Resumen
Cáncer asociado fibroblastos (CAF) son responsables para el crecimiento tumoral, la angiogénesis, la invasión y la metástasis. metaloproteinasas de matriz (MMP) -9 secretada por estroma del cáncer poblado por los CAF es un requisito previo para la angiogénesis y la metástasis del cáncer. Omega-3 los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI omega-3) se han notificado a tener efectos antitumorales en diversos tipos de tumores malignos. Fat-1 ratones, que pueden convertir ácidos grasos omega-6 y omega-3 PUFA independiente de la dieta, son útiles para investigar las funciones de endógena AGPI omega-3. Para examinar el efecto de los ácidos grasos omega-3 PUFA en la tumorigénesis, las células TC-1, una línea de células epiteliales murino inmortalizado por virus del papiloma humano (VPH) oncogenes, se inyectaron por vía subcutánea en ratones gordos-1 o de tipo salvaje. El crecimiento del tumor y la angiogénesis del tumor TC-1 se suprimieron significativamente en grasa-1 en comparación con ratones de tipo salvaje. cDNA microarray de los tumores derivados de ratones de tipo de grasa-1 y silvestres reveló que la MMP-9 es downregulated en ratones grasa-1. El estudio inmunohistoquímico demostró inmunorreactividad para MMP-9 en los fibroblastos del estroma tumoral fue difusamente positiva en el tipo salvaje, mientras focal en grasa-1 ratones. MMP-9 se expresó en cultivos de fibroblastos primarios aislados de ratones de tipo grasa-1 y salvaje, pero no se expresó en células TC-1. Co-cultivo de fibroblastos con células TC-1 aumentó la expresión y la actividad de la proteinasa de la MMP-9, aunque la actividad de la proteasa de MMP-9 en los fibroblastos derivados de grasa-1 fue menor que en los fibroblastos de tipo salvaje. Nuestros datos sugieren que los PUFA omega-3 suprimen la MMP-9 y la inducción de la angiogénesis tumoral. Estos hallazgos pueden dar una idea de mecanismos mediante los cuales los PUFAs omega-3 ejercen efectos antitumorales mediante la modulación de microambiente tumoral
Visto:. Taguchi A, K Kawana, Tomio K, Yamashita A, Isobe Y, Nagasaka K, et Alabama. (2014) metaloproteinasas de la matriz (MMP) -9 en los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) es suprimida por Omega-3 ácidos grasos poliinsaturados
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 9 (2): e89605. doi: 10.1371 /journal.pone.0089605
Editor: Zhongjun Zhou, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 10 Octubre, 2013; Aceptado 22 de enero de 2014; Publicado: 27 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Taguchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por Tokio IGAKUKAI (KK), la Ciencia y la Tecnología de la Agencia Japón Precursor de Investigación para la Ciencia y la Tecnología embrionarias (PRESTO) (MA), el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (MA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El microambiente tumoral se compone de células endoteliales microvasculares, células epiteliales normales adyacentes y los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF), y se informó de que un regulador importante de la tumorigénesis [1], [2]. A medida que la población celular más común encontrado en el microambiente tumoral, CAF son responsables de la síntesis de las proteínas implicadas en la remodelación de la matriz extracelular (ECM), y para la secreción de factores de crecimiento y citocinas que regulan la proliferación de células tumorales y la invasión [3 ], [4]. En modelos de xenoinjerto de cáncer de ovario de murino, la p53 /NF-kB vía en CAF aumentó significativamente en el crecimiento del tumor in vivo [5]. En el cáncer de colon, Zhu Y et al. informe que la IL-1β aumento de la proliferación de células de cáncer de colon y la invasión por hasta la regulación de COX-2 de señalización en CAF [6].
metaloproteinasas de matriz (MMP) se sintetizan como proenzimas y típicamente activan mediante la eliminación proteolítica de una propéptido [7]. MMPs son reportados para influir en la progresión del tumor, facilitando acontecimientos fundamentales para la neovascularización y el establecimiento de metástasis a distancia incluyendo la proliferación, la supervivencia y la migración endotelial, tumor y las células del estroma [8], [9]. MMP-2 y MMP-9 están implicados como requisitos previos para la angiogénesis y la metástasis en el proceso carcinogenesic. MMP-2 se expresa en las diversas líneas celulares de cáncer [10]. Por el contrario, MMP-9 tiene muy poca o ninguna expresión en estas células de cáncer. En lugar de ello, MMP-9 es bien conocido que se secreta a partir de fibroblastos estromales del cáncer y las células endoteliales [11], [12]. MMP-9 es un miembro de una familia de endoproteinasas de cinc que contiene que está implicada en la degradación de la matriz extracelular (ECM) y en la remodelación vascular [13].
El ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3) y el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3) son mediadores representativos de ácidos grasos omega-3 los ácidos grasos poliinsaturados (omega-3 PUFAs) y ejerce efectos anti-inflamatorios en las reacciones inflamatorias patológicas agudas y crónicas al contrarrestar la inflamación [14]. Los omega-3 PUFAs también hay informes de efectos contra el cáncer basadas en estudios in vitro como in vivo [15] - [17]. Se han propuesto varios mecanismos para explicar los efectos anticancerígenos de PUFAs omega-3. PUFAs omega-3 alteran el crecimiento de células tumorales mediante la modulación de la replicación celular, interfiriendo con los componentes del ciclo celular o mediante el aumento de la muerte celular a través de necrosis o apoptosis [18], [19]. También son conocidos omega-3 PUFAs para ejercer efectos anti-angiogénicos mediante la inhibición de la producción de muchos mediadores angiogénicos incluyendo: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y la prostaglandina E2 (PGE2) [20] - [24].
la suplementación dietética es un enfoque tradicional de modificar la composición de nutrientes del tejido en estudios con animales de la nutrición. La alimentación de animales dietas que alteran los componentes nutricionales y no nutricionales específicos pueden ayudar a diferenciar los grupos experimentales; sin embargo, puede ser extremadamente difícil proporcionar dietas que son idénticos en todos menos en un único o un número pequeño pero controlada de componentes. Kang et al. recientemente diseñado un ratón transgénico que lleva el gen de la grasa-1 de la lombriz intestinal
Caenorhabditis elegans
[25]. Este gen codifica una desaturasa de ácidos grasos omega-3 que cataliza la conversión de ácidos grasos omega-6 y omega-3 PUFAs y que está ausente en la mayoría de los animales, incluidos los mamíferos. Hay una notable diferencia en los ácidos grasos omega-6 /omega-3 PUFA relación entre el tejido de tipo salvaje y-1 grasa ratones transgénicos [26]. Fat-1 ratones, que normalmente exhiben una proporción equilibrada de ácidos grasos omega-6 y omega-3 PUFAs en sus tejidos y órganos independientes de la dieta, permiten estudios que se realizaron en ausencia de factores de confusión potenciales de la dieta cuidadosamente controladas. Esto los convierte en un modelo útil para investigar las propiedades biológicas del endógenos PUFAs omega-3 [25]. Varios informes que utilizan ratones gordos-1 han demostrado efectos anticancerígenos de PUFA omega-3 [27] - [30]. En estas investigaciones, omega-3 PUFAs ejerce efectos contra el cáncer mediante la supresión de reacciones inflamatorias y secreción de PGE2 de las células cancerosas. Hasta la fecha, hay pocos estudios que investigan la implicación de los PUFAs omega-3 en la biología de los CAF.
En este estudio, la hipótesis de que los ácidos grasos omega-3 PUFAs pueden alterar microambientes tumorales, influyendo en la actividad de la CAF. Para examinar esta hipótesis, los fibroblastos derivados de ratones de tipo de grasa-1 y silvestres se evaluaron tanto in vitro como in vivo en condiciones que permitan la interacción con células TC-1 de cáncer. células TC-1 se obtuvieron a partir del epitelio de /6 ratones C56BL y inmortalizados por el virus del papiloma humano (VPH) tipo 16 oncoproteínas E6 y E7. Ellos son comúnmente utilizados in vitro e in vivo en modelos murinos de cáncer relacionado con el VPH [31]. A continuación, se determinó la participación de omega-3 PUFAs en TC-1 tumorigénesis mediante la comparación de los ratones de tipo de grasa-1 y silvestres. Nuestro enfoque específico implicado el estudio de los fibroblastos asociados al tumor. Estos modelos son útiles en el estudio de los CAF ya que las células cancerosas se originan en epitelio de tipo murino salvaje mientras que los componentes del estroma cáncer, incluyendo los CAF, provienen de la grasa-1 (omega-3 PUFAs ricos) o de tipo salvaje (PUFAs normales) ratones.
Materiales y Métodos
Animales y dieta
Fat-1 ratones fueron creados en un fondo C57BL /6 como se describe [26] y, posteriormente, backcrossed (al menos cuatro veces) sobre un fondo 6 /C57BL. Los animales fueron alimentados con una dieta especial (AIN-76A + 10% de aceite de cártamo; CLEA Japan, Inc.) que contenía 10,3% de grasa total, con composición de ácidos grasos de C16:0 (7,6%), C18:0 (2,7%), C18 :1n-9 (14,1%), C18:2n-6 (73,2%), C18: 3n-3 (0,3%), C20:4n-6 (& lt; 0,1%), C20:5n-3 (& lt; 0.1 %), C22: 6 n-3 (& lt; 0,1%), alta en n-6 y baja en ácidos grasos n-3, hasta la edad deseada (6-8 semanas) para los experimentos. Para evitar la oxidación de los lípidos en la dieta, todos los alimentos fueron almacenados en el refrigerador con antioxidantes (AGELESS; Mitsubishi Gas Chemical Inc.), y se prepararon nuevas cada dos días. Los estudios con animales fueron aprobados por la Universidad de Tokio Comité animal.
ensayo de crecimiento tumoral en ratones
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6 murino TC-1 se suspendieron en 100 l de DMEM. El volumen del tumor, basándose en mediciones de la pinza, se calculó a los 7 y 14 días después de la inyección de acuerdo con la siguiente fórmula: (volumen de tumor) = 1/2 × (el diámetro más corto)
2 × (el diámetro más grande). Los ratones fueron sacrificados 14 días después de la inoculación, se extirparon los tumores y se almacenaron a -80 ° C para análisis futuros.
cDNA microarray
Total RNA de tumores TC-1 (arriba) fue extraído por medio de una RNeasy MINIKIT (Qiagen, Hilden, Alemania). Para el análisis de microarrays de cDNA, 0,5 g de ARN total combinado fue amplificados y marcados utilizando un kit de Amino alil MessageAmpTM II mRNA amplificación (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cada muestra de ARNm marcado con Cy3 y el ARNm de referencia marcado con Cy5 se cohybridized a la GeneTM ratón Oligo chip de 24 k (Toray Industries Inc., Tokio, Japón) a 37 ° C durante 16 h. Después de la hibridación, cada chip de ADN se lavó y se secó. Las señales de hibridación derivadas de Cy3 y Cy5 fueron escaneados utilizando Escanear Matriz Express (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.). La imagen escaneada se analizó utilizando GenePix Pro (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Todos los datos analizados fueron escalados por la normalización global. número de acceso GEO es GSE54079.
La inmunohistoquímica
Secciones de parafina (4 m) de tumores TC-1 se dewaxed en xileno y rehidratada a través de etanol escalonadas al agua. Los antígenos fueron recuperados por ebullición en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0) durante 30 min. Las secciones enfriadas fueron incubadas en DAKO VERDADERA solución de peroxidasa-bloqueo (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) durante 10 min para inactivar la peroxidasa endógena. Para bloquear la unión no específica, las secciones se incubaron en solución de proteína de bloqueo de DAKO (DAKO) durante 10 min a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con un anticuerpo policlonal de conejo contra ratón MMP-9 (PAB12714, Abnova, 1:100 dilución) en DAKO VERDADERO Antibody Diluent (DAKO) durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, se lavó, se incubaron con DAB, contraste con hematoxilina, se deshidrataron a través de una serie de etanol y xileno, y se montaron. Para evaluar la formación de microvasos tumor, tumor secciones se tiñeron para CD-31 usando un anticuerpo monoclonal de rata contra ratón CD-31 (ab56299, Abcam, Tokyo, Japón, 1:100 dilución).
RT-PCR cuantitativa ( RT-qPCR)
ARN total fue extraído de TC-1 tumores y fibroblastos cultivados usando un minikit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania), seguido de la transcripción inversa. cDNA se amplificó durante 40 ciclos en un ciclador de luz 480 (Roche, Basilea, Suiza) utilizando un sondas Biblioteca universal Probe (UPL) Sonda Universal Master Mix y los siguientes cebadores y (Roche). Los pares de cebadores y las sondas universales correspondientes a la cada cebador que se utilizaron en las amplificaciones fueron como sigue: ratón β-actina, 5 'ATTGAAACATCAGCCAAGACC-3' y 5'-CCGAATCTCACGGACTAGTGT-3 'probe88; ratón MMP-9, 5'-ACGACATAGACGGCATCCA-3 'y 5'-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3' probe19. La expresión de MMP-9 se normalizó usando ARNm β-actina como patrón interno. Los niveles de expresión se calcularon por el método comparativo Ct utilizando β-actina como un gen endógeno de referencia.
cultivo de fibroblastos primarios y co-cultivo con células TC-1 |
Los pulmones fueron aisladas de la grasa-1 transgénicos y ratones de tipo salvaje y se lavó con solución salina para eliminar las células de la sangre. Aislamiento y cultivo de fibroblastos pulmonares se realizaron utilizando métodos descritos anteriormente [33]. Los tejidos pulmonares se picada en trozos pequeños y se incubaron en DMEM (Gibco, NY, EE.UU.) que contiene colagenasa tipo I (0,25%; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y deoxynuclease I (15 U /ml; Takara, Tokio, Japón) durante 120 minutos a 37 ° C. Las células resultantes dispersado se separaron por filtración a través de filtros de nylon de células (70 micras, BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Se recogieron los fibroblastos en el filtrado, se colocaron en placas de 10 cm en DMEM que contenía 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina y 0,25 mg /l de anfotericina B, y se incubaron durante 7-10 días. Los fibroblastos se purificaron a partir de otra población de células por adherencia diferencial y el paso en serie.
fibroblastos confluentes y las células TC-1 se trataron con tripsina y se resuspendieron en DMEM que contiene 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina, y 0,25 g /ml de anfotericina B y 1 × 10
5 células /ml de células de cada tipo de células se sembraron juntos en placas de cultivo de 12 pocillos. Los co-cultivos se incubaron a 37 ° C 5% de CO2 en una atmósfera humidificada durante 24 horas. culturas homotipica sirvieron como controles.
Gelatina zymography
ensayos de zimografía de gelatina se realizaron utilizando un kit de gelatina zymography (CosmoBio, Sapporo, Japón) de acuerdo con instuctions del fabricante. sobrenadantes de cultivo de células se recogieron y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante libre de células se mezcló con tampón de muestra 2 × y a electroforesis utilizando geles prefabricados (10% de poliacrilamida, 0,1% de gelatina) a 4 ° C durante 1 hora. reacciones Subsequentnzymatic se realizaron a 37 ° C durante la noche. actividades gelatinasa se visualizaron utilizando soluciones de tinción específicas y destained en ácido acético-metanol-DH
2O (01:03:06). Para los análisis semicuantitativos, bandas zimografía de gelatina fueron analizados utilizando el software de análisis de imágenes (ImageJ).
El análisis estadístico
Los datos se presentan como medias ± SEM. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo por el estudiante de
t-test
, o el análisis de Wilcoxon usando el software JMP. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró significativo. En las leyendas de las figuras, asteriscos indican las comparaciones con significación estadística (p & lt; 0,05).
Resultados
El crecimiento del tumor y la angiogénesis de tumores TC-1 se suprime en grasa-1 ratones
Para investigar el efecto de omega-3 PUFAs en la tumorigénesis cáncer de cuello uterino, inyectamos células TC-1 por vía subcutánea en la grasa-1 y la camada compañero de tipo salvaje ratones C57 /BL6. TC-1 las tasas de formación de tumores y el crecimiento del tumor se evaluaron por el número de ratones que forman tumores y tamaños de los tumores de tres dimensiones, respectivamente. No hubo diferencia en las tasas de formación de tumores entre los ratones de tipo salvaje grasa-1 y. TC-1 tamaños de los tumores se trazan durante 14 días en los controles de grasa-1 y de tipo salvaje (Fig. 1). las tasas de crecimiento del tumor fueron consistentemente más bajos en grasa-1 ratones en comparación con ratones de tipo salvaje en todos los puntos. En grasa-1 ratones, el tamaño del tumor a los 14 días después de la inyección fue significativamente menor que en los controles de tipo salvaje (Fig. 1). Aunque el crecimiento celular de las células TC-1 depende de la expresión HPV16 E6 /E7, la expresión de E6 y E7 en los tumores TC-1 no se downregulated en grasa-1 ratones (Fig. S1).
5 × 10
6 murinos en suspensión en 100 l de DMEM se inyectaron sc en cada uno de 10 ratones de tipo de grasa-1 y silvestres. El volumen del tumor, basándose en mediciones de la pinza, se calculó a los 7 y 14 días después de la inyección de acuerdo con la siguiente fórmula: (volumen de tumor) = 1/2 × (el diámetro más corto)
2 × (el diámetro más grande). Se presentan los valores medios con desviaciones estándar. Los asteriscos indican las comparaciones (de tipo salvaje ratones grasa-1 vs) con significación estadística (p & lt; 0,05).
Para definir con mayor precisión los mecanismos detrás de estas diferencias en el crecimiento tumoral en este modelo, particularmente en términos de el posible papel de los componentes del estroma asociadas con el cáncer derivados del huésped, incluyendo los CAF, el próximo examinó si omega-3 PUFAs modificada en la angiogénesis del tumor TC-1. Se evaluó la densidad de los microvasos tumor semi-cuantitativamente en TC-1 tumores derivados de ratones de tipo de grasa-1 y silvestres contando el número de microvasos CD31-positivas en el ensayo de inmunohistoquímica (Fig. 2A y 2B). CD31 inmunotinción de TC-1 tumores derivados de ratones de tipo de grasa-1 y silvestres (Fig. 2A) demostró hipovascularización de los tumores derivados de grasa-1 TC-1 en comparación con los tumores de tipo salvaje derivado. El número de microvasos CD31-positivas por campo de alta potencia en la grasa-1 ratones fue significativamente menor que en los ratones de tipo salvaje (Fig. 2B). Estos datos in vivo indicaron que TC-1 el crecimiento del tumor y la angiogénesis se suprimen al menos en grasa-1 ratones en comparación con sus homólogos de tipo salvaje a pesar de que era difícil estimar con precisión-1 TC crecimiento de las células en ratones de grasa-1.
CD31 inmunotinción de tumor TC-1 derivado de tipo salvaje (WT) ratones (A) y la grasa-1 (B). Las barras indican 200 micras. densidades (C) de microvasos en los tumores TC-1 se expresan como el número representativo de los vasos marcados en 4 campos (n = 5). Se presentan los valores medios con desviaciones estándar. Los asteriscos indican las comparaciones (grasa-1 frente a los ratones de tipo salvaje), con significación estadística (p & lt; 0,05).
MMP-9 es downregulated en grasa-1 ratones derivadas de tumores de CT-1
Para investigar posibles diferencias en los perfiles de expresión génica de TC-1 tumores de crecimiento en la piel de ratones de tipo salvaje grasa-1 y, los tejidos tumorales TC-1 obtenidos a partir de ratones de tipo salvaje grasa-1 y se analizaron por cDNA microarray. Desde PUFAs omega-3 son reportados para influir en la proliferación celular y la inflamación, la Tabla 1 enumera los niveles relativos de expresión génica para los genes representativas asociadas con el crecimiento tumoral y la inflamación (Tabla 1). Con la excepción de EGF, los niveles de expresión de casi todos inflamatoria citocinas /quimiocinas y factores de crecimiento en TC-1 tumores de FAT-1 ratones fueron más altos de los que, en los tumores de los controles de tipo salvaje. Esto sugiere que los efectos anti-inflamatorios y anti-crecimiento de células de omega-3 PUFAs son poco probable que sea el centro de sus actividades anti-tumorales, al menos en este modelo. A continuación examinó la expresión de MMPs en estos tumores TC-1 para controlar mejor la angiogénesis relacionados con estroma en los microambientes del tumor (Tabla 1). cDNA microarray demostró que la expresión de MMP-2 y -9 se suprime en grasa-1 ratones derivadas de TC-1 tumor mientras que los de otras MMP fueron tendían a ser upregulated en comparación con los controles. Para confirmar estos efectos a nivel de ARN, se realizó RT-qPCR para MMP-9. los niveles de MMP-9 de ARN en ratones grasa-1 fueron aproximadamente 60% más bajos que los de los controles de tipo salvaje (Fig. 3A). TC-1 del tumor inmunohistoquímica confirmó estos resultados a nivel de proteína. MMP-9 inmunoreactividad en tumores TC-1 derivadas de ratón de tipo salvaje era claramente más fuerte que la grasa-1 tumores derivados de ratón (Fig. 3B). El poder más elevado análisis histoquímico de la MMP-9 immnoreactivity en las células TC-1 (Fig. 3B, inserciones) reveló expresión insignificante, mientras que la de los componentes del estroma incluyendo los CAF y células endoteliales fue fuertemente positivo sólo en los tumores de tipo salvaje derivada de TC-1 . Estos datos indicaron que la producción de MMP-9 en los CAF y las células endoteliales fue claramente suprimida en ratones grasa-1.
ARN total fue extraído de tumores TC-1, seguido por transcripción inversa. los niveles de MMP-9 mRNA se midieron mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión de MMP-9 se normalizaron a beta-actina como patrón interno (n = 4 en cada grupo). Los asteriscos indican las comparaciones (FAT-1 vs. tipo (WT) ratones silvestres) con significación estadística (p & lt; 0,05). MMP-9 inmunotinción de TC-1 tumores derivados de tipo salvaje (WT) y 1-grasa ratones. Las barras indican 200 micras de campos de baja potencia, 50 micras de campos de alta potencia.
MMP-9 actividad gelatinasa expresión y se suprimieron en fibroblastos primarios cultivadas derivadas de grasa-1 ratones
Para imitar el microambiente del estroma del cáncer in vitro, se cultivaron conjuntamente fibroblastos aislados de ratones de tipo salvaje grasa-1 y con células TC-1. Utilizamos tejidos pulmonares de los ratones de tipo de grasa-1 y silvestres como las fuentes de fibroblastos, y la metodología de la adhesión diferencial para su aislamiento. Todos los fibroblastos se pasaron 3-4 veces antes de su uso en los experimentos. los niveles de expresión en fibroblastos primarios de grasa-1 ratones línea de base 9 MMP-eran aproximadamente un 60% más bajos que los de los fibroblastos de tipo derivado silvestres (Fig. 4A). sobrenadantes de cultivo de cada subtipo de fibroblastos primarios se recogieron y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida para examinar las diferencias en las actividades gelatinasa MMP (Fig. 4B). Usando este método, MMP-2 se detectó pero MMP-9 no era tanto en fibroblastos tipo de grasa-1 y salvaje
(A) fibroblastos primarios aislados a partir de pulmones murinos se cultivaron. El ARN total a partir de fibroblastos fue a transcripción inversa y los niveles de MMP-9 mRNA se midió mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión de MMP-9 se normalizaron a beta-actina como patrón interno. Los datos son los representativos de tres experimentos independientes. Los datos fueron analizados mediante el uso de Student
t-test
. Los asteriscos indican las comparaciones (FAT-1 vs. tipo (WT) ratones silvestres) con significación estadística (p & lt; 0,05). (B) de gelatina zimografía: sobrenadante de cultivos de fibroblastos primarios se recogieron y se separaron por electroforesis. actividades gelatinasa se visualizaron mediante técnicas de tinción estándar.
A continuación, estos fibroblastos primarios fueron co-cultivadas con células TC-1 para examinar la activación de fibroblastos después de la exposición in vitro a las células cancerosas
11. Los fibroblastos y las células TC-1 se co-cultivaron durante 24 horas y MMP-9 de transcripción se midió mediante RT-qPCR. Los fibroblastos de la grasa-1 y de los ratones de tipo salvaje aumentaron demostraron MMP-9 expresión tras la exposición a TC-1 en las células (Fig. 5A). En fibroblastos derivados de ratones de grasa-1, la extensión de la MMP-9 inducción fue inferior a la de los fibroblastos de ratones de tipo salvaje (figura 5A). MMP-9 no se expresó en células homotípicos TC-1, consistente con los datos inmunohistoquímicos de nuestro modelo in vivo. Además, se confirmó que la MMP-9 no se expresó en las células TC-1 mediante el uso de un modelo transwell de co-cultivo (Fig. S2). Por lo tanto, MMP-9 en la condición de co-cultivo se deriva no de las células TC-1, pero a partir de fibroblastos. se detectó MMP-2 la actividad gelatinasa en todas las condiciones de cultivo de células, incluyendo cultivos de células homotipica TC-1, y no se vio alterada por las condiciones de co-cultivo (Fig 5B, 5D). MMP-9 actividades gelatinasa fueron, sin embargo, detectable en fibroblastos-TC-1 de células co-cultivos, aunque-9 MMP actividad gelatinasa participación de grasa 1-fibroblastos fue claramente suprimida en comparación con los fibroblastos de tipo salvaje (Figura 5B, 5C), de nuevo de apoyo el concepto de que MMP-9 expresión y actividad de la gelatinasa se suprimen por endógenos omega-3 PUFAs en CAF derivadas de ratones de grasa-1.
(a) fibroblastos aislados fueron co-cultivadas con células TC-1 durante 24 horas y niveles de expresión de MMP-9 en los fibroblastos se midieron por RT-qPCR. Los niveles de expresión de MMP-9 se normalizaron a beta-actina como patrón interno. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los datos fueron analizados utilizando de Student
t-test
. Los asteriscos indican las comparaciones (FAT-1 vs. tipo (WT) ratones silvestres) con significación estadística (p & lt; 0,05). "N. D." indica "no detectado". (B) de gelatina zimografía: se recogieron y se separaron por electroforesis en sobrenadantes de cultivos homotípicos fibroblastos y fibroblastos /TC-1 co-cultivos. actividades gelatinasa se visualizaron mediante técnicas de tinción estándar. (C, D) Para los análisis semi-cuantitativo, bandas de zimografía de gelatina se analizaron usando software de análisis de imágenes. Los resultados se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes. Los datos fueron analizados utilizando de Student
t-test
. Los asteriscos indican las comparaciones (grasa-1 frente a los ratones de tipo salvaje (WT)) con significación estadística (p & lt; 0,05).
Discusión
En este estudio, hemos examinado la participación de los factores definidos en la dieta (ácidos grasos omega-3 y omega-6 PUFAs) en la tumorigénesis utilizando células positivas para el VPH TC-1 y propuso un nuevo mecanismo antitumoral de los PUFA omega-3 que depende de las actividades de los CAF. AGPI omega-3 se han demostrado para suprimir la incidencia de cáncer y el crecimiento de varios tipos de cáncer [18], [19], [27]. Muchos estudios han demostrado que los omega-3 PUFAs tienen estos efectos a través de las respuestas anti-inflamatorias directamente y /o indirectamente [25] - [27], así como a través de la inducción de la apoptosis de células tumorales y /o la supresión de proliferación de células tumorales [18], [19 ]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre los efectos de omega-3 PUFAs en los CAF. CAF han sido implicados en facilitar el crecimiento de varios tumores por estimulación directa de la proliferación de células tumorales y mediante la mejora de la angiogénesis [34], [35]. Orientación de genes y las vías de señalización que median en la interacción de los CAF y tumor-microambiente se consideran esenciales para el desarrollo de nuevas y efectivas terapias contra el cáncer [36], [37]. En este estudio, el uso de grasa 1-ratones y células tumorales TC-1, hemos sido capaces de aclarar el efecto de los CAF omega-3 PUFA rica en la tumorigénesis.
Muchas moléculas, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas, y MMPs, desempeñan papeles estimuladores e inhibidores en la promoción de la angiogénesis [21]. Se investigó la expresión génica de citocinas relacionadas con la angiogénesis, factores de crecimiento y MMPs en los tumores TC-1 de ratones de tipo salvaje grasa-1 y por cDNA microarray. Los niveles de expresión de casi todos inflamatorias citoquinas /quimioquinas y factores de crecimiento en los tumores TC-1 de ratones grasa-1 fueron mayores que los de los tumores de los controles de tipo salvaje. En contraste, los niveles de EGF y MMP-2 y -9 de expresión en grasa-1 ratones eran más bajos que los de los ratones de tipo salvaje. Dado que la baja regulación de EGF en TC 1-tumores de la grasa-1 ratones se predijo para promover-1 TC proliferación celular, pero el tamaño del tumor en la grasa-1 ratones fue significativamente menor que en los controles de tipo salvaje, la hipótesis de que las diferencias en la producción de MMP entre los ratones de tipo salvaje grasa-1 y puede ser responsable de la supresión de TC-1 crecimiento del tumor. Nuestros datos in vitro verificaron que la MMP-9 derivada de los CAF activados por el TC-1 Exposición de la célula se downregulated en los ratones de grasa-1. MMPs son reportados para influir en la progresión del tumor, facilitando acontecimientos fundamentales para la neovascularización y para el establecimiento de metástasis a distancia incluyendo la proliferación, la supervivencia y la migración endotelial, tumor y las células del estroma [8], [9]. inhibidores de MMP reducir la angiogénesis, el número de tumores, y el crecimiento del tumor, al igual que la ablación genética de la MMP-9 [38]. En contraste con la MMP-2, que se expresa constitutivamente, MMP-9 niveles son generalmente bajos y la enzima expresión es inducida por citoquinas que estimulan NF-kappa B [8], [39]. Además, se reportan elevados los niveles séricos y tisulares de MMP-9 que se asocia con la invasión del cáncer y la metástasis [40]. En el cáncer de mama, la actividad de MMP-9 se ha localizado alrededor de CAF y CAF co-cultivadas con células de cáncer que secretan TGF-β, TNF-α, y otras citocinas, aumentan la producción de MMP-9 [11], de acuerdo con nuestra in vitro datos. En nuestros datos, la supresión de MMP-9 contribuiría a acompañar hipo-angiogénesis en el componente del estroma del tumor en grasa-1 tumor.
varios factores de transcripción, incluyendo activador de la proteína-1 (AP-1), Sp- 1 y NF-kB, se reportan estar implicado en alteraciones en la expresión de MMP-9 tras la exposición a diversas citoquinas [41] - [43]. Por el contrario, varios informes han demostrado que los omega-3 PUFAs tienen un efecto inhibidor sobre la ruta de NF-kappa B cuando es activado por diversos estímulos [43] - [47]. Nuestros propios datos sugieren que la activación de la ruta de NF-kB a co-cultivo con células TC-1 puede ser suprimida por el nivel elevado de ácidos grasos omega-3 PUFAs en fibroblastos obtenidos de ratones de grasa-1.
En nuestros experimentos , se utilizó sistemáticamente fibroblastos primarios que habían sido sometidas a pases 3-4 veces solamente. Sin embargo, el análisis de lípidos mediador de los fibroblastos reveló que los derivados de grasa-1 ratones produjeron grandes cantidades de PUFA omega-3, incluidos los metabolitos derivados de EPA, en comparación con los derivados de controles de tipo salvaje (Fig.S3), lo que confirma que los fibroblastos cultivados conservado la característica para hacer que los omega-3 PUFA rico entorno.
TC-1 datos de microarrays tumor mostraron que varias citocinas /quimiocinas inflamatorias y factores de crecimiento se upregulated en ratones grasa-1. Sin embargo, los datos indicaron niveles de expresión génica tanto en las células TC-1 y los componentes del estroma, incluyendo fibroblastos, células endoteliales y células inmunes. Por lo tanto, los niveles de expresión de cada uno de citoquinas /quimioquinas eran dependientes de sus fuentes primarias de producción. MMP-9 fue producido por los fibroblastos derivados de ratones grasa-1, pero no por las células TC-1. Por lo tanto, la supresión de la ruta de NF-kB por niveles elevados de ácidos grasos omega-3 PUFAs en los componentes del estroma de grasa-1-derivado puede tener un efecto específico y potente en MMP-9 niveles de expresión cuando se compara con las otras citocinas /quimiocinas inflamatorias. Por otro lado, un estudio anterior demuestra que los omega-3 PUFA activan las células NK y aumentan la proporción de células CD8 + activadas; esto es seguido por efectos antitumorales mejoradas [48]. Por lo tanto, PUFAs omega-3 pueden ejercer tanto efectos anti-inflamatorios y pro-inflamatorias en las células inmunes.
En este estudio, hemos demostrado que un microambiente PUFAs ricos en ácidos grasos omega-3 puede suprimir la secreción de MMP-9 de CAF y que esto está asociado con tumor posterior hipo-angiogénesis. Este estudio propone un nuevo efecto antitumoral de omega-3 PUFAs modulando microambiente tumoral especialmente en los CAF.
Información de Apoyo
figura S1.
niveles de expresión de E6 y E7 mRNA en tumor TC-1. ARN total fue extraído de tumores TC-1, seguido por transcripción inversa. los niveles de mRNA de E6 y E7 se midieron mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión de E6 y E7 mRNA se normalizaron a beta-actina como patrón interno. Los cebadores fueron E6 hacia adelante, 5'-TGCACAGAGCTGCAAACAAC -3 ', e inverso, 5'-AGCATATGGATTCCCATCTC -3'. Los cebadores E7 fueron hacia adelante, 5'-TTTGCAACCAGAGACAACTGA -3 ', e inverso, 5'-GCCCATTAACAGGTCTTCCA -3'
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089605.s001 gratis (TIF)
figura S2 .