: PLOS ONE
Extracto
Aplicaciones
Los ensayos clínicos recientes mostraron que la combinación secuencial de los inhibidores de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina quinasa del factor (EGFR-TKIs) y la quimioterapia podría prolongar la SLP y /o el sistema operativo de avanzada no pequeñas pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) con mutación de EGFR. El objetivo del presente estudio fue evaluar la secuencia de combinación óptima y para explorar su posible mecanismo.
Métodos
PC-9 células y las células A549, las células de adenocarcinoma de pulmón con amplia de tipo mutante y EGFR, respectivamente, fueron tratados con docetaxel /gefitinib solos o en diferentes esquemas de combinación. El estado de EGFR y el gen K-ras se determinó mediante la técnica de PCR cuantitativa-HRM. La proliferación celular se detectó mediante el ensayo de MTT. La expresión y la fosforilación de EGFR, ERK, Akt y IGF-1R se detectaron por transferencia de western. la distribución del ciclo celular se observó por citometría de flujo
Resultados
Sólo la administración secuencial de docetaxel seguido por gefitinib (D → G) inducida significativo efecto sinérgico en ambas líneas celulares. (índice de combinación & lt; 0,9). La secuencia inversa (G → D) resultó en una interacción antagonista en ambas líneas celulares (IC & gt; 1,1), mientras que la administración concurrente (D + G) mostró aditivo (0,9 & lt; CI & lt; 1,1) efecto -synergistic en células PC-9 y efecto antagonista de aditivos en las células A549. estudios Mecanismo mostraron que la fosforilación docetaxel inducida de EGFR y ERK fue reprimida por gefitinib utilizado posteriormente, pero no por la exposición concurrente de gefitinib. La fosforilación gefitinib reprimida de EGFR y ERK se invirtió ni por concurrente, ni por la posterior administración de docetaxel. D + G reforzó su inhibición de la fosforilación de IGF-1R en células PC-9.
Conclusiones
Los fármacos citotóxicos seguido de EGFR-TKI pueden ser la combinación óptima para efectos antiproliferativos en EGFR células de NSCLC -mutant, y la fosforilación de EGFR y ERK pueden contribuir a este efecto
Visto:. Chen B, Zheng J, Zeng y, Li B, Xie B, Zheng J, et al. (2014) dependen de la secuencia efectos antiproliferativos de gefitinib y docetaxel en células no pequeñas Cáncer de pulmón microcítico (CPNM) y el Mecanismo posible. PLoS ONE 9 (12): e114074. doi: 10.1371 /journal.pone.0114074
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Junio, 2014; Aceptó 3 de noviembre de 2014; Publicado: 4 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov (Nº 81172225, 81101821 y 81000819.). cn /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Es bien sabido que para el tratamiento del NSCLC avanzado, de crecimiento epidérmico receptor del factor inhibidor de la tirosina quinasa (TKI del EGFR) y la quimioterapia se recomienda como tratamiento de primera línea para los pacientes con mutación de EGFR activa y el tipo salvaje EGFR, respectivamente. Esta recomendación se basa en los resultados de un ensayo aleatorizado de fase III IPASS en el que los pacientes con mutaciones de EGFR que recibieron gefitinib habían aumentado la supervivencia libre de progresión (PFS 24,9% vs. 6,7%), la tasa de respuesta (RR 71,2% vs. 47,3%) y calidad de vida en comparación con aquellos que recibieron quimioterapia [1]. Sin embargo la aplicación de la quimioterapia basada en platino y EGFR-TKI ha alcanzado una meseta terapéutica. Aunque no hay nueva revisión aparece en la última directriz, algunos de fase III de ensayos clínicos, incluyendo FASTACT-2 [2] e informar a [3] han dado un paso más allá y mostró que la quimioterapia combinada con EGFR-TKI en horarios específicos podría mejorar el pronóstico, especialmente en pacientes con mutaciones de EGFR. En consecuencia, nos supondrá que mejoras adicionales podrían provenir de los resultados del nuevo objetivo, la superación de la tolerancia EGFR-TKI y la combinación de EGFR-TKI con quimioterapia ya que los mecanismos de su actividad antitumoral son diferentes.
para el tratamiento de combinación, básicamente tres horarios se discutieron en los últimos ensayos clínicos: 1. administración concurrente; 2. quimioterapia seguida de EGFR-TKI; 3. EGFR-TKI seguida de quimioterapia. AVERÍA-2, tributo y talento estudios mostraron que la tasa de respuesta y la supervivencia global (SG) favorecieron la combinación simultánea sólo en pacientes EGFR mutante, pero no en la de tipo salvaje o pacientes no seleccionados [4] - [6]. WJTOG0203 e informar a los ensayos demostraron que la administración secuencial de quimioterapia seguida de EGFR-TKI parecía beneficioso para la población no seleccionada (con mejorado significativamente SG y SLP) [7], [3]. Otra FASTACT-2 estudio de fase III informó recientemente de que la quimioterapia intercalado y erlotinib fue otra opción de primera línea viable para los pacientes con EGFR desconocido. Se demostró que la SLP y la SG fueron significativamente prolongada con quimioterapia más erlotinib frente a la quimioterapia más placebo (PFS: 7,6 m frente a 6,0 m, P & lt; 0,0001; OS: 18.3 m vs. 15,2 m, P = 0,042). El beneficio fue incluso mayor para los pacientes EGFR mutante [2]. Por el contrario, Kanda et al demostraron en un estudio de fase II que gefitinib seguida de quimioterapia adquirido una mejor SLP en los pacientes EGFR mutante en comparación con los informes anteriores utilizando gefitinib solo como el tratamiento de primera línea [8]. Sin embargo, por ahora ningún ensayo clínico ha comparado los tres horarios entre sí y dicho cuál era óptima. En este sentido, el primer objetivo del presente estudio es averiguar el mejor esquema de tres estrategias diferentes de combinación de docetaxel y gefitinib.
Por otra parte, el mecanismo celular de efecto dependiente de la secuencia de gefitinib en combinación con agentes quimioterapéuticos sigue siendo una pregunta abierta. Algunos estudios anteriores indicaron que el efecto sinérgico inducido por secuencialmente administrada EGFR-TKI siguientes agentes citotóxicos podrían correlacionarse con la fosforilación de EGFR, mientras que un efecto antagonista de EGFR-TKI seguida de quimioterapia se relaciona con la regulación de la distribución del ciclo celular [9], [ ,,,0],10]. Por otra parte, las investigaciones recientes informaron que el factor de crecimiento similar a la insulina del receptor-1 (IGF-1R) afectó a la sensibilidad de las células a la quimioterapia, así como EGFR-TKI a través de la regulación de la vía de señalización tales como PI3K /AKT y Mark /ERK [11], [12]. Basándose en estos hallazgos, nuestro segundo objetivo es indagar en el mecanismo celular de los efectos dependientes de la secuencia de docetaxel y gefitinib en las células de cáncer de pulmón a través de la evaluación de los posibles cambios en las vías de señalización por encima y en la distribución del ciclo celular.
Materiales y Métodos
Materiales
El gefitinib (Astra Zeneca, Reino Unido) y docetaxel (Sanofi Aventis, Francia) se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich, EE.UU.) y se almacenaron a - 20 ° C. Los fármacos se diluyeron en medio fresco antes del experimento, y la concentración final de DMSO no superó nunca el 0,1%.
Cell Cultura y
pulmón humano A549 de células de adenocarcinoma y PC-9 [13] fueron amablemente dado por el Instituto de Bioquímica y Biología celular (Shanghai, china) y el hospital Nacional del Centro del cáncer de Japón (Tokio, Japón), respectivamente. El estudio fue aprobado por el comité de ética y de la junta de revisión de nuestro hospital. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino al 10% (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) en un ambiente humidificado (Forma Scientific, Marietta, OH, EE.UU.) que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C .
identificación de EGFR y el gen K-ras estado
ADN se extrajo de las células A549 y PC-9 utilizando el kit de tejido QIAmp (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los exones 18, 19, 20 y 21 del gen EGFR, así como los exones 2 y 3 del gen K-ras se detectaron utilizando cuantitativa de alta resolución PCR de fusión técnica (qPCR-HRM).
ensayo MTT
A549 y células PC-9 se sembraron en placas de 96 pocillos (10
4 células por pocillo) y se dividieron en 6 grupos y se trataron de la siguiente manera: 192 El grupo de control (C): se incubaron las células con PBS durante 72 h; grupo 193 Docetaxel (D): células fueron tratadas con docetaxel durante 72 h; 194 grupo Gefitinib (G): las células se trataron con gefitinib durante 72 h; grupo Docetaxel → Gefitinib (D → G): las células se incubaron con docetaxel durante 24 h seguido de gefitinib durante 48 h; grupo Gefitinib → Docetaxel (G → D): las células se incubaron con gefitinib durante 48 h seguido de docetaxel durante 24 h; grupo concurrente (D + G): Las células se incubaron simultáneamente con docetaxel y gefitinib para 72 h. La proliferación celular se determinó por el ensayo MTT. La densidad óptica (DO) a 490 nm se determinó usando un 96 pocillos MultiScanner auto-lector (Dynatech MR 5000). Cada ensayo se realizó por triplicado. Tasa de inhibición% = 100% - (OD
test-DO
en blanco) /(OD
Control-DO
en blanco) × 100%. Cada experimento se repitió por triplicado.
Cálculo del índice de combinación (CI)
Los efectos antiproliferativos del tratamiento combinado fueron evaluados por índice de combinación (CI). Las células se trataron con tres secuencias diferentes como se mencionó anteriormente: D → G; G → D; D + G. Las dosis de los fármacos se combinaron usando relaciones constantes de los valores de CI50 calculados a partir de ensayo de MTT. Por lo tanto, se utilizó 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 y 4 veces de dosis de IC50 de docetaxel y gefitinib. Los resultados de los tratamientos secuenciales se analizaron de acuerdo con el método de Chou [14]. El valor de CI se calculó usando software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, EE.UU.), con CI & gt; 1.1, CI = 0,9-1,1 y CI & lt; 0,9 indica antagonismo, efectos aditivos y sinérgicos, respectivamente. Cada experimento se repitió por triplicado.
Western blot
A549 y células PC-9 se lisaron en tampón que contenía inhibidores de proteinasa. Se obtuvo la proteína total de las células usando el extracto Kit Nuclear (Active Motif Corp, EE.UU.). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Las muestras que contienen 100 mg de proteína total se sometieron a electroforesis en un 10% SDS-PAGE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa mediante electrotransferencia. Las transferencias se probaron utilizando los siguientes anticuerpos: anti-EGFR (1:1000; Santa Cruz, CA), anti-fosforilado-EGFR (1:1000), anti-ERK1 /2 (1:600), anti-fosforilado-ERK1 /2 (1:600), anti-AKT (1:1000), anti-fosforilado-AKT (1:1000), anti-IGF-1R (1:600), anti-fosforilada-IGF-1R (1:600 ) y el anticuerpo anti-β-actina (1:800) (todos los anticuerpos anteriores eran de Cell Signaling Technology, EE.UU.), seguido de incubación con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (Santa Cruz, CA, ESTADOS UNIDOS). Las transferencias se visualizaron mediante un kit de quimioluminiscencia (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cada experimento se realizó por triplicado.
Análisis del ciclo celular
p>
El análisis estadístico
Se analizaron las diferencias entre las medias con ANOVA y los datos se expresaron como media ±
SD
. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0 (Chicago, IL). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
EGFR y estado del gen K-ras en líneas celulares A549 y PC-9
técnica qPCR-HRM mostró que las células A549 albergaban una mutación en los exones K-ras 2 y ninguna mutación en el gen EGFR. las células PC-9 albergaban una mutación de EGFR en los exones 19 y ninguna mutación en K-ras, que estaba de acuerdo con estudios anteriores [13].
Efectos de los diferentes esquemas de exposición de gefitinib y docetaxel en la proliferación celular
ensayo MTT mostró que el docetaxel (10
-4 M~10
-10 M) o gefitinib (10
-4 M~10
-8 M para las células A549; 10
-4 M~10
-10 M para PC-9 células) por sí sola inhibe significativamente la proliferación de A549 y células PC-9 en una forma dependiente de la dosis (
P
& lt; 0,05). El IC
50 de docetaxel y gefitinib fueron 2,05 × 10
-7 mol /L y 1,22 × 10
-5 mol /L Respe ctively para las células A549 (Fig. 1A), y eran de 2,41 × 10
-8 mol /L y 5,65 × 10
-8 mol /L, respectivamente, para las células PC-9 (Fig. 1B). En particular, el efecto inhibidor de gefitinib en células PC-9 fue casi 10
3-pliegues más fuerte que en las células A549 (
P Hotel & lt; 0,05).
Las células fueron tratadas con concentraciones de gradiente (10
-4 M~10
-10 M) de gefitinib o docetaxel durante 72 h. La proliferación celular se determinó por el ensayo MTT. células A549 (A); (B) las células PC-9. *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo control.
Barras
: ± SD, n = 3.
A continuación, evaluamos los efectos antiproliferativos de los diferentes esquemas de exposición de gefitinib y docetaxel en los receptores EGFR-TKI resistente (A549) y EGFR líneas celulares -TKI sensible (PC-9). Como se muestra en la figura 2, solamente la administración secuencial de docetaxel seguido por gefitinib (D → G) indujo un claro efecto sinérgico (CI & lt; 0,9) en ambas líneas celulares (efectos inhibidores en IC
50 fueron 60,00 ± 4,90% para A549 y 62,15 ± 3,84% para las células PC-9). Por el contrario, la secuencia de G → D dio lugar a una interacción antagonista (IC & gt; 1,1) en ambas líneas celulares. La administración concomitante de docetaxel y gefitinib (D + G) mostró antagónica y aditivo (0,9 & lt; CI & lt; 1,1) efectos en las células A549 como la concentración de fármaco aumentó; . Mientras que en las células PC-9, D + G mostró efectos aditivos en combinación a dosis baja y efectos sinérgicos en la combinación de alta dosis
Las células fueron tratadas con tres secuencias diferentes de gefitinib y docetaxel (D → G; G → D ; D + G). Las dosis de los fármacos se combinaron usando relaciones constantes de los valores de CI50 (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 y 4 veces de IC50). (A, B) La tasa de inhibición se determinó mediante el ensayo de MTT. *
P Hotel & lt; 0,05, D → G → G frente a D;#
P Hotel & lt; 0,05 D → G frente a D + G. La secuencia D → G produce el efecto inhibidor más potente. (C, D) El índice de combinación (IC) se calculó usando software CompuSyn. Sólo la secuencia de D → G mostró un efecto sinérgico. (D-G) docetaxel seguido de gefitinib; (G-D) gefitinib seguido de docetaxel; (D + G) docetaxel y gefitinib administran al mismo tiempo.
Barras
: ± SD, n = 3.
Efectos de los diferentes esquemas de exposición de gefitinib y docetaxel en vías de señalización celular
sondeó más en el posible mecanismo del efecto dependiente de la secuencia de gefitinib y docetaxel. La Figura 3 mostró que para ambas líneas celulares, docetaxel solo aumentó la fosforilación de EGFR y ERK, mientras que gefitinib solo reprimen la fosforilación de estas dos proteínas. Para el horario D → G, la fosforilación docetaxel-mejorada de EGFR y ERK fue reprimida significativamente por gefitinib utilizado posteriormente, y este efecto inverso era mucho más fuerte en PC-9 células EGFR mutante. Por el contrario, en lo que se refiere a los horarios de G + D y G → D, la fosforilación gefitinib-reprimido de EGFR y ERK se invirtió por la administración simultánea ni ni subsiguiente de docetaxel.
La expresión y la fosforilación de algunas moléculas de representación en vías de señalización celular correlacionados incluyendo EGFR, ERK, Akt y IGF-1R se detectaron por transferencia de western. células A549 (A); (B) las células PC-9. (C) grupo de control; (D) docetaxel solo; (G) gefitinib solo; (D-G) docetaxel seguido de gefitinib; (G-D) gefitinib seguido de docetaxel; (D + G) docetaxel y gefitinib administrado simultáneamente.
Horarios
Tanto D → G y D + G, inhibió la fosforilación de IGF-1R en células PC-9, mientras que en las células A549, tal inhibición efecto apenas se detecta. Por el contrario, G → horario D aumentó la fosforilación de IGF-1R en ambas líneas celulares. Además, ninguno de los tres horarios mostró un efecto detectable sobre la expresión y la fosforilación de AKT.
Efectos de diferentes horarios de gefitinib y docetaxel en el ciclo celular distritution
Figura 4 mostraron que para PC-9 células, gefitinib solo indujo significativa G
0 G
1 detención /fase de la comparación con el grupo control (86,94 ± 2,33% frente a 57,32 ± 3,79%,
P Hotel & lt; 0,05); mientras que el docetaxel solo indujo significativa G
2 /M fase de la detención (45,67 ± 3,90% frente a 15,54 ± 2,57%,
P Hotel & lt; 0,05). D → G también detenido significativamente el ciclo celular en G
2 /M fase (56,31 ± 1,86% frente a 15,54 ± 2,57%,
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, G → D mostró más que una tendencia al aumento de G
0 /G
1 fase (74,39 ± 2,78% frente a 57,32 ± 3,79%,
P & gt; 0,05
).
Los efectos de los diferentes esquemas de administración de gefitinib y docetaxel en la distribución del ciclo celular se detectaron mediante citometría de flujo. (C) grupo de control; (D) docetaxel solo; (G) gefitinib solo; (D-G) docetaxel seguido de gefitinib; (G-D) gefitinib seguido de docetaxel; (D + G) docetaxel y gefitinib administran al mismo tiempo. *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo control. n = 3.
Para las células A549, gefitinib solo no tuvo efectos notables sobre la distribución del ciclo celular, mientras que el docetaxel solo indujo significativa G
2 /M fase de la detención comparación con el grupo control (49,58 ± 2,70 vs. 6,87 ± 1,35%,%
P Hotel & lt; 0,05). D → G también detenido significativamente el ciclo celular en G
2 /M fase (60,74 ± 3,57% vs. 6,87 ± 1,35%,
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, G → D mostró más que una tendencia al aumento de G
0 /G
1 fase (78.42 ± 2.52% frente a 72,13 ± 3,89%,
P & gt; 0,05
).
Discusión
El presente estudio investigó los efectos antiproliferativos dependientes de la secuencia de gefitinib y docetaxel en tres horarios distintos de combinación, tanto en células PC-9 (mutante de EGFR, K-ras WT) y las células A549 (EGFR WT, K-ras mutantes). Cuando gefitinib y docetaxel fueron utilizados solo en las dos líneas celulares, el efecto inhibidor de gefitinib en células PC-9 fue dramáticamente más fuerte que en las células A549, que fue de acuerdo con los informes anteriores [1]. Sin embargo, la IC50 de gefitinib era sólo la mitad en PC-9 comparación con la de A549; mientras que en el trabajo clínico, gefitinib es mucho más eficaz para los pacientes con mutación de EGFR de docetaxel. Supusimos que esto podría ser debido a que en
en
Estudio in vitro
, los agentes de ensayo se aplicaron directamente sobre las células diana, pero en
en
in vivo
estudio los agentes se dan generalmente a través del sistema de circulación, lo que podría afectar a la distribución y concentración de los diferentes agentes.
Nuestros resultados también demostraron que el docetaxel seguido de gefitinib (D → G) fue significativamente superior a otros modos en lo que se refiere a la efectos anti-tumorales no sólo en el mutante EGFR y células K-ras WT PC-9, pero también en EGFR WT y K-ras células A549 mutante. Esto estaba de acuerdo con varios estudios preclínicos que incluyeron un panel de diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón tratados con quimioterapia /EGFR-TKI e informó de que la secuencia de la quimioterapia → EGFR-TKI tenía ventaja sobre otras modalidades [8], [9], [ ,,,0],15]. Algunos clínicos de fase III de ensayos incluidos WJTOG0203, informar y FASTACT-2 también validó que la administración secuencial de quimioterapia seguida de EGFR-TKI mejoró notablemente el resultado [4] - [6]. Por lo tanto, nuestros resultados producen un fuerte apoyo preclínico para superar la meseta terapéutica de EGFR-TKI y la quimioterapia, y podrían ser especialmente importante para combatir contra el CPCNP refractario. Es necesario hacer notar que en el presente estudio, el sinergismo D → G también se observó en líneas celulares de tipo salvaje de EGFR. Aunque también resultados similares fueron reportados por algunos ensayos preclínicos y clínicos [8], [16], [17], muchos más datos indicaron que los pacientes con EGFR de tipo salvaje no podían beneficiarse del tratamiento EGFR-TKI [4] - [6] . Nos presume que era porque en nuestras dosis de IC50 estudio de gefitnib para cada línea celular fueron aplicadas, lo que significó un millar de pliegues de gefitinib se utilizó para las células A549 en comparación con PC-9 celdas. Obviamente tales dosis extremadamente altas no podían ser duplicadas directamente en el trabajo clínico, pero relativamente alta dosis de EGFR-TKI ya ha sido tratado en los pacientes con CPNM con metástasis cerebrales y no se reportaron resultados positivos [18], [19]. Debe ser especialmente beneficioso para los pacientes con EGFR de tipo salvaje si modos similares fueron juzgados y tuvieron éxito en tales subgrupo.
En lo que respecta a la administración simultánea de docetaxel y gefitinib, nuestro resultado parecía un poco complicado, con aditivo (0,9 & lt; CI & lt; 1,1) -synergistic efecto observado en PC-9 células y efecto antagonista de aditivos en las células A549. Esto indicó que D + G fue más eficaz en las células mutantes de EGFR que en las células de tipo salvaje. Estos datos corresponden a otros informes preclínicos que indicaban que el estado del gen EGFR podría ser un predictor de la actividad de la combinación simultánea [9]. Aunque fase temprana III de ensayos no mostraron ventaja de la combinación simultánea de quimioterapia + EGFR-TKI sobre la quimioterapia sola en pacientes no seleccionados, un análisis de subgrupos de HOMENAJE demostró que el erlotinib simultáneamente en combinación con la quimioterapia confirió una tasa de respuesta muy alta en los pacientes con EGFR mutante que los pacientes con EGFR de tipo salvaje (53% vs. 18%,
P Hotel & lt; 0,01) [20]. Por lo tanto nos supondrá que para la combinación simultánea, la mutación de EGFR podría predecir un beneficio terapéutico. Del mismo modo, también es necesario para tener en cuenta que las dosis de gefitinib utilizados en las células A549 fue mucho más alta que en las células PC-9, que podrían haber plomo a la D + G inducida por efecto aditivo observado en las células A549.
probaron más en el mecanismo subyacente a la sinergia inducida por el horario D → G. Se ha demostrado que el EGFR-TKI competitivamente atado con EGFR y bloqueó varias vías de señalización aguas abajo que incluyen PI3K /Akt y MARK /Erk, resultó en la inhibición de la proliferación de células tumorales, la vascularización del tumor y la metástasis [21], [22]. Un estudio horario de Jiang et al. reveló que el sinergismo de horario D → G podría estar relacionado con una relación de la fosforilación de MAPK [15]. Nuestros datos muestran que la fosforilación de EGFR y ERK (pEGFR y pERK) fue reforzada por docetaxel y fue suprimida por gefitinib. Cuando se utilizó gefitinib después de docetaxel (D → G), el aumento de docetaxel-pEGFR y Perk fue reprimida por gefitinib utilizado posteriormente. Sin embargo, esta inversión no se detectó en otros dos programas. Esto estaba de acuerdo con Giovannetti de [8] y Van Schaeybroeck de [23] estudios que informaron de que sólo aquellas células exhiben una mayor pEGFR podría beneficiarse de forma secuencial utilizado EGFR-TKI. Por lo tanto, se sugirió que la quimioterapia inducida por la sobre regulación de pEGFR y Perk reforzó la sensibilidad de las células de cáncer de pulmón a los usados posteriormente EGFR-TKI, y finalmente dio lugar a mejores resultados.
Western blot mostró también que indujo a gefitinib represión de pEGFR y pERK no se invirtió por la exposición concurrente de docetaxel, por lo tanto se supone que gefitinib fallaron para reforzar el efecto inhibidor de docetaxel utilizado simultáneamente debido al bajo nivel de pEGFR y pERK en las células A549. Consistentemente, Van Schaeybroeck et al. [24] demostraron que en células de cáncer colorrectal, la baja regulación de pEGFR condujo a la interacción antagónica entre EGFR-TKI y agentes citotóxicos. Por el contrario, se observó actividad sinérgica de la administración simultánea en EGFR células mutantes PC-9. Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados mencionados anteriormente, EGFR y la fosforilación de ERK podría no ser el mecanismo sea posible. Hubo múltiples evidencias que muestran que la expresión de IGF-1R se correlacionó con la sensibilidad de las células a la quimioterapia y EGFR-TKI [25], [26]. La interferencia de la expresión de IGF-1R o la administración de IGF-1R inhibidor mejorado el resultado de agentes citotóxicos y EGFR-TKI, que puede ser correlacionada con la supresión de PI3K /Akt vía [27], [28]. En el presente estudio, D + G, inhibió la fosforilación de IGF-1R en las células PC-9, mientras que en las células A549, como efecto de inhibición era apenas detectada. Por lo tanto, se asumió que la fuerte inhibición de la fosforilación de IGF-1R podría contribuir a la sinergia alcanzada en células PC-9. Otra confirmación está garantizado por la sobre regulación y baja regulación de pIGF-1R en células PC-9.
El G → horario D mostró efecto antagonista tanto en A549 y células PC-9. Sin embargo, la regulación de pEGFR y Perk no dio una explicación plausible como gefitinib inducida por la baja regulación de pEGFR y Perk no fue revocada por la posterior exposición a docetaxel. De acuerdo con estudios previos de otros reseachers '[29], el análisis de citometría de flujo demostró que las células gefitinib disminuyó en S y G
2 /M fase. Esta disminución de las células en fase de proliferación podría atenuar la sensibilidad de las células a utilizar posteriormente docetaxel, que dirige selectivamente en el G
2 /M fase de las células, y dar lugar a efectos antagonistas.
Conclusión
en conjunto, nuestros datos sugieren que entre las modalidades combinadas disponibles en el trabajo clínico, el enfoque más eficaz fue la secuencia de la utilización de agentes citotóxicos seguido de EGFR-TKI. La fosforilación de EGFR y ERK podría haber contribuido a esta sinergia. Sin embargo, ya que sólo dos líneas celulares se inscribieron en este estudio, la expansión de un panel de líneas celulares de cáncer con diferente estado de EGFR, así como la
en
in vivo
estudios sobre modelos animales están garantizados evaluar más a fondo el efecto calendario-dependiente. También vale la pena comparar los tres esquemas de combinación en ensayos clínicos para identificar la posible modalidad de tratamiento "óptima" para los pacientes con NSCLC avanzado.