ratón transgénico y de rata se modifican genéticamente animales cuyos genomas están alterados por el uso de técnicas de ingeniería genética. ratones genéticamente modificados se utilizan comúnmente para la investigación o como modelos animales de enfermedades humanas. ¿Cómo los científicos hacen esos animales transgénicos? En general, los investigadores en primer lugar necesitan para construir un transgén con un promotor y un gen estructural. A continuación, se prepara ADN y microinyectó en huevos fertilizados de ratón, y más tarde nacen los ratones o ratas transgénicas. Los siguientes pasos proporcionan un breve resumen de los pasos necesarios para obtener ratones transgénicos o ratas transgénicas.
1. Planificación y Preparación del experimento
Hay que dejar claro que lo que es el propósito. Luego se necesita obtener o clonar el promotor deseado y el gen estructural y para establecer un ensayo de la expresión génica para la investigación específica. La expresión de algunos genes será perjudicial o incompatible con el crecimiento y el desarrollo del embrión. La expresión de un transgén requiere que los elementos de control transcripcional adecuados se incluirán en la construcción de ADN. Estudios preliminares en cultivos de células pueden ser contactados para verificar la integridad de la construcción y la función del promotor.
2. Clon y el verificar la integridad del transgén
Hay varias cosas que debe considerar durante la clonación. El transgén debe contener marcadores únicos de manera que su presencia se puede detectar fácilmente en muestras de ADN de tejidos de ratón y su expresión se puede ensayar y se distinguen de la expresión del gen endógeno. La secuenciación de fragmentos de unión debe llevarse a cabo para confirmar que el transgén tiene un promotor funcional, codón de iniciación, y la señal de poliadenilación. En las mejores circunstancias, el transgén se debe probar para la expresión en un sistema de cultivo celular antes de hacer ratones transgénicos.
3. Establecer un método de cribado
Un ensayo de PCR es muy recomendable para identificar transgénicos animales. Antes de enviar ADN para microinyección en fertilizados de ratón o rata huevos, se debe preparar un ensayo de transferencia de PCR o el sur utilizado para detectar el transgen cuando se enriquece en el ADN de la cola a una concentración de una copia. Un segundo ensayo para detectar un gen de ratón endógeno o se necesita un gen endógeno de rata para demostrar que las preparaciones de ADN están libres de inhibidores de la PCR. Los animales deben ser probados con ambos métodos de análisis para que ningún fundador transgénico se descarta por error debido a que el ADN de la cola está contaminada con inhibidores de la PCR.
4. Establecer un ensayo Expresión
Uno de los enfoques pueden usar RT-PCR , la expresión de ARN mediante hibridación in situ o ensayo de protección de ARNasa con sondas de ARN para lograr la expresión del transgén. La proteína que se produce debe ser diferente de las proteínas normalmente expresadas en el ratón. Hay varias maneras de lograr esto y se puede utilizar un gen informador tal como una proteína fluorescente para visualizar directamente el proceso.
5. Purificación de ADN y microinyección.
kit de extracto de ADN se recomienda para la purificación de ADN microinyección. Pero si se quiere utilizar grandes fragmentos de ADN, hay un protocolo específico para la preparación del ADN de BAC para la microinyección. Numerosas publicaciones muestran que BAC que contiene secuencias del vector procariotas se expresan en niveles fisiológicos en ratones transgénicos. A diferencia de los transgenes a base de plásmidos, la eliminación de las secuencias del vector en no requeridos para los transgenes BAC. construcciones transgénicas se cuantifican a continuación y microinyecciones en óvulos de ratón y quirúrgicamente transferidos a sus destinatarios.
6. Análisis del Sur
El 6 semanas de edad análisis de transferencia de Southern se debe hacer para determinar el número de copias del transgén sitios cromosómicos integrados, y el número del transgén insertado en, y también para verificar el estado transgénico y determinar si el transgén está intacto. Aquellos datos son necesarios para asegurarse de que los fundadores transgénicos con buenas posibilidades de transmisión de un transgén intacta en un único sitio de inserción se pueden seleccionar para la cría intensiva.