Extracto
Antecedentes
Los modelos preclínicos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) requieren una mejor relevancia clínica para estudiar mecanismos de la enfermedad y las terapias innovadoras. Hemos tratado de comparar y refinar bioluminiscentes modelos de ratón ortotópico de NSCLC humano localizadas.
Métodos
atímicos
nude
ratones se sometieron a inyección subcutánea (grupo 1-SC, n = 15, control), inyección ortotópica percutánea (grupo 2-POI, n = 30), la implantación quirúrgica ortotópico de tumores que crecen por vía subcutánea (grupo 3-SOI, n = 25), o la inyección ortotópica transpleural (grupo 4-TOI, n = 30) de células A549-luciferasa. Bioluminiscente
in vivo
de imágenes se realiza entonces semanal. Las células tumorales circulantes (CTC) se realizaron búsquedas utilizando el sistema Cellsearch® en los modelos SC y TOI.
Resultados
El grupo 2-PDI se asoció con pleural directa inesperada extensión de la solución celular en el 53% de los casos, prohibiendo la evaluación adicional de cualquier tumor pulmonar localizada. El grupo 3-SOI se caracteriza por una alta mortalidad perioperatoria, los tumores de pulmón inicialmente localizadas, y la evolución local. Grupo 4-TOI se asoció con una baja mortalidad perioperatoria, los tumores de pulmón inicialmente localizadas, extensión regional loco, y metástasis a distancia. Se detectaron CTC en el 83% de los
ratones desnudos portadores de tumores de NSCLC subcutáneas o ortotópico.
Conclusiones
transpleural inyección ortotópico de células A549-luc en
nude
pulmón de ratón induce tumor localizado, seguido de la extensión linfática y la mortalidad específica, y permitió que la primera identificación momento de CTC en un modelo de ratones NSCLC
Visto:. P mordiente, Loriot y, Lahon B, Castier y, Lesèche G, Soria JC, et al. (2011) Modelos de ratón ortotópico de bioluminiscente localizado humano de células no pequeñas Cáncer de pulmón: Viabilidad e identificación de las células circulantes tumorales. PLoS ONE 6 (10): e26073. doi: 10.1371 /journal.pone.0026073
Editor: Wafik S. El-Deiry, Instituto de Cáncer de Penn State Hershey, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Junio, 2011; Aceptado: 19 de septiembre de 2011; Publicado: 11 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 mordiente y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. PM tiene recibido el apoyo de la Sociedad francesa de Cirugía Torácica (SFCTCV). BL ha sido apoyado por la Fundación Francesa de Investigación Médica (FRM) y el tórax Generación. Este proyecto ha sido apoyado por la Asociación Francesa de Investigación del Cáncer (ARC a MCV y ED) y la Fundación Gustave Roussy (Fondation Gustave Roussy a MCV y ED). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. A pesar de numerosos ensayos clínicos de fármacos preclínicos prometedores, ningún brote importante se ha hecho en la gestión de NSCLC en las últimas décadas. A pesar de que existe una fuerte medicina basada en la evidencia que apoya el uso clínico de la citotóxico, alrededor de 3 tipos de agentes han demostrado una eficacia constante pero limitado (platino, taxanos, gemcitabina). Más recientemente, las terapias dirigidas han renunciado a la esperanza importantes dada su capacidad para golpear directamente los mecanismos de supervivencia de células de cáncer específicas. En agudo contraste con la robustez de la traslación subyacente biológica racional, clínica de estos conocimientos en beneficio clínico sigue siendo difícil ya que las terapias dirigidas sólo mostraron un beneficio de supervivencia marginal al considerar el conjunto de la población pacientes NSCLC [1] - [4]. Después de estos primeros ensayos, análisis moleculares retrospectivos de tejido tumoral condujo a la definición de los subgrupos de pacientes que responden favorablemente a tratamientos de investigación, con la administración de ciertos tipos de cáncer revolucionable [5]. Entre los pacientes con CPCNP que reciben erlotinib, la presencia de una mutación de EGFR incrementa la capacidad de respuesta al agente [6], [7], pero en cuestión sólo el 16% de los pacientes [8]. Más recientemente, la inhibición de la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) se ha reportado que resultar en la reducción del tumor o enfermedad estable en la mayoría de los pacientes con NSCLC que alberga genes de fusión EML4-ALK, pero que se trate sólo del 2 al 7% de NSCLC [9]. Sin embargo, mientras tanto, considerables esfuerzos se han gastado en tratamientos activos de pruebas de ensayos clínicos en tumores resistentes [2], [3], [10] - [12]
La discrepancia entre los valores de la clínica. razón de ser, la cantidad de datos preclínicos en una mano y el bajo gasto de su transferencia en los ensayos clínicos sugieren que la relevancia de los modelos preclínicos puede ser cuestionada. Sobre todo, los ensayos preclínicos debería tener un efecto positivo más tajante frente al valor predictivo negativo [13]. Actual en modelos preclínicos in vivo no reflejan las etapas de la progresión maligna del tejido normal a la lesión precancerosa y luego con el cáncer (localizada y luego metastásico). modelo ideal debe imitar la historia natural del cáncer humano, con el fin de mejorar nuestra comprensión de la patogénesis del cáncer, predecir la eficacia del tratamiento investigado e identificar qué tratamiento se ajuste a la que el paciente antes del diseño de ensayos clínicos. En este contexto, los modelos de xenoinjertos siguen siendo la piedra angular de los experimentos preclínicos y que se beneficiarán de las mejoras técnicas, junto con el reciente desarrollo de diseño asistido por computadora de drogas, modelado por ordenador, y animales genéticamente modificados [14]. xenoinjertos de NSCLC humanos pueden ser implantados en animales inmunodeficientes, ya sea por vía subcutánea (SC) o ortotópicamente. En un lado, xenoinjertos de SC de cáncer de pulmón son fáciles de realizar y de seguir, pero carecen de relevancia con respecto a (i) la historia natural del cáncer debido a la ausencia de linfático o la extensión metastásica, y (ii) la predicción de la eficacia del fármaco en los ensayos clínicos como lo demuestra la alta proporción de ensayos clínicos negativos [13]. En el otro lado, los modelos ortotópico de cáncer de pulmón son técnicamente más difíciles, no siempre imitar la historia natural del cáncer de pulmón, pero plantear grandes esperanzas con respecto a la detección de drogas [15]. El reciente aumento de nuestra comprensión de la diafonía del estroma del tumor [16] - [18] y su participación en la resistencia a los medicamentos, la metástasis, escape inmune, angiogénesis sugiere fuertemente que los modelos ortotópico deben proporcionar información valiosa que no se podía obtener de sub modelos -cutaneous.
Teniendo en cuenta los tumores torácicos, el desafío técnico es crecer "células tumorales de pulmón en el pecho". Varias técnicas se pueden utilizar para este objetivo, incluyendo la administración intra traqueal [19] o la inyección percutánea ortotópico [20] de células de NSCLC en solución, y la implantación ortotópica quirúrgica del tumor por vía subcutánea crecido procedente de la línea celular de NSCLC [21]. La administración intratraqueal se asocia con inicial difusa propagación de las células a ambos pulmones, lo que interfiere con la progresión y el proceso de metástasis de pulmón, por lo tanto favorecer modelos percutánea y quirúrgica. Sin embargo, la viabilidad técnica y la historia natural de estos dos modelos nunca han sido comparados. Este estudio fue comparar y refinar estos dos modelos de xenoinjertos ortotópico de cáncer de pulmón, con el objetivo final de reproducir la progresión de NSCLC humano, de un tumor localizado inicialmente intraparenquimatosa, con el desarrollo de metástasis y el empeoramiento general. Para este propósito, se compararon cuatro modelos xenoinjertos, incluyendo la inyección SC utilizado como control, inyección ortotópica percutánea e implantación ortotópica quirúrgico tal como se describe anteriormente, y la inyección ortotópica transpleural como un nuevo modelo. Para permitir que siga longitudinal de la progresión tumoral y posterior evaluación de la eficacia del tratamiento, se utilizó una línea de células transfectadas con luciferasa y se realizó un
in vivo
bioluminiscente de imágenes. Viabilidad se evaluó mediante la mortalidad perioperatoria y la proporción de injertos. relevancia clínica se evaluó mediante la ubicación inicial dentro del parénquima, la extensión locorregional, la extensión metastásica, la supervivencia media y el aspecto histológico. En un análisis exploratorio, la identificación de células tumorales circulantes (CTC) se llevó a cabo utilizando el ensayo Cellsearch® (Veridex LLC, EE.UU.).
Materiales y Métodos
Línea celular
línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 humano transfectadas de forma estable con luciferasa (A549luc) se adquirió de células Caliper Lifesciences Corp. se cultivaron en medio completo, que consiste en 10% de suero (v /v) fetal bovino, 2 mmol L-glutamina, y 50 unidades /ml de penicilina-estreptomicina en medio RPMI (todos de Invitrogen). Las células se cultivaron a 37 ° C y 5% CO2 en un incubador, probado como micoplasma libre utilizando un kit de detección de Mycoplasma PCR (MycoProbe, R & amp; D Systems, MN, EE.UU.), y se ensayaron como luciferasa positiva utilizando la aplicación directa de 2 ml de una solución de 150 mg /ml de luciferina (luciferina de luciérnaga, Caliper Lifescience Corp, EE.UU.), seguido de la formación de imágenes inmediata bioluminiscente (sistema de IVIS, Caliper Lifescience Corp, la figura 1a).
a. células A549 transfectadas de forma estable con luciferasa se ensayaron por aplicación directa de suero salino (lado izquierdo, control) o luciferina (lado derecho), y se analizaron después de formación de imágenes ópticas (Tiempo 1 min después de la adición de luciferina, la exposición 1 min, medio bin). segundo. Los animales se dividieron en 4 grupos, inyección subcutánea (grupo 1-SC), inyección ortotópica percutánea bajo control radiológico (grupo 2-POI), la implantación ortotópica quirúrgico después de la intubación orotraqueal y enfoque toracotomía (grupo 3-SOI), y la inyección ortotópica transpleural después de la exposición quirúrgica capa costal (grupo 4-TOI).
Animales
Seis semanas de edad, los ratones atímicos hembras fueron adquiridos de Janvier (Elevage Janvier, Mayenne, Francia), y se mantiene en condiciones adecuadas. Una vez en nuestra instalación de animales, los ratones se dividieron en 4 grupos, se les implantó un xenoinjertos siguiendo los protocolos descritos a continuación (Figura 1b), y la posterior formación de imágenes bioluminiscentes. Por la tasa de mortalidad procedimiento, tipo de injerto, se determinaron locorregional y la progresión metastásica. El final del experimento se definió como la caquexia, disnea o empeoramiento clínico. Los animales fueron sacrificados humanamente. del tumor primario, los pulmones y los ganglios linfáticos del mediastino se cosecharon quirúrgicamente, fija usando un concentrado basado en agua libre de formalina (Finefix, Milestone S.r.l., Sorisole, Italia), y embebidos en parafina. Seguidamente se realizó un examen histológico. Se evaluó la mortalidad relacionada con el cáncer. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética local (CEEA IRCIV /IGR n ° 26, inscrita en el Ministerio Francés de Investigación), y estaban en conformidad con la Directiva Europea 86/609 /CEE y las leyes y reglamentos franceses.
subcutánea (SC) de inyección (grupo 1 - SC)
Una solución de 3 × 10
6 A549luc células en 200 l de medio de cultivo se inyectaron por vía subcutánea en la región del flanco izquierdo de los animales ( n = 15), el uso de 1-ml jeringas de tuberculina con 30 agujas hipodérmicas G (Becton Dickinson, NJ, EE.UU.) guía
percutánea inyección ortotópico (grupo 2 -. POI)
Los animales (n = 30) se anestesiaron con isoflurano y putts en una posición de decúbito dorsal. Bajo control radiológico, 3 × 10
6 A549luc células en una solución que contiene 30 l de medio de cultivo, 10 l de medio de contraste (Omnipaque 300, GE Healthcare SA, Francia), y 10 l de sarcoma de ratón de la matriz extracelular (Matrigel, BD Biosciences, NJ, EE.UU.) se inyectaron por vía percutánea en el pulmón izquierdo de los animales utilizando de 1 mL jeringas de tuberculina con 30 agujas hipodérmicas G (Becton Dickinson, NJ, EE.UU.). Los ratones fueron luego permitir a descansar sobre una alfombra de calentamiento hasta que recupere totalmente
quirúrgica de implantación ortotópico (grupo 3 - SOI).
Como primer paso, las células 3 × 10
6 eran A549luc inyectada por vía subcutánea en la región del flanco de 3 animales donantes. Una vez que los tumores alcanzaron SC 50 mm3, los tumores se cosecharon y se subdividen en 1 mm
3 piezas que constituyen los injertos tumorales. animales receptores (n = 25) fueron anestesiados usando inyección intraperitoneal de xilazina (20 mg /kg) y ketamina (100 mg /kg), intubado con un catéter iv 22 G, ventilado mecánicamente (volumen sistólico 200 mu L, la tasa de respiración = 120 golpes /min, Ventilador MINIVENT Tipo 845, Harvard Apparatus, MA, EE.UU.) y putts en una posición de decúbito lateral derecho. Una incisión en la piel de 2 cm fue hecho por debajo de la escápula izquierda y una disección cortante de los músculos del pecho se realizó, con el fin de exponer la capa costal. Un 0,5 cm intercostales incisión entre el tercer y cuarto Costa sobre la pared torácica se hizo, y se abrió la pared torácica. El pulmón izquierdo estaba ocupado por un fórceps, sujetar con una abrazadera de la carótida (Scanlan Internacional, MN, EE.UU.), una incisión con un cuchillo quirúrgico, y el tumor se introdujo rápidamente en el parénquima pulmonar. La incisión de la parénquima pulmonar se cerró con pegamento quirúrgico (Bioglue, Gamida, Francia). La incisión de la pared torácica se cerró con una sutura de polipropileno 4-0 (Prolene, Ethicon Inc., EE.UU.). a continuación, los ratones se les permite descansar sobre una alfombra de calentamiento hasta que recupere totalmente
transpleural inyección ortotópico (grupo 4 - TOI).
Los animales (n = 30) fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de xilazina (20 mg /kg) y ketamina (100 mg /kg), y putts en una posición de decúbito lateral derecho. Una incisión en la piel de 2 cm se realizó debajo de la escápula izquierda, y se realizó una disección cortante de los músculos del pecho, con el fin de exponer la capa costal. Al observar el movimiento pulmón izquierdo a través de la pleura, 3 × 10
se inyectó directamente 6 A549luc células en una solución que contiene 10 l de medio de cultivo, y 10 l de sarcoma de ratón de la matriz extracelular (Matrigel, BD Biosciences, NJ, EE.UU.) a través del espacio intercostal en el pulmón a una profundidad de 3 mm utilizando una aguja de 29 G unida permanentemente a una jeringa ml 0,5 insulina (Becton Dickinson, NJ, EE.UU.). La incisión de la piel se cerró con una sutura 4-0 de polipropileno (Prolene, Ethicon Inc, EE.UU.). Los ratones fueron luego permitir a descansar sobre una alfombra de calentamiento hasta que recupere totalmente.
Bioluminiscente de imágenes
Bioluminiscente de imágenes se detectó a partir de luciferasa que expresan las células A549 (A549luc) después de la implantación de los xenoinjertos en ratones. Luciferina (luciferina de luciérnaga, Caliper Lifescience Corp, EE.UU.) se utilizó como el sustrato para la luciferasa de células tumorales que expresan y se inyecta por vía intraperitoneal a una concentración de 150 mg /kg en PBS, 15 minutos antes de la formación de imágenes. Ratones fueron anestesiados utilizando 2% de isofluorano y la imagen utilizando una cámara CCD enfriada (sistema IVIS, Caliper Lifesciences Corp, EE.UU.). Los tiempos de exposición variaron de 1 minuto a 1 segundo. Las imágenes fueron cuantificados como fotones /s utilizando el software de imagen viva (Caliper Lifesciences Corp, EE.UU.). bioluminiscente de imágenes se realizó en el día uno, y luego semanalmente, e inmediatamente antes del sacrificio. tasa de implantación de xenoinjerto se definió como el número de tumor primario en formación de imágenes 2 semanas después del injerto dividido por el número de animales vivos después del procedimiento. de extensión locorregional posterior, linfáticos y metástasis hematógena tasas se determinaron durante un 2 meses de seguimiento, y confirmado por el examen patológico al final de los experimentos.
Identificación de las CTC
Para caracterizar mejor SC y los modelos de inyección de transpleurales, hemos tratado de identificar las CTC en estos modelos, utilizando 2 grupos adicionales. En el grupo de CTC 1, atímicos
nude
ratones se sometieron a inyección SC de células A549luc en ambos flancos (n = 6). En el grupo 2 CTC, animales se sometieron a anestesia general, la incisión de la pared torácica, y la inyección transpleural de las células en el parénquima del pulmón izquierdo (n = 15). Después de 2 semanas, se realizó bioluminiscente de imágenes, y se identificaron los animales portadores de tumores. Durante la tercera semana, 6 animales portadores de tumor de cada grupo se eligieron y se anestesiaron azar. Una punción de sangre venosa de 600 l se realizó en el seno cavernoso y se ensayó para CTC usando el sistema de CellSearch® y un protocolo modificado basado en el kit de la célula epitelial CellSearch® (Veridex LLC, EE.UU.). En pocas palabras, para identificar CTC humanos en sangre de ratón, cada uno de 600 muestras de sangre de ratones l se mezclaron con 7 ml de sangre humana sana. A continuación, cada muestra fue automatizado enriquecida para las células que expresan la molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM) con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo, y las células se marcaron con el colorante fluorescente de ácido nucleico 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) . Se utilizaron anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia específicos para leucocitos (CD45-allophycocyan) y células epiteliales (citoqueratina 8,18,19-ficoeritrina) para distinguir las células epiteliales a partir de leucocitos. Cell Enriquecimiento y etiquetado se realizaron utilizando el CellSearch® Autoprep. La identificación y enumeración de las CTC se ha realizado mediante la CellSearch® Analyzer II. CTC se definieron como células nucleadas que carecen de CD45 y que expresan citoqueratina 8, 18, 19. Como control negativo, se analizó una solución que contiene 600 l de sangre de ratón del cojinete no tumoral y sangre humana sana. Como control positivo, se analizaron 50 y 500 células A549luc en una solución que contiene 600 l de medio y 7 ml de sangre humana sana.
El análisis estadístico
variables continuas con distribución normal se expresan como media ± desviación estándar, y se compararon con prueba t no pareada. Los datos categóricos se expresaron como recuentos y proporciones, y se compararon con la prueba exacta de Fisher. Todas las pruebas fueron de 2 caras y un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo. Todos los análisis de datos se realizaron con el software libre R (http://www.r-project.org, R Fundación para la Computación de Estadística, Viena, Austria).
Resultados
Viabilidad
viabilidad se evaluó mediante la determinación de la mortalidad perioperatoria y la proporción de injertos. La mortalidad perioperatoria fue nula en el grupo 1-SC se utiliza como un control, y significativamente mayor en el grupo 3-SOI (60%, p & lt; 0,001) pero no en los grupos 2-POI (6%, p = 0,79) o 4- TOI (3%, p = 0,72). Evaluar el efecto de una curva de aprendizaje en la mortalidad perioperatoria del grupo 3-SOI, se observó una disminución no significativa en la mortalidad entre los 10 primeros animales y los antiguos 15 animales (mortalidad 80% vs 47%, respectivamente, p = .21 ). No se observaron diferencias significativas entre los grupos 2-PDI y 4-TOI con respecto a la tasa de mortalidad perioperatoria (p = 0,99, Tabla 1). La tasa de injerto fue del 100% en el grupo 1-SC se utiliza como un control, y significativamente menor en el grupo 2-POI (68%, p = 0,037), grupo 3-SOI (60%, p = 0,034) y el grupo 4 -TOI (65%, p = 0,027). No se observaron diferencias significativas entre los 3 grupos experimentales con respecto a la proporción de injertos (p = 0,90, Tabla 1).
Relevancia clínica
relevancia clínica se evaluó mediante la ubicación de la inicial tumoral, obtención de imágenes de la extensión del tumor, el análisis de supervivencia y el análisis histológico. El tumor inicial se limita al tejido SC en el grupo 1-SC y el parénquima pulmonar en el grupo 3-SOI. En el grupo 2-PDI, el 53% de los animales se sometieron a la siembra pleural durante la inyección percutánea ortotópico y desarrolló extensión regional loco inicial de ambas pleuras. Como el objetivo de este estudio fue obtener un modelo de NSCLC intrapulmonar localizada, esta siembra pleural inmediata descalificado la técnica. En el grupo 4-TOI, el tumor se limita inicialmente a la parénquima pulmonar (Tabla 1, Figura 2a y 2b). bioluminiscente de imágenes encontró curvas irregulares en el grupo 1-SC y 3-SOI, con alto título individual y entre las variaciones cronológicas. Ningún animal desarrolló locorregional o extensiones metastásicos durante el seguimiento. En el grupo 2-PDI, sin curva de bioluminiscencia se representó a causa de la siembra pleural perioperatorio. Uno de los animales desarrolló metástasis ósea. En el grupo 4-TOI, bioluminiscente de imágenes encontró una curva normal, exponencial tras día 21. Siete por ciento de los animales desarrolló extensión locorregional de la pleura homolateral como una evolución del tumor primario. Un animal de la metástasis ósea desarrollado (Tabla 1, Figura 2a). El análisis de supervivencia reveló que la mediana de supervivencia no se logró después de un seguimiento de 2 meses en el grupo 1-SC y 3-SOI. En el grupo 2-PDI, sin curva de supervivencia se trazó a causa de la siembra pleural perioperatorio. En el grupo 4-TOI, la supervivencia media fue de 40 días (Tabla 1, Figura 2c). El examen histológico reveló tumores redondos SC con una forma regular, alta proporción de carcinoma indiferenciado, algunas rupturas capsulares, y pocos vascular o embolia linfática en el grupo 1-SC. En el grupo 2-PDI, se obtuvieron tumores intraparenquimatosas regulares, con una baja proporción de carcinoma indiferenciado, un alto número de rupturas capsulares y vascular o embolia linfática. En el grupo 3-SOI, se obtuvieron tumores intraparenquimatosas irregulares, con una baja proporción de carcinoma indiferenciado (+), rupturas capsulares (++) y un número elevado de embolia vascular o linfático. Los resultados fueron similares en el grupo 4-TOI y el grupo 2-PDI (Figura 3, Tabla 2).
a. Evolución de los fotones count (expresada como 10
6 fotones /s) a través del tiempo, desde el día 0 (implantación) hasta el día 63 (final de la bioluminiscencia durante el seguimiento). Para cada tiempo, se informó viva la media y la desviación estándar de los animales. En el grupo 2-POI, la inyección percutánea condujo a la siembra pleural en 53% de los casos, como postoperatoria de rayos X mostró agente de contraste ni en el espacio pleural izquierda, el espacio pleural derecha (continuum anatómica), o ambos. segundo. evolución representativa de la señal bioluminiscente, desde el día 14 al día 42. En el grupo 2-PDI, siembra pleural crea una señal situada en la base derecha del tórax, lo que contradice con el objetivo principal de este estudio. Sin seguimiento posterior que ha realizado para este grupo. do. Curva de supervivencia desde el momento de la implantación del tumor a 2 meses utilizando el método de Kaplan-Meier y el 95% intervalo de confianza bares. La supervivencia a los 2 meses es del 100% en el grupo 1-SC, el 40% en el grupo 3-SOI, y el 65% en el grupo 4-TOI.
quirúrgica de implantación ortotópico (Grupo 3) dio como resultado localizada tumores infiltrantes, mientras que la inyección ortotópica percutánea (grupo 2) y la inyección ortotópica transpleural (grupo 4) dieron como resultado nódulos redondeados localizadas. El examen histológico reveló una alta proporción de carcinoma no diferenciado en el grupo tumor 1-SC, pero una proporción baja en los 3 grupos experimentales. Por otra parte, los 3 grupos experimentales se asociaron con mayor ruptura de la cápsula y de la embolia vascular que el grupo 1-SC.
Identificación de CTC
las tasas de implantación de xenoinjertos fueron del 100% en CTC grupo 1 (SC, n = 6) y 60% en el grupo 2 CTC (TOI, n = 9). Tres ensayos Cellsearch® se realizaron en cada grupo de control, y 6 ensayos Cellsearch® se realizaron en cada grupo experimental. Los controles negativos demostraron cero o uno CD45-, DAPI +, CKPE + de células por ensayo (datos no mostrados). Los controles positivos demostraron una correlación entre el número de células tumorales en solución y el recuento de CTC Cellsearch® (Figura 4a y 4b). En el grupo 1 CTC-SC, 5 ensayos (83%) fueron positivos para la detección de CTC (CTC rango de nivel 2-5, con una media de 2,5 ± 1,76). En el grupo 2-CTC TOI, 5 ensayos fueron positivos para la detección de CTC (CTC rango de nivel 2-21, significa 9,5 ± 9,35). Todos juntos, 3 semanas después de la implantación del tumor, se detectaron CTC en el 83% de los
ratones desnudos portadores de cualquiera SC o tumores de NSCLC ortotópico (Figura 4C y 4D). Al comparar los grupos, la diferencia en los niveles de CTC mostró una tendencia hacia la significación estadística (p = 0,058, Figura 4c, Tabla 2).
a. Representación de la tinción de las células en circulación utilizando el ensayo de Cellsearch®. CTC se definen como CD45-, DAPI +, y las células CKPE +. - Línea superior: como un control positivo, se analizaron 50 y 500 células A549luc en una solución que contiene 600 l de medio y 7 ml de sangre humana sana. Aquí, como un ejemplo, tanto CD45-, DAPI +, las células CKPE + son las células tumorales. - En pocas palabras: la representación de los resultados de los grupos experimentales. Aquí, como un ejemplo, este CD45-, DAPI +, + CKPE célula es un CTC. segundo. Correlación entre la CellSearch ® CTC cuenta y el número de células tumorales en solución. Como controles, 0 (control negativo), 50 y 500 (controles positivos) A549luc Las células se analizaron en una solución que contiene 600 l de medio y 7 ml de sangre humana sana. Este experimento demostró una correlación entre el recuento de CTC Cellsearch® y el número de células tumorales en solución (R
2 = 0,99857). do. Número de CTC según el grupo experimental, CTC grupo 1 (SC) o grupo CTC 2 (ortotópico). La positividad total del ensayo CellSearch ® es comparable en ambos grupos (83%), con una tendencia hacia una mayor CTC en el ortotópico en lugar de en el modelo subcutáneo. re. Representación de la señal bioluminiscente y el número de CTC detecta en cada uno de los 12 animales.
Discusión
La localización tumoral y los efectos de la implantación de métodos de desarrollo tumoral y la cinética
Al comparar SC, inyección ortotópico percutánea y modelos de implantación ortotópico quirúrgicos con la intención de perfeccionar el seguimiento de la progresión tumoral mediante imágenes bioluminiscentes, nos enfrentamos a los límites de estos modelos, incluyendo discrepancia órgano (SC), frecuentes siembra pleural (inyección ortotópico percutánea) y alta perioperatoria la mortalidad (quirúrgica de implantación ortotópica). Además, ninguno de estos modelos permite un seguimiento fiable de la progresión del tumor utilizando imágenes bioluminiscente. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo ortotópico de inyección transpleural, la combinación de una baja mortalidad perioperatoria, la tasa de injerto razonable, la escasez de siembra pleural, y la progresión del tumor con metástasis para los que la progresión del tumor puede ser monitoreada por bioluminiscente de imágenes. Por otra parte, este estudio permite la identificación de las CTC en modelos murinos de NSCLC, por primera vez hasta la fecha. Creemos que, además de la imagen funcional, la aplicación en la fase preclínica en vivo de CTC contribuye a definir biomarcadores de la carga tumoral y la eficacia del tratamiento en ensayos clínicos posteriores.
modelos de xenoinjertos SC
xenoinjertos SC a partir de líneas celulares derivadas de seres humanos a animales inmunodeficientes han sido el estándar de oro de los experimentos preclínicos de cáncer durante décadas [14]. Este modelo presenta varias ventajas, incluyendo la viabilidad técnica (ausencia de anestesia, fácil de realizar la inyección) y la accesibilidad del tumor (medición directa del tumor SC permitiendo seguimiento longitudinal). Sin embargo, los modelos SC están limitados por la discrepancia entre el origen y el xenotrasplante microenvironnement anfitrión, incluyendo la matriz extracelular, las señales paracrinas, y por lo tanto no modelan la teoría de Paget "semilla y el suelo" [22]. Esta discrepancia se ha encontrado para afectar la respuesta del tumor a agentes citotóxicos y la radioterapia [23], [24] y ciertamente un impacto en la respuesta a nuevos agentes contra el cáncer. Esta discrepancia podría ser de importancia crítica en el CPNM, fueron hipoxia y neoangiogénesis juegan un papel importante en la progresión tumoral [25], y se producen de manera diferente en SC y xenoinjertos intratorácica [26]. Por último, sólo una minoría de los modelos SC difundir y avanzar hacia una etapa metastásica, la ausencia de progresión desde localiza en fase metastásica mediante la extensión ganglionar locorregional, por tanto, es una de las principales limitaciones de los modelos SC mientras que la causa principal (2/3) de muerte por cáncer es la enfermedad metastásica.
Estas diferencias tienen importantes implicaciones en relación con la progresión tumoral, con pocas células tumorales circulantes y sin metástasis en nuestros experimentos, que señalan un límite importante para la evaluación de medicamentos, con dos riesgos. El primer riesgo es empujar en la clínica una molécula o una combinación de fármacos con poca o ninguna eficacia. A modo de ejemplo, la combinación de inhibidores de la quimioterapia y de EGFR ha demostrado eficacia en modelos SC de NSCLC [27], [28], pero nunca ha alcanzado una eficacia significativa en ensayos clínicos incluyendo pacientes con NSCLC no seleccionados sobre el estado de EGFR [3], [10] , [29]. El segundo riesgo es detener el desarrollo de fármacos prometedores. A modo de ejemplo, antagonista de HIF-1 alfa PX-478 no mostró actividad mensurable contra xenoinjertos de SC de NSCLC, pero inhibió la progresión y diseminación del cáncer de pulmón ortotópico humano de células pequeñas y adenocarcinoma de pulmón en ratones, y finalmente se ensayó en la fase 1 de ensayo [30].
en conjunto, estos datos sugieren que los xenoinjertos SC no son totalmente adecuados para el estudio preclínico de CPNM, y sólo debe utilizarse y analizarse cuidadosamente. Conclusiones similares se han extraído de las pruebas de drogas preclínica SCLC [31].
modelos ortotópico anteriores
Para tomar la influencia de la especificidad de órganos y micro Environnement tumor en cuenta, modelos ortotópico se han desarrollado progresivamente a lo largo los últimos 20 años, con el objetivo final de obtener un solo tumor pulmonar intraparenquimatosa que imitan la situación clínica y permitir seguimiento longitudinal. [33] por vía intravenosa [32], intrabronquial - [35] y la administración intrapleural [36], [37] de pulmón líneas celulares de cáncer resultó en pleural, localmente avanzado o múltiples tumores sincrónicos. Por lo tanto, estos modelos pueden ser interesantes para estudiar estas situaciones particulares, pero no podrán ampliarse para intrapulmonar localizada NSCLC, que constituyen la mayoría de los pacientes con CPNM y la base de la progresión tumoral
.
modelos de ratones genéticamente modificados (GEMM) también se han desarrollado para estudiar NSCLC en ratones. Estos animales son generalmente p53 mutado, favoreciendo la inestabilidad genética y la formación de tumores, y se desarrollan los tumores de pulmón impulsados por el EGFR [38], KRAS [39], PIK3CA [40], BRAF [41] activación oncogénica o la presencia de fusión EML4-ALK oncogén [42]. KRAS cáncer de pulmón mutado puede ser observado en cepas de ratones portadores de alelos oncogénicas de KRAS que pueden activarse sólo en un evento de recombinación espontánea en todo el animal [43], o después de KRAS activación esporádica a través de Cre-lox mediada por recombinación somática después de la entrega mediada por adenoviral de Cre recombinasa en el epitelio pulmonar [39]. Ambos modelos permiten el desarrollo de cáncer de pulmón KRAS mutado en un corto período de tiempo. Sin embargo, estos modelos se limitan por su distancia a la situación clínica, como mutaciones de uno o dos oncogenes o genes supresores de tumores están lejos de la progresión paso múltiples de cáncer de pulmón se producen en la inflamación crónica subyacente. Por otra parte, los modelos GEMM dan lugar a cientos de NSCLC primario en el mismo período de tiempo los son difíciles de seguir y cuantificar durante los ensayos preclínicos y de imagen no invasiva. A pesar de estos inconvenientes, GEMM tienen la ventaja de perfeccionar la definición de los oncogenes y de tomar en cuenta la respuesta inmune. Estudios recientes han informado de que GEMM puede ser de interés en el estudio de la eficacia de los tratamientos con CPNM común [44].
La implantación quirúrgica de un fragmento de NSCLC en los pulmones de los ratones inmunodeficientes mediante toracotomía se informó por primera vez en 1992 [21], [45], [46].