Extracto
Aplicaciones
A pesar de la llegada de los agentes terapéuticos aprobados por la FDA para un número limitado de objetivos disponibles (quinasas y mTOR), la SLP de cáncer de riñón (RCC) se ha ampliado una sola a dos años debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos. A continuación, se evalúa una nueva terapéutica para el CCR que se dirige el inhibidor exportin-1 (XPO1).
Materiales y Métodos
RCC células fueron tratadas con el inhibidor XPO1 disponible por vía oral, KPT-330, y la viabilidad celular y los ensayos de Anexina V (apoptosis), y el ciclo celular se realizaron análisis para evaluar la eficacia de KPT-330 en dos líneas celulares de RCC. La inmunotransferencia y el análisis de inmunofluorescencia se realizaron para validar mecanismos de inhibición XPO1. La eficacia y sobre-objetivo efectos de KPT-330 se analizaron adicionalmente in vivo en ratones de xenoinjerto de RCC, y se establecieron las células KPT-330-resistentes para evaluar los posibles mecanismos de resistencia KPT-330.
Resultados
KPT-330 atenuado RCC viabilidad a través de la inhibición del crecimiento y la inducción de apoptosis tanto in vitro como in vivo, un proceso en el que aumenta la localización nuclear de p21 por XPO1 inhibición desempeñado un papel importante. Además, KPT-330 células resistentes permanecieron sensibles a la actualmente aprobado para RCC inhibidores multi-quinasa (sunitinib, sorafenib) e inhibidores de mTOR (everolimus, temsirolimus), lo que sugiere que estas terapias dirigidas seguirían siendo útiles como agentes terapéuticos de segunda línea tras KPT-330 tratamiento.
Conclusión
El inhibidor XPO1 disponible por vía oral, KPT-330, representa una nueva diana para el CCR cuya eficacia in vivo se aproxima al de sunitinib. Además, las células resistentes a KPT-330 conservan su capacidad de respuesta a la terapéutica RCC disponibles sugieren un enfoque novedoso para el tratamiento en KPT-330-ingenuo, así como pacientes con CCR resistentes
Visto:. Wettersten HI, Landesman Y, Friedlander S, S Shacham, Kauffman M, Weiss RH (2014) la inhibición específica de la Nuclear exportador Exportin-1 atenúa el crecimiento del cáncer de riñón. PLoS ONE 9 (12): e113867. doi: 10.1371 /journal.pone.0113867
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Junio, 2014; Aceptado: 31 Octubre 2014; Publicado: Diciembre 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Wettersten et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 5UO1CA86402, 1R01CA135401-01A1, y 1R01DK082690-01A1 y por Karyopharm Terapéutica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Si bien algunos de los trabajos fue financiado, y algunos de los autores emplean, por Karyopharm , esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Además, ninguno de los experimentos o conclusiones del trabajo fueron influenciados de alguna manera por Karyopharm
Introducción
El cáncer de riñón (carcinoma de células renales; RCC). Es la 13
ª más cáncer común en todo el mundo y es uno de los pocos cánceres cuya incidencia está aumentando, un hallazgo no sólo debido a la mejora de las técnicas de diagnóstico [1], [2]. Los signos y síntomas de la RCC son con frecuencia sutiles o incluso inexistente, de manera que más de la mitad de los pacientes son diagnosticados incidentalmente, y con frecuencia en la fase metastásica, mientras que está siendo evaluado para otras enfermedades como la insuficiencia renal aguda [3]. Mientras que la supervivencia de cinco años para los que presentan localizada RCC es más del 70%, para aquellos con enfermedad metastásica, la supervivencia a cinco años se reduce a un triste 16 a 32%. Aproximadamente la mitad de los pacientes con CCR desarrollar la enfermedad avanzada y requieren terapia sistémica. A pesar de la llegada de varias terapias aprobadas por la FDA dirigidas durante los últimos años, que se limitan a inhibidores de la multi-quinasa e inhibidores de mTOR, la supervivencia libre de progresión (SLP) se extiende sólo uno o dos años con estas terapias dirigidas debido en gran medida al desarrollo de la resistencia a los medicamentos [4]. Por lo tanto, es crítico para desarrollar nuevas terapias para objetivos distintos de quinasas y la vía de mTOR
p21 se describió originalmente como un inhibidor dependiente de ciclina-quinasa (CKI) de ciclina-CDK2, -CDK1, y. - CDK4 /6 complejos cuya expresión está regulada por p53 clásicamente [5]. Sin embargo, con los años se ha demostrado que tiene pleiotrópica, y, a veces aparentemente contradictoria, efectos sobre la proliferación celular, la apoptosis, la senescencia y en el cáncer y en la enfermedad vascular independiente de p53 [5], [6]. En general, cuando p21 se localiza en el núcleo, se une a complejos de ciclina-CDK inhibiendo de esta manera su función en la progresión del ciclo celular, lo que resulta en la detención del ciclo celular [5]. Sin embargo, cuando p21 se localiza en el compartimento citosólico, que inhibe la apoptosis mediante la formación de complejos con proteínas pro-apoptóticas como pro-caspasa-3 o ASK [7], [8]. De acuerdo con estos supuestos mecanismos, el trabajo previo en nuestro laboratorio ha demostrado que el aumento de p21 citosólica es un indicador de mal pronóstico en pacientes con CCR [9], un hallazgo también observado en otros tipos de cáncer [10], [11].
el exportador nuclear, exportin11 (XPO1; CRM1), controla la localización núcleo-citoplasma de más de 200 señal de exportación nuclear (NES) -Con un contenido de proteínas, muchas de las cuales son proteínas supresoras de tumores (PAT), incluyendo p21 [12]. Se ha demostrado previamente que XPO1 inhibidores tienen un efecto terapéutico en RCC [13]. En este estudio, hemos probado la eficacia de KPT-330, el inhibidor XPO1 disponible por vía oral que se encuentra actualmente en fase I /II de ensayos clínicos, para evaluar su potencial clínico, ya sea individualmente o como tratamiento combinado, en el CCR avanzado. Vamos a demostrar que, probablemente a través de un mecanismo relacionado con la localización subcelular de p21, este inhibidor XPO1 disponible por vía oral representa una nueva actuación terapéutica viable en un objetivo no probado hasta ahora en el CCR.
Materiales y Métodos
cultivo de células
el RCC líneas celulares ACHN y 786-O se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se evalúan periódicamente para detectar la presencia de Mycoplasma. Las células normales humano epitelial proximal renal (NHK) se obtuvieron de Lonza (Allendale, NJ). Todas las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades /ml de estreptomicina, y 100 mg /ml de penicilina en 5% de CO
2 a 37 ° C. Estas dos líneas celulares se eligieron para examinar la eficacia de KPT-330 tanto en las células del tumor primario derivadas (786-O, que pueden ser considerados "primeros" tumores)., Así como las células metastásicas (ACHN)
Materiales
reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX, control negativo de la cautela de ARNi de ARNsi, y la cautela RNAi XPO1 siRNA se obtuvieron de Life Technologies (Grand Island, NY). KPT-330 se sintetizó mediante Karyopharm Therapeutics (Natick, MA). Sunitinib y base libre de sorafenib se obtuvieron de LC Laboratories (Worburn, MA). Everolimus y temsirolimus fueron regalos de Dr. Prasit en Ciencias de la creación (San Diego, CA). Dimetil sulfóxido (DMSO) y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). anticuerpo policlonal de conejo anti-XPO1 y el anticuerpo anti-p53 monoclonal de ratón se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). anticuerpo anti-p21WAF1 /Cip monoclonal de ratón se obtuvo de Millipore (Billerica, MA). monoclonal anticuerpo de conejo anti-p21WAF1 /Cip e IgG anti-conejo (H + L), F (ab ') 2 Fragment (Alexa Fluor 488 conjugado) se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Cabra anti-ratón de cabra HRP anti-conejo conjugado IgG se obtuvieron de Bio-Rad (Hercules, CA). Vectashield Hardset medio de montaje con DAPI se obtuvo de Vector Laboratories (Burlingame, CA).
KPT-330, sunitinib, sorafenib, everolimus, y temsirolimus se disolvieron en DMSO para los estudios in vitro. KPT-330 se combinó con vehículos Poloxamer 188 (Pluronic F68; obtenidos de Spectrum Laboratory Products, Inc.) y PVP K-29/32 (Plasdone K-29/32; obtenido a partir de tecnologías de ISP, Inc.) en solución y sunitnib era disuelto en aceite vegetal para el estudio in vivo.
inmunotransferencia
la inmunotransferencia fue como se describe anteriormente [14]. En pocas palabras, después de los tratamientos adecuados, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se lisaron en tampón de lisis, y se inmunotransfirieron los lisados celulares. Las membranas se bloquearon en leche en polvo sin grasa al 5% durante una hora a temperatura ambiente y se sondaron con anticuerpos apropiados. Las membranas luego se probaron con HRP etiquetados anti-ratón o anticuerpos IgG anti-conejo. La señal se detectó usando soluciones de quimioluminiscencia mejorada (ECL). análisis de densitometría se realizó utilizando el software ImageJ 1.440 (http://imagej.nih.gov/ij) y, después de la normalización de control de carga (β-actina) se indica encima de cada inmunotransferencia.
inmunofluorescencia
Después de tratamiento indicado en ocho cámara de diapositivas así, se realizó inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente [14]. Brevemente, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% y se colocaron en tampón de bloqueo. Posteriormente, las células se incubaron con el anticuerpo indicado, se incubaron con IgG anti-conejo (H + L), F (ab ')
2 Fragmento (Alexa Fluor 488 conjugado), y coverslipped con Vectashield con DAPI. Las muestras fueron examinadas por microscopía confocal.
Se realizó el ensayo de MTT
ensayo de viabilidad celular como se describe anteriormente [14]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos, y después de los tratamientos adecuados, las células se incubaron en mezcla de solución /media MTT. Entonces, la solución de MTT se eliminó y el precipitado cristalino azul en cada pocillo se disolvió en DMSO. absorbancia visible de cada pocillo a 540 nm se cuantificó usando un lector de microplacas.
Se realizó un análisis del ciclo celular
Análisis del ciclo celular que utiliza la célula MUSE Analyzer (Millipore, Billerica, MA) después del fabricante instrucción. En pocas palabras, después de los tratamientos indicados, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Después de la tinción, las células fueron procesadas para el análisis del ciclo celular
Anexina V ensayo
Anexina V & amp.; Ensayo de células muertas se realizó utilizando el Analizador de la célula MUSE siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, después de los tratamientos apropiados, las células fueron incubadas con Anexina V y el reactivo Dead Cell (7-AAD) y los eventos de las células muertas, a finales de apoptosis, a principios de apoptosis, y en vivo fueron contados.
La inmunohistoquímica
se utilizó immunostainer
BioGenex i6000 automatizado para llevar a cabo IHC en xenoinjertos incluidas en parafina fijadas con formalina. El antígeno se recupera al vapor con Cell Marque reactivo Declere. Antecedentes fue bloqueada con el bloque de alimentación Biogenex. El anticuerpo primario se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de detección con el de dos pasos, kit de alta definición de detección de polímero a partir de la célula Marque, seguido por Cell Marque DAB cromógeno. Las muestras fueron contraste con hematoxilina, deshidratados, limpiado, y se cubrieron. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: p21 (Abcam) y Ki67 (Cell Marque). El kit de Millipore La apoptosis se utilizó de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.
siRNA transfección
reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX se mezcló con la cautela de ARNi de ARNsi siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, las células se incubaron con la mezcla en medios de crecimiento sin penicilina /estreptomicina durante el tiempo apropiado para la transfección de siRNAs y caída fue confirmada por inmunotransferencia.
ACHN experimento de xenoinjerto en ratones
La UC Davis Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) comité aprobó específicamente este estudio. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de California IACUC. ratones atímicos machos Nu /Nu se inyectaron cada uno con 5 × 10
5 células ACHN por vía subcutánea en la región de flanco. La progresión tumoral se controló semanalmente con un calibre (volumen del tumor = largo x ancho x ancho /2). Cuando los tamaños de tumor alcanzó alrededor de 80-100 mm
3, los ratones se dividieron al azar en cinco grupos (vehículo, sunitinib, KPT-330 de baja o alta dosis, o KPT-330 baja y sunitinib) para los tratamientos con fármacos. Para el grupo de vehículo, se les dio soluciones de vehículos (Pluronic F-68 y PVP K-29/32 de la mezcla y aceite vegetal) por vía oral (dos veces por semana y cinco veces por semana, respectivamente, n = 8). Para el grupo de sunitinib, la solución de vehículo para KPT-330, (40 mg /kg) Pluronic F-68 y PVP K-29 mezcla /32, y sunitinib se administran por vía oral (dos veces por semana y cinco veces por semana, respectivamente, n = 8) [15]. Para el grupo de bajo KPT-330, una dosis baja de KPT-330 (7,5 mg /kg) y aceite vegetal se administra por vía oral (dos veces por semana y cinco veces por semana, respectivamente, n = 8). Para el grupo de alto KPT-330, alta dosis de KPT-330 (15 mg /kg) y el aceite vegetal se administra por vía oral (dos veces por semana y cinco veces por semana, respectivamente, n = 8). Para el grupo de baja y sunitinib KPT-330, una dosis baja de KPT-330 (7,5 mg /kg) y sunitinib (40 mg /kg) se administraron por vía oral (dos veces por semana y cinco veces por semana, respectivamente, n = 8). Después de 25 días de tratamiento, los animales fueron sacrificados y los tejidos tumorales se recogieron en 10% de formalina para el análisis de inmunohistoquímica.
Métodos estadísticos
Para los estudios in vitro, se realizaron comparaciones de los valores medios utilizando el muestras independientes t-test. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo. Para el estudio in vivo, el crecimiento del tumor se comparó por pares entre todos los tratamientos que utilizan el método de Tukey HSD.
Resultados
Atenuación de XPO1 por KPT-330 inhibe RCC viabilidad mediante la detención del ciclo celular y la inducción de apoptosis
primero confirmó que KPT-330 atenuado niveles de XPO1 en dos líneas celulares de RCC, de una magnitud similar (de 0,1 M) a la que se observó con inhibidores previamente desarrolladas de este transportador nuclear (Fig. 1A) [13]. Para evaluar la eficacia de la inhibición XPO1 por KPT-330 hacia la supervivencia celular, se determinó que la viabilidad celular en respuesta a este inhibidor fue evidente a una concentración de 0,1 M en líneas celulares de RCC, pero en un orden de magnitud dosis más alta (10 mM) en condiciones normales células renales epitelial tubular (NHK) (Fig. 1B), un hallazgo posiblemente debido al aumento de los niveles de XPO1 en los tejidos de RCC en comparación con los tejidos normales del riñón que hemos demostrado previamente [13]. Para comenzar a investigar los mecanismos de la inducida por KPT-330 disminuyó la viabilidad celular en RCC, se realizaron análisis del ciclo celular y apoptosis. Cuando se incubaron con KPT-330, ambas líneas celulares de RCC mostraron un aumento de células en la fase G2 /M del ciclo celular de más de 10% (Fig. 1C), así como una fracción de las células apoptóticas de aproximadamente 10% (Fig . 1D y la Fig. S1), lo que sugiere que la disminución de la viabilidad de las células de RCC por KPT-330 se produce a través tanto de la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis.
La células de RCC 786-O y ACHN se hicieron crecer hasta ~ 60% confluencia y se trató con KPT-330 en dosis indicadas durante 24 horas y la inmunotransferencia se realizó con anticuerpos específicos (a). células de RCC y NHK se cultivaron hasta ~ 30% de confluencia, se trataron con KPT-330 en dosis indicadas durante 72 horas, y se realizaron ensayos de MTT (B). Análisis del ciclo celular (C) y el ensayo de Anexina V (D) se realizaron después de horas de incubación 24 con DMSO (Cont) o KPT-330 (1 M). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. Las barras de error indican la desviación estándar.
XPO1 inhibición confinado p21 al núcleo en células de RCC, pero no en una línea celular epitelial renal normal
El aumento de p21 citosólica, que se ha demostrado que inhibe la apoptosis [5] y por lo tanto posiblemente frustrar la vigilancia tumoral, es un indicador de mal pronóstico para el CCR [9]. Por este motivo, y en vista de la propiedad conocida de p21 nuclear en la atenuación de la progresión del ciclo celular, nos preguntamos si se requiere p21 nuclear para KPT-330 para causar los efectos observados en células de RCC. Cuando se visualizaron mediante citoquímica de inmunofluorescencia, se demostró que p21 que se limita en gran medida al núcleo después del tratamiento KPT-330 en ambas líneas celulares de RCC (Fig. 2A). En consonancia con los datos del ciclo celular, KPT-330 no logró alterar la localización de p21 en las células NHK (Fig 2A.); esto puede explicar el fracaso de KPT-330 para disminuir la supervivencia en las células normales y es relevante para el futuro de traducción clínica de estos hallazgos (
vide infra
). Curiosamente, los niveles de p21 fueron aumentados por KPT-330 en células de RCC (Fig. 2B), lo que sugiere que p21 no sólo se limita en el núcleo por KPT-330 pero también mostró aumento de los niveles, probablemente la mediación de la detención del ciclo celular G2 observado /M ( véase la Fig. 1C y [16]).
La células de RCC 786-O y ACHN se hicieron crecer hasta ~ 60% de confluencia y se trataron con KPT-330 en dosis indicadas durante 24 horas. La inmunofluorescencia se realizó mediante microscopía confocal (20x) y el número de células en las que p21 estaba predominantemente en el núcleo fueron contados en tres campos seleccionados al azar y se divide por el número total de células (A). La inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos específicos (B). Azul, núcleo (DAPI); Green, p21. * P & lt; 0,05 en comparación con el control. Las barras de error indican la desviación estándar.
inhibición de siRNA XPO1 aumentó p21 nuclear en células de RCC
Para demostrar la especificidad de KPT-330 sobre los niveles y la localización de p21, y que estos efectos son debido a la inhibición XPO1, RCC células (ACHN 786-o) y se transfectaron bien con un siRNA específico para XPO1 o un control de secuencia revueltos siRNA. Ambas líneas celulares demostraron disminución de los niveles de XPO1 acompañados de un aumento de la p21 total en el momento XPO1 desmontables (Fig. 3A), con la tinción de inmunofluorescencia que muestran que p21 se limita en gran medida al núcleo en estas condiciones (Fig. 3B), similar a lo observado con KPT-330 (véase la Fig. 2B). Por lo tanto, el efecto de KPT-330 en p21 se debió específicamente a XPO1 atenuación.
La RCC (786-O y ACHN) las células fueron cultivadas a ~ 60% de confluencia y se transfectaron con control de secuencia revueltos o XPO1- siRNA específico durante 48 horas. La inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos específicos (A) y de inmunofluorescencia se llevó a cabo por microscopía confocal (20x) (B). El número de células en las que p21 estaba predominantemente en el núcleo fueron contados en tres campos seleccionados al azar y se divide por el número total de células. Azul, núcleo (DAPI); Green, p21. * P & lt; 0,05 en comparación con el control. Las barras de error indican la desviación estándar.
Administrado por vía oral KPT-330 atenuó el crecimiento del tumor, asociado con un aumento de p21 nuclear
Para empezar a traducir esta obra al lado de la cama, la eficacia de KPT- se evaluó 330 en un modelo de xenoinjerto de ratón RCC. Una vez que los tumores subcutáneamente implantados se volvieron palpables, los ratones fueron tratados con sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 baja (7,5 mg /kg) y alta (15 mg /kg) dosis, una combinación de sunitinib y KPT-330 baja dosis, o vehículo (que era el mismo para KPT-330 y sunitinib). Sunitinib se utiliza tanto como un control de drogas y como un potencial socio de tratamiento de combinación ya que sunitinib es el tratamiento de primera línea para el CCR [17]. Tanto KPT-330 de alta dosis y la combinación de sunitinib y KPT-330 de dosis baja inhibe el crecimiento RCC significativamente en comparación con el vehículo (Fig. 4), lo que sugiere que KPT-330 se puede utilizar como terapia única y es también beneficioso cuando se combina con la corriente de primera línea terapéutica, sunitinib.
5 × 10
5 células fueron inyectadas por vía subcutánea ACHN a la región de flanco. Una vez que los tumores eran palpables, los ratones se trataron con vehículo, sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 baja (7,5 mg /kg), KPT-330 de alta (15 mg /kg) o sunitinib y KPT-330 bajo para 25 días como se explica en Materiales y Métodos. El crecimiento tumoral se controló mediante un calibre (volumen del tumor = largo x ancho x ancho /2) se calculó y el tumor tasa de crecimiento (volumen del tumor en el día tomo X /tumor en el día 0). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. Las barras de error indican el error estándar.
Para validar efectos sobre la diana de KPT-330, los tejidos de xenoinjertos fueron procesados después del sacrificio para el análisis de inmunohistoquímica. En comparación con los tejidos de xenoinjerto de control, KPT-330 (dosis alta) animales tratados mostró un aumento de p21 tinción nuclear, un aumento en el marcador de apoptosis Apoptag tinción, y una disminución en la tinción por el marcador de proliferación Ki67 (Fig. 5), consistentes con nuestras observaciones in vitro. Estos hallazgos sugieren que KPT-330 atenúa crecimiento RCC través de la inhibición del crecimiento celular y la inducción de apoptosis en el modelo de xenoinjerto de RCC, y que la regulación de la localización de p21 desempeña un papel importante en la eficacia de KPT-330
.
Después la conclusión del experimento descrito en la Fig. 6, los tejidos de xenoinjerto se recogieron y se procesaron para inmunohistoquímica con los anticuerpos indicados como se describe en Materiales y Métodos. Bar = 20 micras.
KPT-330 células resistentes fueron sensibles a la terapéutica aprobada por la FDA para el CCR
Debido a la frecuente aparición de la resistencia a la quimioterapia en pacientes con CCR tratados con terapias dirigidas, se es fundamental para proporcionar opciones terapéuticas alternativas para aquellos que pueden desarrollar resistencia a la inhibición XPO1 con la estrategia propuesta en este estudio. Para evaluar el mecanismo por el cual las células de RCC se vuelven resistentes a KPT-330, nos centramos en las células 786-O BVS-mut, ya BVS mutación se observa en aproximadamente el 90% de los pacientes con CCR [18]. células 786-O se incubaron inicialmente con un (50 nM) baja concentración de KPT-330, y en serie transferidos a medios de comunicación con concentraciones crecientes de KPT-330 durante un período de seis meses. Las células que comenzaron a crecer a 1 M KPT-330 se definieron como "KPT-330 resistente"; de las células 786-O parentales (P), se establecieron un total de dos líneas celulares resistentes separadas (R1 y R2). Tal como se define, las células R1 y R2 fueron menos sensibles a KPT-330 que las células P cuando se tratan con varias dosis de KPT-330 (Fig. 6A) sin atenuación de XPO1 (Fig. 6B). Curiosamente, la localización de p21 no se vio afectada en 330 KPT-resistentes a las células (Fig. 6C), apoyando además la importancia de esta proteína en KPT-330 de señalización.
KPT-330 resistente al 786-O (R1 y R2) se establecieron las células como se describe en el texto, y estos, así como las células parentales (P) fueron tratados con KPT-330 a las dosis indicadas durante 72 horas después de lo cual se realizaron ensayos de MTT (a). células R1, R2, y P fueron tratados con KPT-330 durante 24 horas a continuación, inmunotransferencia y se llevaron a cabo inmunofluorescencia. El número de células en las que p21 fue predominantemente en el núcleo fueron contados en tres campos seleccionados al azar y se dividen por el número total de células (azul, el núcleo (DAPI); verde, p21) (B). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. Las barras de error indican la desviación estándar.
Para evaluar el potencial de las terapias de rescate, la supervivencia de las células resistentes se evaluó con agentes dirigidos convencionales. Cuando-330 KPT células resistentes fueron tratados con cada uno de los actualmente aprobado para inhibidores de RCC quinasa (sunitinib y sorafenib) e inhibidores de mTOR (everolimus y temsirolimus), las células de R1 y R2 conservan sensibilidad similar a las células P (Fig. 7), lo que implica que las terapias dirigidas convencionales podrían ser utilizados como terapia de segunda línea si los pacientes desarrollan resistencia a KPT-330.
KPT-330 resistente al 786-O células parentales (P) (R1 y R2) y se trataron con KPT-330 a las dosis indicadas durante 72 horas después de lo cual se realizaron ensayos de MTT. * P & lt; 0,05 en comparación con el control. Las barras de error indican la desviación estándar.
Discusión
Las nuevas terapias para el CCR avanzado han sido aprobados por la FDA casi todos los años desde el advenimiento de sorafenib, la primera terapéutica dirigida RCC. Sin embargo, incluso con estos fármacos, se extendió la SSP para las personas con CCR metastásico no es más que uno o dos años debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos; la situación para los pacientes con enfermedad avanzada se hace más triste por el hecho de que no hay más que un repertorio limitado de dianas terapéuticas disponibles (actualmente sólo quinasas y mTOR) [4]. Por lo tanto, es fundamental para identificar nuevos objetivos para RCC que son distintos de los utilizados actualmente. A la luz de los estudios anteriores que muestran que los inhibidores XPO1 tienen un efecto terapéutico en el RCC in vitro e in vivo [13], en este estudio se evaluó la eficacia y el mecanismo de KPT-330, el inhibidor XPO1 que actualmente se encuentra en fase 1 de pruebas, para determinar potencial uso clínico de KPT-330 para el CCR avanzado. De hecho, los resultados de varios curso de fase I /II de ensayos clínicos KPT-330 (selinexor; clinicaltrials.gov) sugieren que la vía oral KPT-330 tiene actividad anti-cáncer clara con una tolerabilidad aceptable a través de múltiples tumores malignos sólidos y hematológicos, sin embargo, hay pocos datos de este agente en el RCC y no hay información mecanicista
.
p21 citosólica es un indicador de mal pronóstico en el CCR, y es concebible que podrían ser utilizados como un marcador de este tipo en otros tipos de cáncer, como el cáncer de mama, que también se caracterizan por p21 citosólica sobreexpresa [10]. Tanto cuando se incuban
in vitro
en varias líneas celulares de RCC y cuando se administra oralmente
in vivo
en un xenotrasplante de ratón RCC humano, KPT-330 aumentó p21 nuclear a través de la inhibición específica de XPO1, lo que resulta en una disminución significativa de la viabilidad celular RCC a través de la detención del ciclo celular (y la inhibición de la proliferación in vivo) y la inducción de apoptosis. Sorprendentemente, no había un efecto mínimo de KPT-330 sobre la viabilidad normales renal tubular de células epiteliales o la localización de p21 en estas células, un hallazgo que apoya la probabilidad de efectos adversos mínimos sobre renal (así como de otros órganos) la función en los pacientes que se administran este droga. Cuando en el núcleo, las detenciones p21 del ciclo celular por los complejos de ciclina /CKD de unión en todas las fases, mientras que cuando en el citosol, p21 inhibe la apoptosis mediante la interacción con las proteínas pro-apoptóticas incluyendo pro-caspasa 3 y ASK [5]. Así, nuestros hallazgos sugieren que p21 nuclear está involucrado en el mecanismo por el cual KPT-330 afecta a las células de RCC, una hipótesis apoyada por el hecho de que las células NHK cuya localización p21 no fue afectada por KPT-330 no eran tan sensibles a KPT-330 como RCC células y que KPT-330 células resistentes no pudieron localizar p21 al núcleo.
en muchos tipos de cáncer, la exportación nuclear de las proteínas se mejora durante la progresión de la enfermedad y puede, de hecho, contribuir al proceso de la resistencia a fármacos [19]. Por ejemplo, los niveles más altos de expresión XPO1 se correlacionan positivamente con la progresión de grado, así como el aumento de las tasas de proliferación en el glioma [20], el cáncer de páncreas [21], y el cáncer de cuello de útero [22]. Sobre la base de nuestros datos, es probable que la exportación nuclear de p21 por XPO1 es más pronunciada en RCC que en las células NHK como p21 citosólica en los tumores se incrementa, especialmente en aquellos casos de RCC con peor pronóstico [9]. Esta observación (menos efectos mediante la inhibición XPO1 en las células normales que sus células cancerosas) es consistente con otros estudios publicados que muestran que con SINE objetivo SINE células enfermas sin dañar las células normales [12]. Además, nuestros resultados que KPT-330 células resistentes retienen sensibilidad a toda la corriente aprobados por la FDA terapias dirigidas para RCC avanzado (sunitinib, sorafenib, everolimus, y temsirolimus) sugiere que los pacientes que no KPT-330 o en los que se desarrolla resistencia, podría todavía responder a estos fármacos más antiguos [4].
Conclusiones
Los datos mostrados aquí indican que la inhibición XPO1 por KPT-330 atenúa la viabilidad RCC a través de la detención del ciclo celular, así como la inducción de la apoptosis, y que aumento de la p21 nuclear por la inhibición XPO1 juega un papel importante en la eficacia de KPT-330 en RCC. Se demuestra que KPT-330 potencia la actividad antitumoral de sunitinib, lo que resulta en la inhibición completa del crecimiento del tumor RCC in vivo con esta combinación. Además, nuestros datos apoyan la posibilidad de que los pacientes resistentes a KPT-330 responderá a terapias dirigidas mayores. Teniendo en cuenta que el CCR avanzado tiene un mal pronóstico, incluso con terapias dirigidas, nuestro trabajo presenta KPT-330 como un agente terapéutico novedoso para el CCR, que rápidamente se puede mover en el ámbito clínico para evaluar la eficacia por sí mismo o tratamiento de combinación con otros agentes terapéuticos RCC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
KPT-330 indujo apoptosis en células de RCC. Las células RCC 786-S y ACHN fueron cultivadas a ~ 60% de confluencia. Un ensayo de anexina V se realizó después de la incubación de 24 horas con DMSO o KPT-330 (1 M) como se describe en Materiales y Métodos. Se muestra la compuerta
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113867.s001 gratis (PPTX)