Una división celular asimétrica produce dos células hijas con diferentes destinos celulares. Este proceso es muy importante para la formación y el desarrollo de cáncer y tiene un potencial terapéutico significativo. Aquí identificamos proteínas de larga vida en la división de células durante el envejecimiento utilizando la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae. Las células de levadura madre se someten a un número limitado de divisiones asimétricas que definen vida replicativa.
En primer lugar? construimos un sistema para identificar las proteínas de larga vida. Se utilizó isótopos estables de pulso-caza y el proteoma total de espectrometría de masas para identificar las proteínas que eran tanto de larga vida y retenido en el envejecimiento de las células madre después de 18? Células divisiones. Se identificaron? 135 proteínas que designamos como proteínas retenidas de forma asimétrica vivido largo (LARPs).
A continuación, damos otro sistema para probar y verificar las proteínas de larga vida. Etiquetar una proteína de interés con el sistema RITE crea una proteína de fusión, que se expresa inicialmente proteína-GFP, a continuación, a través de un evento de recombinación estradiol-inducible, expresa la proteína-RFP. La proteína original se etiqueta verde, y las proteínas posteriores están etiquetados rojo
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Finalmente, la acumulación de algunos LARPs con sucesivas divisiones celulares puede resultar en un incremento efectivo en la dosis de proteína en las células más viejas. Las membranas plasmáticas LARPs pueden ser tanto modificados y aumento en los niveles de células con división sucesiva
proteínas de larga vida contribuyen a fenotipos asociados con la edad y es probable que existen en otros organismos.
La ligasa E3 PARKIN UB es mutado en la enfermedad de Parkinson (PD) y controla la autofagia mitocondrial. funciones Parkin a través de un llamado mecanismo híbrido ANILLO-hect en el que un residuo de Cys en el dominio catalítico RING2 recibe UB de un E2 y lo transfiere al sustrato. Aquí se utiliza la proteómica cuantitativa y imágenes de células vivas para diseccionar los pasos individuales de la ligasa vía de control mitocondrial PINK1 quinasa-UB PARKIN anormal en la enfermedad de Parkinson.
activación PARKIN por PINK1 produce cadenas UB en las mitocondrias, y PARKIN dependiente se requiere ensamblaje de la cadena para la acumulación de poli-fosfo-UB en las mitocondrias. Un tándem de diez compleja masa que marcan experimento proteómico cuantitativo reveló un aumento de 3 veces en la p-S65 UB a los 30 minutos después de la despolarización en PINK1 + /+ embriones de ratón? Fibroblastos (MEFs).
PINK1 promueve la asociación con PARKIN cadenas de poli-UB por fosforilación tanto PARKIN y poli-UB.
UB pueden someterse a extensión de cadena en siete lisinas y la metionina N-terminal, con diferentes destinos para los diferentes tipos de vinculación. PARKIN promueve la síntesis de cadenas de poli-UB canónicos y no canónicos sobre las mitocondrias despolariza de una manera que depende de su catalítica residuo de Cys y S65 dentro de su dominio UBL.
Para resumen, tomamos el poder de la proteómica para El análisis pasos individuales en cascadas de fosforilación complejos UB impulsada. Será de gran utilidad para comprender las vías de señalización-ubiquitylation en el futuro
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