: PLoS ONE
Extracto
Varios estudios epidemiológicos han correlacionado el uso de medicamentos no esteroides antiinflamatorios (AINE) con un menor riesgo de cáncer de ovario, el cáncer ginecológico más letal, con diagnóstico por lo general en las últimas etapas de la enfermedad. Hemos establecido previamente que el pro-apoptótica diferenciación de citoquinas melanoma asociado gen-7 /interleucina-24 (
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-7 /IL-24) es un mediador crucial de la apoptosis inducida por AINE en la próstata, de mama, renal y las células de cáncer de estómago. En este informe se evaluaron diversos AINE estructuralmente diferentes por sus eficacias para inducir la apoptosis y
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-7 /IL-24 expresión en células de cáncer de ovario. Mientras que varios AINEs inducen la apoptosis, sulindac Sulfuro y diclofenaco más potentemente induce la apoptosis y redujeron el crecimiento del tumor. Una combinación de estos agentes da como resultado un efecto sinérgico. Además,
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-7 /IL-24 de inducción por NSAIDs es esencial para la muerte celular programada, ya que la inhibición de
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-7 /IL-24 por ARN de interferencia pequeño abroga apoptosis.
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-7 /IL-24 de activación conduce a la regulación positiva de la detención del crecimiento y daño en el DNA inducible (División de Género) 45 α y γ y la activación de JNK. La familia NF-kappa B de factores de transcripción se ha implicado en el desarrollo del cáncer de ovario. Hemos establecido con anterioridad la señalización NF-kB /I? B como un paso esencial para la supervivencia celular en las células cancerosas y la hipótesis de que la orientación NF-kB podría potenciar la inducción de apoptosis mediada por AINE en las células de cáncer de ovario. De hecho, la combinación de tratamiento con AINEs con inhibidores de NF-KB condujo a la inducción de apoptosis mejorada. Nuestros resultados indican que la inhibición de NF-kB en combinación con la activación de
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-7 /expresión de IL-24 puede dar lugar a una nueva terapia combinatoria para el cáncer de ovario
Visto:. Zerbini LF, Tamura RE, Correa RG, Czibere A, Cordeiro J, Bhasin M, et al. (2011) Efecto de la combinatoria no esteroides anti-inflamatorios y NF-kB inhibidores en la terapia del cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (9): e24285. doi: 10.1371 /journal.pone.0024285
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 12 Abril, 2011; Aceptado: 5 Agosto 2011; Publicado: 12 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Zerbini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. RET es un recipiente del ICGEB beca post-doctoral. Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R01 CA85467, CA090381 P50, CA105009 P50 y la Fundación Hershey (TAL), subvenciones del NIH 1R01 CA097318, 1R01 CA127641, CA104177 P01, la Fundación de Investigación del Cáncer Samuel Waxman (PBF) y del Departamento de Defensa PC051217 subvenciones y OC0060439 (LFZ). DS es un Académico Harrison en la Investigación del Cáncer y Académico Blick en el VCU Massey Cancer Center y la Escuela de Medicina de VCU. PBF titular de la Cátedra Thelma Newmeyer Corman en la Investigación del Cáncer en el Centro de Cáncer Massey VCU y es un investigador SWCRF. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario representa el cáncer ginecológico más letal y el 5
ª causa principal de muerte de las mujeres relacionado con el cáncer en los Estados Unidos [1]. El diagnóstico tardío es uno de los principales obstáculos para el tratamiento de cáncer de ovario, como casi el 70% de las mujeres actuales, junto con una fase avanzada de la enfermedad en el diagnóstico [2]. Varios estudios epidemiológicos han sugerido que el uso de los AINE en concentraciones clínicamente relevantes reduce colorrectal [3], de mama [4] y los riesgos de cáncer de ovario [5], [6], [7], aunque controversia aún queda [8], [9 ]. Uno de los objetivos principales de la acción NSAID es la inhibición de la ciclooxigenasa (COX), que son responsables de la conversión de los ácidos araquidónico en prostaglandinas y emplean una variedad de diferentes mecanismos. Los dos genes de COX, la COX-1 y COX-2, son casi idénticos; sin embargo, una diferencia importante es que la COX-1 y la expresión es constitutiva, mientras que la COX-2 expresión es inducida por factores de crecimiento y estímulos pro-inflamatorias [10]. Los AINE son típicamente clasificados como inhibidores específicos de COX-2 o inhibidores de la COX no específicos. En el cáncer de ovario COX-1, pero no la COX-2 se ha encontrado que se sobreexpresa [11], [12], sin embargo otros estudios informaron que la COX-2 también es upregulated [13], [14]. Alta COX-1 de expresión en el cáncer de ovario se correlaciona fuertemente con altos niveles de Vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF) [15], [16], [17] y los AINE inhiben la producción de VEGF en líneas celulares de cáncer de ovario [12], [18] que indica que la COX-1 puede regular la expresión de VEGF. La angiogénesis y la expresión de VEGF están implicados en la formación de ascitis [19] y la metástasis de cáncer de ovario [20], mientras que su inhibición evita la formación de ascitis e inhibe el crecimiento del cáncer diseminada [21].
Nuestro estudio anterior demuestra que los AINE también inducen la apoptosis de las células cancerosas a través de la inducción de la
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-7 expresión de IL-24 /[22], lo que lleva a una mayor expresión de dos miembros de la detención del crecimiento y daño del ADN-45 (GADD45) la familia [23]. La familia de genes GADD45 codifica tres proteínas estructuralmente muy relacionados arrestados crecimiento y daño en el DNA inducible, GADD45 α, β y γ jugar un papel en la G2 /M puesto de control en respuesta al daño de ADN [24]. En condiciones fisiológicas normales, la
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-7 /IL-24 se expresa en las células del sistema inmune y melanocitos normales [25]. Los altos niveles de
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-7 /IL-24 se ha demostrado que induce específicamente la apoptosis de las células cancerosas y, por tanto,
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-7 /IL-24 ha sido referido como una "bala mágica" [26], [27]. Por otra parte, varios estudios indican que la sobreexpresión de
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-7 /IL-24 por un resultado de adenovirus recombinantes en la apoptosis de células de cáncer y beneficios terapéuticos en el cáncer de ovario [28], [29].
la señalización de NF-kappa B /I? B es otra vía que se ha implicado en la resistencia a fármacos y la supervivencia en cáncer de ovario [30], [31]. La ruta de NF-kB /I? B está emergiendo como actor clave en la tumorigénesis, invasión y metástasis de diversos tipos de cáncer [30], [31] y es un paso crítico para las células cancerosas para escapar de la muerte celular programada [32]. Además, la resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos se ha asociado con desregulado activación de NF-kappa B [33]. Por otra parte, hemos demostrado que la inhibición de constitutivamente activa NF-kB mediante la expresión adenoviral de I? B induce la apoptosis en células de cáncer de próstata e inhibe la formación de tumores en ratones SCID [34].
En este informe, se comparó un conjunto amplio de NSAIDs por sus eficacias para inducir la apoptosis de las células de cáncer de ovario. Dado que nuestro estudio anterior demostró un papel para
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-7 /IL-24 en la muerte celular mediada por AINE, también se evaluó si la inducción de apoptosis por los AINE se debe a la inducción de la
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-7 expresión /IL-24. la entrega viral de
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-7 /IL-24 se usa actualmente en ensayos clínicos para diversos tipos de cáncer [27]. La identificación de fármacos que son más eficientes en
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-7 /IL-24 de inducción puede proporcionar una alternativa a la entrega viral para explotar los efectos antineoplásicos de
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-7 /IL-24 . También la hipótesis de que la combinación de AINE con inhibidores de la ruta de NF-kB puede aumentar los efectos de los AINE contra el cáncer de ovario. Nosotros, por lo tanto, a prueba los inhibidores farmacológicos de la ruta de NF-kB por sus capacidades para inducir la apoptosis en células de cáncer de ovario. Aquí, demostramos que sulindac Sulfuro y diclofenaco son los más potentes de los AINE que inducen la apoptosis cáncer de ovario a través de
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-7 /expresión de IL-24 y también reducen el crecimiento del tumor
in vivo
.
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-7 /IL-24 conduce a la expresión y la regulación positiva GADD45α γ y la activación de la quinasa JNK. Varios inhibidores de NF-kB farmacológicos también inducen la apoptosis de las células de cáncer de ovario y en combinación con AINE potencian la apoptosis efecto de los AINE.
Resultados
Los AINE son potentes inductores de
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-7 /IL-24 y la apoptosis en células de cáncer de ovario
Un amplio panel de AINE se puso a prueba por su capacidad de inducir la apoptosis y
MDA-página 7 /IL-24 expresión génica de cada cuatro de ovario líneas celulares de cáncer, Skov-3, Caov-3, SW626 y 36M2. Se seleccionaron las concentraciones de todos los fármacos AINE utilizados en este estudio son comparables a las concentraciones fisiológicas alcanzables en plasma [35] - [49]. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento de SKOV-3, Caov-3, las células cancerosas de ovario SW626 y 36m2 con este conjunto de AINE, revelando que una variedad de, pero no todos los AINE indujeron apoptosis (Figura 1a y S1a). Consistentemente fuertes inductores de la apoptosis en todas las líneas de cuatro células incluyen Sulindac sulfuro, diclofenaco, naproxeno Ebselen y en comparación con los controles de disolvente. Algunos NSAIDs resultó en una inducción significativa de la apoptosis en un subconjunto de las líneas celulares de cáncer de ovario incluyendo Sulindac sulfona, acetaminofeno, aspirina y Flurbiprofen mientras que el tratamiento con NS-398, ibuprofeno, Finasteride, ácido flufenámico y Meloxicam dieron como resultado sólo en marginal o ninguna inducción de la apoptosis ( Figura 1a y S1a).
Skov-3 línea celular después del tratamiento con aspirina mM 5, 200 M ibuprofeno, acetaminofeno mM 1, 200 M naproxeno, 200 micras NS-398, 200 mM de diclofenaco, 50 M Finasteride, 200 mM de ácido flufenámico, 40 mM de meloxicam, 50 mM ebselen, 20 nM flurbiprofeno, 50 M sulindac sulfuro y 50 M sulindac sulfona o DMSO como control. ensayo (A) La apoptosis de las células de cáncer de ovario después del tratamiento con AINE. Datos significa S. D. ± de triplicados experimentos independientes para cada tratamiento. inducción (B) dependiente de la dosis de la apoptosis por AINE en las células de cáncer de ovario. ensayo de la apoptosis de las células del cáncer de ovario SW626. Las células se trataron con 50, 25, 10 y 5 M de sulfuro de sulindac; 200, 100, 40 y 20 M de Diclofenac; 200, 100, 40 y 20 M de naproxeno y 50, 25, 10 y 5 M de Ebselen o DMSO. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento. Datos significa S. D. ± de triplicados experimentos independientes para cada tratamiento. (C) Análisis de PCR en tiempo real de
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-7 /IL-24 expresión en células SKOV-3 después del tratamiento de 24 horas con diferentes AINE. Cada muestra se normalizó a hGAPDH. (D) ensayo de apoptosis de Caov-3 células de cáncer de ovario después del tratamiento con AINE o DMSO y la infección por lentivirus codificación
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-7 /IL-24 dúplex de siRNA. Datos significa S. D. ± independiente de la infección por triplicado para cada vector en cada tratamiento.
Para cada uno de los cuatro inductores más consistentes de la apoptosis se determinó la dosis más baja que todavía induce la muerte celular programada de las células de cáncer de ovario. Las concentraciones de los AINEs seleccionados se ensayaron a 2, 5 y 10 veces menores concentraciones que las dosis fisiológicamente alcanzables utilizados en los experimentos para la Figura 1a y S1a. La apoptosis se midió en células de cáncer de ovario 24 horas después del tratamiento con diferentes dosis de los cuatro AINE. Nuestros resultados muestran que las concentraciones de sulfuro de sulindac, diclofenaco y naproxeno, incluso a 5 veces la dosis más baja todavía inducen la apoptosis de manera efectiva, mientras que Ebselen puede reducirse a sólo 2 veces (Figura 1b).
Sobre la base de nuestras observaciones anteriores en otros tipos de cáncer de determinar si la inducción de apoptosis por los AINEs se correlaciona con
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-7 /IL-24 de inducción. Se midió los niveles de mRNA de expresión de
MDA-página 7 /IL-24 mRNA en respuesta a diferentes AINE en Skov-3 células por PCR en tiempo real análisis demuestra que
MDA-página 7 /IL-24 (máximo de inducción 12 veces) la expresión es inducida por AINE comúnmente que promueven la apoptosis en células de cáncer de ovario (Figura 1c). Estos resultados también fueron corroborados en dos líneas celulares de cáncer de ovario adicionales. En Caov-3 y SW626 líneas celulares de cáncer de ovario
MDA-página 7 /IL-24 también está fuertemente inducidos (máximo de inducción de 77 veces en Caov-3 células) (Figura S1b). AINE que aumentaron fuertemente la apoptosis tales como Sulindac sulfuro, naproxeno, ebselen, y diclofenac (Figura 1a) indujo significativamente
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7 /IL-24 expresión (Figura 1c), mientras que los AINE que sólo marginalmente indujeron apoptosis (Figura 1a ) no aumentó significativamente
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-7 /IL-24 expresión, excepto ibuprofeno que indujeron a
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-7 /IL-24, pero no indujo la apoptosis (Figura 1c).
Nosotros y otros han demostrado que la sobreexpresión de
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después de la infección -7 /IL-24 con un adenovirus que lleva la apoptosis
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-7 /IL-24 induce gen e inhibe la proliferación celular en el cáncer de células [50], [51]. Con el fin de evaluar si la inducción de la apoptosis en células de cáncer de AINE depende de
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-7 /IL-24 de la regulación positiva, hemos llevado a cabo experimentos con un lentivirus que codifica un siRNA contra
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-7 /IL-24 que anteriormente se ha generado por nuestro grupo [23]. La infección de SKOV-3 células con el
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-7 /IL-24 siRNA lentivirus reducción de la apoptosis inducida por los AINEs por 40 a 70% con respecto al control lentivirus (Figura 1d), más el apoyo a la idea de que AINE- la apoptosis mediada es al menos parcialmente dependiente de
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-7 /IL-24 de inducción. Los mismos resultados se observaron en Caov-3 células (datos no presentados).
efectos sinérgicos de combinaciones de AINE
Uso de la dosis más baja de cada NSAID que afectó a la apoptosis de las células de cáncer de ovario (Figura 1b ), hemos considerado sistemáticamente inducción de la apoptosis en la combinación de bajas dosis de AINE. Un panel de AINE, incluyendo diclofenaco, Sulindac sulfuro, naproxeno y Ebselen se ensayaron para determinar sus capacidades para inducir la apoptosis solo y en combinación. Skov-3 células de cáncer de ovario se trataron con 10 mM Sulindac sulfuro, 40 mM Diclofenac, 25 mM Ebselen o 40 mM Naproxen y combinaciones de los mismos. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento reveló que la mayoría de las combinaciones de AINE ensayados indujo apoptosis significativamente más que cualquiera de los NSAIDs solos en las células de cáncer de ovario (Figura 2a). Ciertas combinaciones tales como Sulindac sulfuro y diclofenac, sulindac sulfuro y el naproxeno y el diclofenaco y naproxeno fueron más eficaces en la inducción de apoptosis que otros (Figura 2a). Hemos validado estos resultados en líneas celulares Caov-3 y SW626 (Figura S2). análisis de isobolograma utilizando combinaciones de diclofenaco y Sulindac sulfuro indica que las combinaciones de los resultados de drogas en un efecto sinérgico (Figura 2b).
(A) ensayo de apoptosis de células SKOV-3 después del tratamiento con 10 mM Sulindac sulfuro, 40 M Diclofenac, 25 mM Ebselen o 40 mM Naproxen y una combinación de los mismos o DMSO. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento. Datos significa S. D. ± de triplicados experimentos independientes para cada tratamiento. (B) isobolograma normalizado obtenido por el software Compusyn. Caov-3 células tratadas con una combinación de 5 M sulindac Sulfuro y 20 mM Diclofenac muestra efecto sinérgico.
tratamiento con AINE reduce el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de ovario en ratones SCID
Para determinar si los AINE reducir el crecimiento del tumor
in vivo por vía subcutánea
, se inyectaron células SKOV-3 de cáncer de ovario en ratones SCID. Los ratones se dividieron al azar en 3 grupos y se alimentaron una de las tres dietas a través de todo el experimento: AIN-93G como el control y la dieta AIN-93G suplementado con o bien 200 ppm Sulindac sulfuro o 100 ppm Diclofenac. Dos meses más tarde, los animales fueron examinados para la formación de tumores y el peso del tumor. Todos los ratones desarrollaron tumores que indican que esta dosis particular de los AINE no impidió la formación de tumores. Sin embargo, como se ve en la Figura 3, sulindac sulfuro y el tratamiento Diclofenac reducen el volumen medio del tumor en un 30% y 20%, respectivamente, en comparación con la dieta de control con un valor de p & lt;. 0,05, lo que confirma su eficacia anti-tumor
Para cada inoculación, se inyectaron 2 x 10
6 Skov-3 células por vía subcutánea en ratones SCID. Los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 7 /grupo) y se alimentaron una de las tres dietas a través de todo el experimento: AIN-93G como el control, la dieta AIN-93G suplementado con 200 ppm Sulindac sulfuro o la dieta AIN-93G suplementado con 100 ppm Diclofenac. El tamaño de los tumores y tumor de peso se midieron después de 2 meses. Los valores no comparten las mismas letras son estadísticamente significativas con los valores de p, al menos, & lt; 0,05
Inducción de GADD45 α y γ gen de expresión y activación de JNK en el cáncer de ovario en un AINE
. hemos informado anteriormente de que la inducción de la apoptosis por NSAIDs está estrechamente vinculada a la inducción de
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-7 /expresión de IL-24 y, en consecuencia, la regulación positiva α y γ GADD45 en varias líneas celulares de cáncer [23]. Como los AINEs inducen
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-7 /IL-24 expresión en células de cáncer de ovario (Figura 1c) y s1c, se evaluaron los cambios en α GADD45 y la expresión del gen γ.
Para evaluar si la regulación de genes GADD45 está implicado en la apoptosis mediada por AINE, la expresión de GADD45 α y gamma ARNm se midió por PCR en tiempo real en SKOV-3, Caov-3, y células SW626 tratadas con AINE. Los AINE con el más fuerte actividad pro-apoptótica incluyendo sulindac sulfuro, diclofenaco, naproxeno y Ebselen fuertemente mejoradas GADD45 α y γ expresión, lo que indica que el aumento de α GADD45 y γ expresión se correlaciona estrechamente con la actividad pro-apoptótica de los AINE (Figura S3 A y S3 B). lentiviral expresión de siRNA contra
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-7 /IL-24 en células de cáncer de ovario demostró que desmontables de
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-7 /IL-24 reduce α GADD45 diclofenaco inducida y la expresión de genes que indican γ que GADD45α e inducción γ es al menos parcialmente dependiente de
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-7 /IL-24 expresión (Figura S3c).
Dado que los demás y que habíamos demostrado que la activación de JNK desempeña un papel en la apoptosis inducción en las células cancerosas y GADD45 α y γ interactuar con la quinasa aguas arriba de JNK, MTK1 [52], se evaluó la activación de JNK durante la apoptosis mediada por NSAID. la actividad de JNK quinasa se ensayó en los extractos de proteínas obtenidos a partir de Caov-3 y SKOV-3 células tratadas con Sulindac sulfuro (50 mM), diclofenaco (200 mM) o DMSO durante 24 horas por un
vitro
ensayo de quinasa in. El análisis de transferencia Western reveló muy poca actividad de JNK en células de control sin tratar y un fuerte aumento de la actividad de JNK en ambas líneas celulares después del tratamiento con sulfuro de sulindac y Diclofenac (Figura 4a y 4b). Corroborando esta evidencia un inductor débil de
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-7 /IL-24, α GADD45 y γ y la apoptosis, flurbiprofeno, demostrado solamente una inducción marginal de la actividad de JNK (datos no mostrados). Para dilucidar la relevancia funcional de α GADD45 y γ y
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-7 IL-24 para la inducción de JNK NSAID mediada y la apoptosis en el cáncer de ovario, la actividad quinasa de JNK se puso a prueba en los extractos de proteínas obtenidos a partir de
Caov /-3
células tratadas con sulindac Sulfuro y diclofenaco e infectadas con codificación lentivirus siRNA contra α GADD45 y
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-7 /IL-24 genes. Western blot reveló la activación de la quinasa JNK por sulindac Sulfuro y diclofenaco era marcadamente dependientes GADD45 α y
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-7 /IL-24 de inducción, ya que la actividad quinasa JNK en sulindac sulfuro de diclofenaco y tratada
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-7 /IL-24 - /- células se abolió en comparación con
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-7 /IL-24 + /+ células (Figura 4b). Con el fin de caracterizar mejor el efecto de los AINE en la inducción de apoptosis, los niveles de activación de PARP se midieron por Western-blot, lo que indica que Sulindac sulfuro y diclofenaco son inductores potentes de PARP de escisión (Figura S4a).
(A ) lisado total antes de la inmunoprecipitación. (B) Ensayo de quinasa que muestra la inducción de la actividad de la quinasa JNK por los AINEs. La inducción de la activación de JNK por Sulindac sulfuro y diclofenaco se analizó en los lisados celulares de SKOV-3 y Caov-3 células tratadas con 50 mM Sulindac sulfuro, 100 M Diclofenac o DMSO utilizando el kit de ensayo de SAPK /JNK (Cell Signaling). análisis (C) Western Blot usando anticuerpo anti-fosfo JNK de los lisados celulares a partir de células Caov-3 tratados con 50 mM Sulindac sulfuro, 100 M Diclofenac o DMSO y la infección con codificación lentivirus
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-7 /IL-24 siRNA, GADD45α y GFP dúplex.
tratamiento combinatoria de inhibidores farmacológicos de la ruta de NF-kB con AINEs inducen la apoptosis en células de cáncer de ovario
Hemos investigado la relevancia biológica de la NF kappa B ruta en células de cáncer de ovario y determina las consecuencias funcionales de su inhibición. En lugar de utilizar la entrega adenoviral del inhibidor I? B que nos desplazamos hacia un modelo más clínicamente relevante y utilizamos inhibidores farmacológicos de la ruta de NF-kB. Los inhibidores de la ruta de NF-kappa B se ensayaron para determinar sus capacidades para inducir la apoptosis en células de cáncer de ovario. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento de las células de cáncer de ovario SW626 SKOV-3, Caov-3 y con cuatro diferentes inhibidores de NF-kB, 5 nM 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina [53], 50 mM Isohelenin [54], 50 mM IKK-2 inhibidor de SC-514 [55], y 200 mM inhibidor de IKK II wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) [56] o DMSO (control). 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina era un inductor eficaz de apoptosis en las tres líneas celulares, y el inhibidor de IKK II wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) apoptosis inducida en dos de las tres líneas celulares. El tratamiento con Isohelenin o inhibidor de IKK-2 SC-514 dio como resultado sólo en marginal o ninguna inducción de la apoptosis (Figura 5a). Además, en tiempo real el análisis de PCR indica que wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) induce una fuerte activación de la α GADD45 y el gen γ expresión (Figura S4b), y promueve la fosforilación de JNK (Figura S4c) y la escisión de PARP (Figura S4a).
inhibidores (a) farmacológico NF-kB inducir la apoptosis en células de cáncer de ovario. SW626, Caov-3, y SKOV 3 células después del tratamiento con 5 nM 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina (6-amino), 50 mM Isohelenin, 50 mM IKK-2 inhibidor de SC-514, y 200 M IKK inhibidor II wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) o DMSO como control. Datos significa S. D. ± de triplicados experimentos independientes para cada tratamiento. inducción (B) dependiente de la dosis de la apoptosis por los inhibidores de NF-kB en las células de cáncer de ovario. ensayo de apoptosis de células SKOV-3 de cáncer de ovario. Las células se trataron con 5, 2,5, 1 y 0,5 nM de 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina (6-amino) 50, 25, 10 y 5 M de Isohelenin, 50, 25, 10 y 5 M de inhibidor de IKK II wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) (wedelolactona), 50, 25, 10 y 5 M de IKK-2 inhibidor de SC-514 o DMSO. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento. Datos significa S. D. ± de triplicados experimentos independientes para cada tratamiento. (C) la apoptosis en células de cáncer de ovario después del tratamiento con AINE en combinación con inhibidores de NF-kB. SW626, Caov-3, y SKOV-3 células después del tratamiento con 10 mM Sulindac sulfuro, 40 mM Diclofenac, 25 mM Ebselen, 40 mM naproxeno, 1 nM 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolina (6-amino), y 200 mM inhibidor de IKK II wedelolactona y una combinación de los mismos. La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento. Datos significa S. D. ± de triplicados experimentos independientes para cada tratamiento. (D) Normalizado isobolograma obtenido por software Compusyn. Caov-3 células tratadas con una combinación de 10 M sulindac sulfuro de 2,5 nM y 6-amino muestra efecto sinérgico.
En cuanto a los AINE se realizó un análisis de respuesta a la dosis de 6-amino-4- ( 4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina y wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) para determinar la dosis más baja que todavía induce la muerte celular programada de las células de cáncer de ovario. La reducción de la concentración de 6-Amino-4- quinazolina (4-phenoxyphenylethylamino) de 5 nM a 1 nM todavía induce apoptosis, mientras que dosis reducidas de wedelolactona dieron como resultado en la pérdida de la inducción de apoptosis (Figura 5b).
Para determinar si los inhibidores de NF-kappa B 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina y wedelolactona (7-metoxi-5,11,12-trihidroxi-cumestano) mejorar las actividades pro-apoptóticos de AINE que combina las dosis más bajas de cada de los cuatro AINE, sulindac sulfuro, Diclofenac, Ebselen y naproxeno con las dosis más bajas de los dos inhibidores de NF-KB que todavía inducen la apoptosis (Figura 1b y 5b, respectivamente). Los AINEs y los inhibidores de NF-kB se ensayaron para determinar sus capacidades para inducir la apoptosis solo y en combinación. células de cáncer de ovario SKOV-3, Caov-3, y SW626 se trataron con 10 mM Sulindac sulfuro, 40 mM Diclofenac, 25 mM Ebselen, 40 mM naproxeno, 1 nM 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolina y 200 M wedelolactona . La apoptosis se midió 24 horas después del tratamiento revelando que las combinaciones de AINE con el inhibidor de NF-kB 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolina mejora de forma significativa la apoptosis en células de cáncer de ovario en comparación con cualquiera de los fármacos solos (Figura 5c). Por el contrario, wedelolactona mejorarse los efectos pro-apoptóticos solamente de algunos de los AINE y menos eficazmente en células SKOV-3 (Figura 5c). análisis de isobolograma indica que la combinación de 6-amino-4- quinazolina (4 phenoxyphenylethylamino) con resultados Sulindac sulfuro en un efecto sinérgico (Figura 5d).
Discusión
AINE han surgido como fármacos potenciales para la quimioprevención en el cáncer, pero sus beneficios son todavía está en duda. Algunos AINE tradicionales tales como sulindac Actualmente se están probando en ensayos clínicos para diversos tipos de cáncer. De hecho, los estudios preclínicos proporcionan evidencia consistente de que los AINE pueden inhibir eficazmente la tumorigénesis, en particular, a través de la inhibición de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Es importante destacar que el uso de aspirina se ha asociado con un menor riesgo de recurrencia del cáncer de mama distancia y la muerte de cáncer de mama [57].
Los estudios epidemiológicos indican una asociación inversa entre el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y la incidencia de cáncer de ovario [5], [6], [7]. Varios informes sugieren que ciertos AINE inducen apoptosis y detención del ciclo celular en células de cáncer de ovario humano pero el mecanismo molecular exacto por el que los AINE inducen la actividad antitumoral no es clara. Anteriormente, nuestros grupos descrito una nueva vía por la que los AINE inducen la apoptosis y el crecimiento de detención en las células cancerosas. Hemos demostrado que la inducción de la citoquina pro-apoptótica MDA-7 /IL-24 por los AINEs es crucial para la muerte celular programada inducida por AINE [23]. Sin embargo, este estudio no incluye las células de cáncer de ovario.
Varios informes utilizando un adenovirus que codifica el
mda
-7 /gen de la IL-24 (Ad
mda
-7 ) mostrar su actividad contra el cáncer profunda y selectiva en modelos animales [26], [27], [50], [58], [59], [60] incluyendo un informe de la muerte celular inducida selectivamente de las células de cáncer de ovario que da lugar a la supresión del crecimiento del tumor
in vivo
[58]. Sin embargo, la expresión transitoria, las reacciones inmunes potencialmente adversos (mediada por adenovirus) y problemas con el suministro sistémico restringir el uso generalizado de la entrega adenoviral de
mda
-7 /IL-24, especialmente cuando se administra por vía sistémica como no replicante adenovirus.
en este contexto, nuestros hallazgos de que los AINE con actividad anti-cáncer inducen altos niveles de
mda
-7 /IL-24 en células de cáncer de ovario proporcionar una nueva estrategia terapéutica para mejorar
mda
-7 /IL-24 niveles en un nivel sistémico. De hecho, hemos obtenido una visión global de las consecuencias de un panel entero de los AINE sobre la supervivencia de células de cáncer de ovario mediante la comparación de sus eficacias para inducir la apoptosis y
mda
-7 /IL-24 expresión. Los inductores más potentes de
mda expresión génica
-7 /IL-24 incluyen Sulindac Sulfuro y diclofenaco. Nuestro hallazgo se corresponde con los informes previos que demostraron que el tratamiento de xenoinjertos de tumores de pulmón humano en ratones desnudos con Ad
mda
-7 además de sulindac reducción del crecimiento tumoral con mayor eficiencia que Ad-
mda CD - 7 [50]. Además, estos resultados corroboran los hallazgos previos de que la apoptosis de la inducción de la citoquina pro-apoptótica
mda
-7 /IL-24 media la inducción de α GADD45 y γ actividad de expresión y JNK en otros tipos de cáncer [23]. Mientras Sulindac sulfuro y Diclofenac sí mismos pueden no ser los fármacos ideales para inducir
mda
-7 /IL-24 y la apoptosis en células de cáncer de ovario, y en particular diclofenaco provoca muchos efectos adversos en pacientes que limitan su uso en pacientes con cáncer , debería ser factible generar versiones modificadas de estos medicamentos que son más potentes en sus actividades contra el cáncer y con efectos reducidos adversa y fuera de objetivo. En efecto, una versión modificada de Sulindac Recientemente se ha informado a ser más activos contra las células cancerosas sin inhibir la COX 1 y 2 [61].
Diclofenac ha sido previamente demostrado que induce la apoptosis en el colon y el carcinoma de células escamosas y de inhibir el crecimiento del tumor de páncreas [62], [63]. Sin embargo, no hay informes acerca de su uso en el cáncer de ovario. Aquí, hemos demostrado que el diclofenaco, así como el sulfuro de sulindac inducen la apoptosis e inhiben el crecimiento de tumores de cáncer de ovario. Estos datos refuerzan la idea convincentes de los beneficios potenciales del tratamiento con AINE para el cáncer de ovario.
También identificamos Naproxeno y Ebselen como inductores de apoptosis y moderados
mda
-7 /IL-24 expresión en Las células de cáncer de ovario. Mientras Naproxen ayuda a prevenir la vejiga urinaria y el colon carcinogénesis [64], Ebselen se ha demostrado para reducir la toxicidad del tratamiento con cisplatino en modelos de cáncer de ovario de rata, la mejora de la actividad anti-tumor y la mejora de la mortalidad, la morbilidad y el resultado [65]. Como se ha mencionado antes, nos han informado de que la inducción de
mda
-7 /IL-24 por estructuralmente diferentes AINE es crucial para la inducción de la apoptosis de mama, próstata, las células de cáncer renal y de estómago [23]. Sin embargo, en este estudio previo, el naproxeno y el Ebselen tuvieron sólo efectos marginales sobre la inducción de la apoptosis. En este informe, se observó diferentes actividades farmacológicas para el naproxeno y el Ebselen. Ebseleno y Naproxeno la apoptosis inducida y
mda
-7 /IL-24 expresión en células de cáncer de ovario y también en sinergia con los AINEs más potentes, el diclofenaco y el sulfuro de sulindac, lo que sugiere el potencial utilidad clínica en el tratamiento del cáncer de ovario.
Hemos demostrado previamente que la inhibición de NF-kB en las células cancerosas aumenta la apoptosis sin promover
mda
-7 /IL-24 de producción [23]. Uno de los principales circuitos de transcripción implicados en la inflamación es la ruta de NF-kappa B /I? B [66]. Además, NF-kappa B ha sido implicado en la supervivencia de células de cáncer y escapar de la muerte celular programada y es activado por agentes quimioterapéuticos en las células del cáncer [30], [31], [33]. Las mutaciones en diferentes genes de la ruta de NF-kappa B y constitutivamente activa NF-kB se observan frecuentemente en varios tipos de cáncer [33]. De hecho, las células de cáncer de ovario con frecuencia contienen activan NF-kappa B antes de la terapia y son, por lo tanto, espera que sean resistentes a la quimioterapia
a priori
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