas y componentes estructurales de la sala de emergencia [30]. Aunque el mecanismo todavía no está claro, cuando el estrés ER es abrumadora, las células sufren apoptosis [31]. La proteína regulada por glucosa HSPA5 (manchar 613), que es una chaperona ER-residente, responde a la vía de ER a través de una red de reguladores y mecanismos novedosos que conducen a la detención del crecimiento [32]. La carga, incluido PLIN3 (manchar 248), se transloca en la sala de emergencia y luego se incorpora a los pequeños transportistas vesiculares que median el transporte a los compartimentos de Golgi [33]. Otra proteína hasta reguladas es IL18 (punto 27), una nueva citoquina pro-inflamatoria que induce la expresión del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) y el ligando de Fas, así como la translocación nuclear del factor nuclear kB (NF-kB) [ ,,,0],34], [35]. NF-kappa B es un regulador clave de la activación transcripcional inducida por el estrés, y BA También se ha informado que inhiben la activación inflamatoria de NF-kappa B [36]. En el presente trabajo, se detectó la expresión de proteínas hasta reguladas, lo que puede mediar en el proceso de ER BA en células HeLa.
Dos-regulado por proteínas de actividad antioxidante, UGDH (local 526) y el DGP (punto 1120) , catalizar la oxidación de alcoholes C6 en ácidos carboxílicos en dos NAD sucesiva
+ - pasos dependientes sin la liberación de un aldehído intermedio, y estas proteínas son muy importantes para la cadena de transferencia de electrones en la mitocondria [37], [38]. Además, la actividad de la proteína antioxidante PRDX6 (local 542) puede proporcionar protección contra el estrés y reparación nitroxidative moléculas dañadas por oxidación, y esta proteína juega un papel importante en la basura ROS en condiciones fisiológicas [39]. Al mismo tiempo, el nivel de la producción de ROS detectado por citometría de flujo se incrementó después del tratamiento de células HeLa con BA, y este resultado está de acuerdo con los resultados de los ensayos de actividad oxidorreductasa anteriores y puede ayudar a explicar los efectos apoptóticos de BA. Estos resultados indican que la vía de las mitocondrias se activó por BA, que luego se indujo la apoptosis de las células HeLa. El estrés oxidativo ha sido conocido por ser un mediador de la apoptosis inducida por una variedad de factores desencadenantes, y las mitocondrias son considerados como sensores de daño oxidativo y puede desempeñar un papel importante en la apoptosis [40], [41]. La familia Bcl-2 de proteínas puede regular la vía de las mitocondrias mediante la alteración de la membrana mitocondrial permeabilización [42]. Antiapoptótico Bcl-2 y proapoptótico Bax son muy importantes para mediar en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y mitocondrial vía de la apoptosis [43]. Se encontró que el tratamiento BA suprimió la expresión de
Bcl-2
transcripciones, facilitó la expresión de
Bax fotos: por QRT-PCR.