Extracto
Tradicionalmente, GRP78 ha sido considerado como un retículo endoplásmico: PLOS ONE (ER) proteína lumenal debido a su motivo de retención KDEL carboxilo. Recientemente, una subfracción de GRP78 se encuentra para localizar a la superficie de tipos específicos de células, que actúa como co-receptores y la señalización de regulación. Sin embargo, la relevancia fisiológica de GRP78 superficie celular expresión (sGRP78) en el cáncer y sus interacciones funcionales en la superficie celular sólo están surgiendo. En este informe, se combinaron bioquímica, las imágenes y los enfoques de mutación para abordar estas cuestiones. Para la detección de sGRP78, se utilizó un anticuerpo monoclonal de ratón altamente potente y específico para GRP78 o epítopo de etiquetado GRP78, junto con imágenes y bioquímicos técnicas que permitieron la detección de sGRP78 pero no GRP78 intracelular. Nuestros estudios revelaron que las células de cáncer de mama y de próstata resistentes a la terapia hormonal promueven activamente GRP78 a la superficie celular, que puede ser elevado adicionalmente por una variedad de condiciones de inducción de estrés ER. Demostramos que sGRP78 forma complejo con PI3K, y la sobreexpresión de sGRP78 promueve la formación de PIP3, indicativo de la activación de PI3K. Descubrimos además que un mutante de inserción de GRP78 en su dominio N-terminal, mientras que conserva la expresión estable y la posibilidad de trasladar a la superficie celular como la proteína de tipo salvaje, exhiben una formación reducida de complejo con p85 y la producción de PIP3. Por lo tanto, nuestros estudios proporcionan una explicación mecanicista de la regulación de la señalización de PI3K /AKT por sGRP78. Nuestros hallazgos sugieren que la orientación sGRP78 puede reprimir la resistencia terapéutica en las células cancerosas y ofrecer una nueva estrategia para suprimir la actividad de PI3K
Visto:. Zhang Y, Tseng CC, Tsai YL, Fu X, R Schiff, Lee AS (2013 ) Las células de cáncer resistentes a la terapia Promover Relocalización de superficie celular de GRP78 que forma complejos con PI3K y PI Mejora (3,4,5) P3 Producción. PLoS ONE 8 (11): e80071. doi: 10.1371 /journal.pone.0080071
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Agosto, 2013; Aceptado: 8 Octubre 2013; Publicado: 11 de noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud (NIH) subvenciones R01 CA027607 y AG034906 P01 a ASL; P50 CA058183 (SPORE Cáncer de Mama), CA030195 P01, el programa SU2C /mama Breast Cancer Research Foundation y RS; P30 CA014089 (USC Norris Comprehensive Cancer Center de la célula y del tejido Imaging Core) y DK048522 P30 (Centro de Investigación de Enfermedades Hepáticas USC celular y tisular Imaging Core). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La proteína regulada por glucosa de 78 kDa (GRP78), también conocida como Bip /HSPA5, es una chaperona importante retículo endoplasmático (ER) con propiedades anti-apoptóticos [1] y un regulador maestro de estrés ER señalización [2], [3]. Las células tumorales se someten a estrés ER debido a factores intrínsecos del metabolismo alterado y factores extrínsecos de la hipoxia y la privación de nutrientes. ER inducción de estrés de GRP78 en células de cáncer favorece la supervivencia celular, la progresión del tumor [4], [5] y confiere resistencia a fármacos tanto en células cancerosas en proliferación y latentes, así como las células endoteliales asociados a tumores [6] - [11]. Por lo tanto, la comprensión de cómo GRP78 ejerce sus efectos pleiotrópicos sobre la proliferación celular y la supervivencia es de gran importancia.
Tradicionalmente GRP78 se ha considerado como una proteína de ER luminal debido a su motivo de retención KDEL carboxilo [12]. Recientemente, se encontró una subfracción de GRP78 para localizar a la superficie de tipos específicos de células, particularmente en células de cáncer [13] - [16]. La superficie celular proteoma perfiles de las células tumorales reveló una abundancia relativa de chaperones de choque térmico y proteínas regulada por glucosa, incluyendo GRP78 [17]. Es importante destacar que la expresión preferencial de GRP78 en la superficie de las células tumorales, pero no en los órganos normales permite la focalización específica del tumor, lo que lleva a la supresión de tumores sin efectos nocivos sobre los tejidos normales [18] - [21].
Están apareciendo pruebas de que sGRP78 puede formar complejos con proteínas de la superficie celular específicos y regular la transducción de señales [13], [14], [16], tales como ser un co-receptor para el inhibidor de proteinasa α2-macroglobulina (α2-M *) inducida de transducción de señales para el cáncer la supervivencia y metástasis [22], [23]. Cripto, una clave de proteína de superficie celular anclada a GPI a la progresión del tumor humano, y sGRP78 forman un complejo y colaboran para inhibir la señalización de TGF-β y mejorar el crecimiento celular y la activación de PI3K /AKT [24], [25]. Además, sGRP78 se requiere para la supervivencia T-cadherina-dependiente de las células endoteliales [26], la activación de la apoptosis mediada por Kringle 5 [27], [28] y extracelular Par-4 y TRAIL [29], así como la entrada viral en anfitrión las células [30], [31]. Recientemente hemos demostrado celular localización en la superficie de GRP78 se regula por la maquinaria de recuperación de ER y reforzada por el agotamiento de Ca
2 + de la ER [32]. Las células cancerosas a menudo son sometidos a estrés ER, que se ve agravada por la terapia citotóxica que conduce a la resistencia. Sin embargo, si el estrés patológico, como el desarrollo de la resistencia terapéutica, conduce a la relocalización de GRP78 a la superficie celular no se conoce.
La PI3K /AKT vía se activa en una amplia gama de tipos de cáncer que conduce a la proliferación y terapéutico resistencia [33]. La PI3K tiene dos subunidades, la subunidad reguladora p85 y la subunidad catalítica de p110. Para la activación de PI3K, la fosforilación de tirosina de la subunidad reguladora p85 de PI3K alivia su actividad inhibidora de la PI3K, que conduce a su activación. Tras la unión al receptor de factor de crecimiento activados, PI3K es reclutado a la membrana plasmática. PI (4,5) P2 es fosforilada por PI3K para dar PI (3,4,5) P3, que promueve la localización de la membrana de PDK1, que luego se fosforila y activa AKT. A través de desmontables de GRP78 de siRNA, la ligadura de la superficie celular GRP78 con el anticuerpo y en modelos genéticos de cáncer, GRP78 se ha establecido como un nuevo regulador de PI3K de señalización tanto in vitro como in vivo [16], [25], [34], [35]. Mientras que puede haber múltiples mecanismos por los que GRP78 puede afectar a la activación de AKT, se ha informado de que el anticuerpo dirigidas a la N-terminal de imita GRP78 las formas del receptor-reconocido de α2-M * como un ligando y las unidades de activación de PI3K dependiente de AKT y la subsiguiente estimulación de la proliferación celular in vitro [21], [36]. Por el contrario, un dominio carboxilo terminal actos anticuerpo reactivo como un antagonista de α2-M * y suprime α2-M * inducida por fosforilación de Akt [21]. Recientemente, se muestra un GRP78 superficie celular anticuerpo monoclonal de orientación para suprimir la señalización de AKT, el desarrollo PI3K /tumor y la metástasis en múltiples modelos de cáncer [37]. A pesar de estos avances, se sabe poco sobre cómo sGRP78 regula la actividad de PI3K. En este informe, analizamos la expresión sGRP78 en líneas celulares de mama y el cáncer de próstata resistente a la terapia hormonal, y examinamos la regulación de la producción PIP3. Estos resultados ampliar nuestros conocimientos sobre sGRP78 y tienen importantes implicaciones para la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Todos los protocolos para el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo USC Institucional. El número de aseguramiento de animal es A3518-01. El número de protocolo es
9964.
Líneas celulares y cultivo de fibroblastos de embriones
ratón (MEF) las células [38], las líneas celulares humanas HEK293T, [32] y HeLa [32], se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina /estreptomicina. líneas celulares humanas, LNCaP (ATCC, Manassas, VA) y C4-2B (Viromed Lab, Minneapolis, MN), se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina. Las células parentales MCF7L [39] fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS inactivado por calor y 1% de penicilina /estreptomicina /glutamina; las células MCF7L-Tamr estaban en el mismo medio, excepto para el rojo de fenol libre de dextrano (PRF) RPMI 1640 y 10% tratado con carbón vegetal (CS) FBS. El MCF7 los padres /HER2-18 células [40] se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10%, 1% penicilina /estreptomicina, 0,4% geneticina (Life Technologies, Grand Island, NY) y 15 mg /ml de insulina (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO); las células MCF7 /HER2-18-Tamr estaban en el mismo medio, excepto para el PRF DMEM y 10% CS-FBS. Las células Tamr de ambos modelos MCF7L y MCF7-HER2-18 se mantuvieron en medio que contenía 100 nM 4-hidroxitamoxifeno (Sigma-Aldrich) como la concentración final. La línea celular dependiente de estrógenos, MCF-7 /BUS, fue proporcionado amablemente por A. M. Soto (Universidad de Tufts, en Medford, MA) y se ha descrito [41], [42]. El aislamiento y cultivo de condiciones para la inanición estrógenos clon resistente MCF-7 /BUS-10 se han descrito [43]. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2, 95% de aire. Para el tratamiento de estrés, las células se trataron con tapsigargina (Tg) a 300 nM, tunicamicina (TU) en 1.5 g /ml durante 16 h, o 2-desoxiglucosa (2DG) a 10 mM durante 24 h.
los plásmidos
la construcción de FLAG-GRP78 con una etiqueta FLAG-insertada después de que el péptido señal de ER (aa 1-18) de GRP78 humano de longitud completa (aa 1-654) se ha descrito [32]. GRP78-103F que contiene una etiqueta FLAG inserta justo después aa 103 de GRP78 humana se construyó de la siguiente manera: GRP78 humano de longitud completa en pcDNA3 (Life Technologies) espina dorsal se utilizó como molde con QuikChange mutagénesis dirigida al sitio (Agilent Technologies, Santa Clara, CALIFORNIA). La longitud completa de la subunidad reguladora de PI3K humano, cDNA p85 alfa, se amplificó por RT-PCR a partir de ARN humano HEK293 y se subclonó en pcDNA3 en los sitios BamHI y XbaI.
condiciones de transfección
Las células se cultivaron a 60-80% de confluencia y se transfectaron con BioT (Bioland Científica, Paramount, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante como se describe [32].
inmunotransferencia análisis
las células fueron lisadas en radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón complementado con inhibidor de la proteasa competente (Thermo Scientific, Rockford, IL). Los lisados celulares se sometieron a 10% en geles de SDS y análisis de transferencia de Western como se describe [32]. Los anticuerpos utilizados fueron: anticuerpo de ratón anti-FLAG (Sigma-Aldrich), 1:1000; ratón anti-anticuerpo GRP78 MAb159 (regalo de P. Gill, USC), 1:2000; anticuerpo anti-p85 PI3K conejo (# 4292, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA), 1:1000; conejo-PI3K anticuerpo anti p110α (# 4249, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA), 1:1000; ratón anticuerpo anti-EphB4 (regalo de P. Gill, USC), 1:1000; conejo anti-α1 NKA (Na, K-ATPasa α1) anticuerpo (Señalización Celular Tecnología), 1:1000; ratón anti-β-actina de anticuerpos (Sigma-Aldrich), 1:5000. Los experimentos se repitieron 2-3 veces. Los niveles de proteína se detectaron, ya sea por un aumento de quimioluminiscencia (ECL) o tinción de fluorescencia, y se visualizaron y se cuantificaron con Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) o por LiCor Odyssey.
Inmunofluorescencia y microscopía confocal
para la detección de sGRP78 endógena, las células C4-2B se sembraron a 5 x 10
3 por pocillo en un porta con cámara de 8 pocillos (Millipore, Billerica, MA) durante 24 h y después se trató con Tg por 8 h . Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% frío durante 10 min, se lavaron con PBS frío, y luego se bloquearon con 5% de BSA en PBS (BSA /PBS) en hielo durante 30 min. Las células se tiñeron con anticuerpo de ratón anti-GRP78 monoclonal (MAb159) en 1% BSA /PBS a 10 mg /ml a 4 ° C durante la noche sin permeabilización. Las células se lavaron con PBS frío y se tiñeron con AlexaFluor-488 anticuerpo de cabra anti-ratón (Life Technologies) en 1% BSA /PBS a 4 ° C durante 1 h. Para la inmunotinción posterior de p85 que es intracelular, las células se permeabilizaron con 0,5% de saponina en PBS a temperatura ambiente (RT) durante 15 min (v /w). Las células se lavaron con PBS que contenía 0,01% de saponina (PBS /SAP), y después se bloquearon con 5% de BSA en PBS /Sap a TA durante 1 h. Las células se tiñeron con anticuerpo de conejo anti-p85 (01:50, Cell Signaling Technology) en 1% de BSA en PBS /Sap a TA durante 2 h, seguido por tinción con AlexaFluor-594 anticuerpo anti-conejo de cabra (Life Technologies) en 1% de BSA en PBS /Sap a TA durante 1 h.
para la detección de GRP78 bandera de etiquetado ectópica expresó en la superficie celular, las células HeLa se sembraron a 5 x 10
3 por pocillo en 8- así cámara se desliza 24 h antes de la transfección. La transfección se realizó utilizando BioT. Cuarenta y ocho horas después de la transfección las células, no permeabilizadas se fijaron y se bloquearon como se describió anteriormente y después se incubaron con anticuerpo de ratón anti-FLAG (Sigma-Aldrich) en 1% BSA /PBS a 4 ° C durante 1 h seguido por incubación con AlexaFluor -488 anticuerpo de cabra anti-ratón (Life Technologies) en 1% BSA /PBS a 4 ° C durante 30 min. Para la detección de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI (3,4,5) P3), las células se trataron luego con MOM ™ Ig de ratón Reactivo bloqueante (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a TA durante 1 h para bloquear inmunoglobulina de ratón del anticuerpo anti-FLAG principal del ratón. Las células se permeabilizaron posteriormente como se describe anteriormente y tinción PI intracelular (3,4,5) P3 se realizó tal como se describe [35]. Para la detección de p85 en las células HeLa, se permeabilizaron las células y se tiñeron con el anticuerpo primario a 37 ° C durante 1 h y el anticuerpo secundario a 37 ° C durante 30 min
.
Todas las células inmunoteñidas se montaron con Vectashield medio anti-fade que contiene DAPI (vector Laboratories), y se analizaron mediante un microscopio confocal Zeiss LSM510 equipado con el software LSM 510 Version 4.2 SP1 adquisición (Carl Zeiss). Imágenes representativas fueron tomadas con un 40 × /CE 1.30 aceite de Plan-Neofluar objetivo o un Plan-Apocromático × 100 /1.4 objetivo aceite DIC. imágenes Z-stack fueron tomadas con un objetivo Plan-Apocromático × 100 /1,4 aceite de DIC.
biotinilación de la superficie celular de proteínas y el aislamiento
La célula de proteínas de superficie se biotina con biotina no permeable, se lisaron en tampón RIPA y se purifica por neutravidin perlas de agarosa como se describe anteriormente [32].
Co-inmunoprecipitación ensayo
Las células transfectadas se biotina y se lisaron con tampón de inmunoprecipitación (IP) (Tris 25 mM Cl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de NP40). Los lisados celulares se sometieron a monomérica columna de avidina (Thermo Scientific) y se eluyó con 2 mM D-biotina en PBS, siguiendo las instrucciones del fabricante. El eluato se concentró con Vivaspin 6 concentradores (10 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA), precleared con 50 Dynabeads l de proteína G (Life Technologies) y sometidas a incubación con el anticuerpo 1 g de ratón anti-FLAG (Sigma-Aldrich) o IgG de ratón normal durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con proteína Dynabeads 50 l G durante 1 hora a 4 ° C. Después del lavado, las perlas se hirvieron durante 5 min en 2 x tampón de muestra SDS, las muestras se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE 10% y Western blot.
activada por fluorescencia de células (FACS) de ensayo
Las células se separaron con solución de disociación celular no enzimática (Sigma-Aldrich) a 37 ° C durante 15 min y alícuotas de 1 × 10
6 células /tubo, y se incubaron con 10% de suero humano normal en PBS por 20 min en hielo para bloquear los receptores Fc en la superficie celular. Las células se incubaron con una cantidad saturante de anticuerpo de ratón anti-GRP78 (MAb159) (1 g) durante 40 min en hielo en 100 l de tampón de tinción (PBS de Dulbecco, suero de ternera fetal inactivado por calor al 2%, 0,09% de azida de sodio) , seguido por AlexaFluor-488 conjugado de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (0,5 g, Life Technologies) y se suspenden en PBS enfriado en hielo que contiene 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, 1 mg /ml, Sigma-Aldrich) y se sometió a FACS. Los datos fueron adquiridos por el flujo LSR II citómetro (Becton Dickinson, San Jose, CA) y se analizaron utilizando el software FlowJo.
Resultados
La promoción activa de la expresión GRP78 de la superficie celular en las células cancerosas resistentes a la hormonal terapia
para probar si el desarrollo de resistencia al tratamiento terapéutico altera la expresión de sGRP78 en las células cancerosas, que utiliza tres conjuntos de líneas celulares de cáncer y sus derivados que han adquirido resistencia al régimen de tratamiento. La línea celular de cáncer de mama humano MCF7L línea parental (MCF7L-P) y una línea resistente al tamoxifeno derivado (MCF7L-Tamr) fueron generados por el cultivo a largo plazo de las células MCF7L-P en PRF-medio que contiene 10% de CS-FBS y 100 nm tamoxifeno (Tam) hasta que se reanuda el crecimiento celular (después de 4 meses). En contraste con las células MCF7L-P que crecieron en medio que contiene E2 pero no en medio que contiene Tam, células MCF7L-Tamr mostraron tasas de crecimiento equivalentes cuando se somete a estrógeno (E2) o Tam (Figura 1A). La línea celular de cáncer de mama humano MCF7 /HER2-18-P que es un clon de sobreexpresión de HER2 y se aisló su derivado Tam-R después de la exposición a largo plazo a Tam por alrededor de 11 meses. El tercer par de las células es las células de adenocarcinoma de próstata humano sensibles a andrógenos bien establecidos, LNCaP, y su derivado, línea celular independiente de los andrógenos, C4-2B.
(A) Validación de fenotipo resistente Tam de la células MCF7L-Tamr. MCF7L-parental (P) y las células se pre--TamR hambre en rojo fenol libre (PRF) medio que contiene 5% CS-FBS durante 5 días antes de someterse a los estrógenos (E2) (1 nM) o Tam (100 nM) de tratamiento hace 8 d. Las células se sembraron por cuadruplicado en números de placa y de células de 96 pocillos se contaron por una célula en situ citómetro. En el día 8, las células se tiñeron con azul de metileno como se muestra en el panel inferior. Las barras de error representan la desviación estándar; * P & lt; 0,001, prueba de la t de dos lados, el crecimiento celular bajo Tam vs. E2. (B) Las inmunotransferencias de células MEF utilizando MAb159, con β-actina como control de carga. carril de la izquierda mostró lisados MEF de
GRP78 floxed /floxed
ratones. carril de la derecha mostró abolición de la banda GRP78 después de la infección con adenovirus que expresan la recombinasa Cre-a octavos de final de la
GRP78 floxed /floxed
alelos. (C) Western blots representativos para nivel sGRP78 mejorada en células de cáncer resistentes. Los padres (P) y Tamr derivados de los modelos celulares de cáncer de mama humano de MCF7L y MCF7 /HER2-18, así como la línea de células LNCaP sensibles andrógenos parental y las células C4-2B independientes de andrógenos se sometieron a biotinilación y NeutrAvidin tirón de agarosa -abajo para enriquecer en proteína de la superficie celular. GRP78 superficie celular (sGRP78) y GRP78 intracelular total (tGRP78) en el lisado celular se probaron por Western blot. La cantidad de lisado total fue de 10% de la cantidad utilizada para la avidina desplegable. β-actina sirvió como control de carga para tGRP78, mientras que la proteína de membrana, EphB4, o Na, K-ATPasa α1 (NKA α1) sirvió como control de carga de proteínas de superficie celular en células de cáncer de mama o de próstata (CaP), respectivamente. Los experimentos se repitieron dos veces. Las bandas de proteína se cuantificaron y los niveles relativos de tGRP78 en las líneas celulares parentales y resistentes se normalizaron contra β-actina, y el nivel sGRP78 se normalizan contra EphB4 o α1 NKA, respectivamente, que se muestran por media ± desviación estándar (SD) en el gráfico siguiente. Los niveles en líneas celulares de sus padres y en la línea celular sensible a los andrógenos, LNCaP se establecen como 1.
Para la detección de GRP78, se utilizó un anticuerpo monoclonal MAb159 alta afinidad dirigidos contra GRP78 humano que reconoce sólo la GRP78 banda de proteína (Figura 1B). Tras la eliminatoria de la
GRP78
alelos floxed en los MEFs por la infección con adenovirus que expresan la recombinasa Cre, se suprimió la banda GRP78, lo que confirma que reconoce específicamente MAb159 GRP78. Para la detección de sGRP78, se biotinilaron las células y las proteínas de la superficie celular se purificaron por NeutrAvidin agarosa desplegable. A partir del análisis de Western blot de las proteínas con biotina y el lisado total, se determinaron los niveles de sGRP78 y GRP78 intracelular total para cada línea celular, con EphB4 y α1 NKA servir como controles de carga para las proteínas de la superficie celular de cáncer de mama y las líneas celulares de cáncer de próstata, respectivamente. β-actina, una proteína citosólica, sirvió como control de carga para el total de los lisados celulares. análisis de Western blot representativo para la detección de sGRP78 y GRP78 son los que figuran, con los niveles de GRP78 después de la cuantificación y la normalización de los respectivos controles de carga representados gráficamente a continuación y se muestran con desviaciones estándar (Figura 1C). La ausencia de β-actina en las proteínas tire hacia abajo por NeutrAvidin confirmó la ausencia de contaminación de proteína intracelular en las fracciones de proteína de la superficie celular. Para las células MCF7L-P que expresaban un nivel basal moderado de GRP78, hubo un aumento de 3 veces en la GRP78 total, pero un aumento de 7 veces en sGRP78 en las células Tamr. Para células /HER2-18-P MCF7 que expresaban un nivel basal más alto de GRP78, las células Tamr sólo mostró un aumento mínimo de GRP78 total, pero un aumento de 4 veces en sGRP78. Para las células C4-2B independientes de andrógenos, el aumento total GRP78 sobre las células LNCaP sensibles a los andrógenos era menor, pero hubo un aumento de 7 veces en sGRP78. En conjunto, estos resultados implican que el aumento de sGRP78 en líneas celulares resistentes no se limita a paralelo el aumento en la cantidad total de GRP78, en lugar el desarrollo de resistencia promueve mecanismo especial (s) para mejorar la localización GRP78 a la superficie celular.
ER estrés eleva aún más el nivel GRP78 de la superficie celular en las células cancerosas resistentes
hemos informado anteriormente de que la Tg, que inhibe la ATPasa, produciendo ER Ca
2 + flujo de salida de la sala de emergencias, promueve la translocación de GRP78 de la ER a la superficie celular en células 293T de riñón embrionario humano [32]. Sin embargo, si esto se aplica a las líneas celulares de cáncer que ya exhiben niveles moderados a altos de GRP78 no se conoce. Como las células cancerosas se rutinariamente expuestos a estrés ER en el microambiente tumoral, es importante para determinar si las células cancerosas que han desarrollado resistencia a la terapia son capaces de la expresión de más de elevación sGRP78 en respuesta al estrés ER. Para probar esto, se trataron las células resistentes con diferentes inductores de estrés ER y medimos sGRP78 por FACS, así como por los enfoques bioquímicos. En el primer enfoque, las líneas celulares MCF7L-P y Tamr fueron tratados con Tg. GRP78 de la superficie celular se detectó por análisis de FACS (Figura 2A). Para la línea celular MCF7L-P, el tratamiento con Tg condujo a un incremento de 4.8 veces en sGRP78. Para la línea celular MCF7L-Tamr que ya exhibe 12 veces más alto nivel de sGRP78 comparación con las células MCF7L-P parentales, de tratamiento de Tg más eleva sGRP78 expresión a 20 veces (Figura 2A).
(A) células MCF7L parentales y tamoxifeno resistente se dejaron sin tratar (Ctrl) o tratadas con 300 nM thapsigargin (Tg) de 16 h. GRP78 de la superficie celular se midieron mediante FACS. perfiles FACS representativos se muestran y los porcentajes de células positivas se indican en la esquina superior derecha. Azul línea discontinua, control de isotipo; línea continua roja, anti-GRP78 Ab. línea (B) El estrógeno inanición sensible humana de cáncer de mama célula, MCF7 /BUS, y su clon derivado resistente, MCF7 /BUS-10, se dejaron sin tratar (Ctrl) o tratadas con 10 mM 2-desoxiglucosa (2DG) durante 24 h. Las células se biotina y proteínas de la superficie celular se purificaron por NeutrAvidin agarosa desplegable. sGRP78 y tGRP78 fueron detectados por Western Blot. β-actina sirvió como control de carga. Los cambios veces en sGRP78 y tGRP78 se muestran a continuación y la condición de control en las células /BUS MCF7 se estableció como 1. (C) Igual que (B), excepto las células tratadas con C4-2B Tg, Tu (tunicamicina) o 2DG. NKA α1 sirvió como control de carga proteína de la superficie celular. Los niveles relativos de tGRP78 y sGRP78 se normalizan contra β-actina o α1 NKA, respectivamente, y se expresaron como la media ± S.D. a partir de dos experimentos independientes en el gráfico (a la derecha).
En el segundo enfoque, se utilizó la línea celular dependiente de estrógenos MCF-7 /BUS y su derivado de las células MCF-7 /BUS-10 línea celular que ha adquirido resistencia a la inanición de estrógeno [43]. Las células se biotina y proteínas de superficie celular sometidas a neutravidina perlas de agarosa desplegable. Los niveles de sGRP78 y GRP78 intracelulares totales se determinaron por Western Blot (Figura 2B). De acuerdo con MCF7L y las líneas celulares MCF7 /HER2-18, el desarrollo de la resistencia en el /BUS-10 modelo MCF-7 aumentado considerablemente la cantidad de sGRP78 (por 9 veces), mientras que la cantidad total intracelular se aumentó moderadamente (por 1,3 veces). Por tanto las líneas celulares parentales y resistentes, el tratamiento de las células con 2DG, un inductor de estrés ER través de la inhibición de la glicólisis y la glicosilación, la expresión sGRP78 más elevada en alrededor de 5,2 veces en la línea parental y 3,5 veces en la línea resistente (figura 2B).
a continuación examinó el nivel de sGRP78 y GRP78 total en la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógenos C4-2B, con o sin estrés ER (Figura 2C). En estos estudios, además del tratamiento Tg y 2DG, hemos añadido otro inductor de estrés ER, tunicamicina (TU), que crea el estrés ER mediante el bloqueo de la glicosilación de proteínas unido a N, lo que provoca la acumulación de proteínas underglycosylated en el ER. En el análisis de transferencia Western, β-actina y α1 NKA sirvieron como controles de carga para las proteínas totales y de la superficie celular, respectivamente. Como en el caso para las células de cáncer de mama resistentes, el estrés ER causó un aumento moderado de GRP78 total (en alrededor de 2 veces) ya que estas células expresan ya alto nivel basal de GRP78 en comparación con sus células parentales sensibles. Bajo todas las condiciones de estrés ER tres, nivel sGRP78 aumentó de 5 a 6 veces, en comparación con las células no estresadas. En conjunto, estos resultados muestran que los estímulos de estrés ER diversa son capaces de promover activamente la expresión sGRP78 tanto en las células de cáncer sensibles y resistentes a los fármacos, y que el desarrollo de la resistencia terapéutica en combinación con el estrés ER mejora aún más sGRP78 expresión.
superficie de la célula GRP78 formas complejas con las PI3K
estudios recientes sugieren que la perturbación de sGRP78 altera la vía PI3K /AKT, sin embargo, la forma en que se consigue no es bien entendido [14], [16]. Para solucionar esto, se determinó si sGRP78 co-localizada con PI3K en la superficie celular. C4-2B, con alta sGRP78 endógena y la relativa facilidad de la cultura, presenta un modelo de sistema celular adecuado. Para maximizar la expresión sGRP78, las células se trataron con Tg. En células no permeabilizadas, la tinción de anticuerpos detectará principalmente GRP78 en la superficie celular, en lugar de la GRP78 intracelular muy abundante, que se localiza mayormente en la región perinuclear ER. Después de 8 h de tratamiento Tg, sGRP78 endógeno, como se visualiza mediante tinción de inmunofluorescencia con el anticuerpo monoclonal MAb159, se detectó dispersa sobre la superficie celular de las células C4-2B (Figura 3A). Para detectar la subunidad reguladora p85 PI3K que es intracelular, las células se permeabilizaron MAb159 inmunoteñidas seguido de tinción con anticuerpo contra p85. Como se muestra en las imágenes representativas, se observó co-localización de sGRP78 endógeno y p85 en varios sitios para que una subfracción de sGRP78 y p85 (Figura 3A, flechas).
(A) Microscopía confocal de detección de co-localización de sGRP78 endógeno con p85 en células C4-2B tratados con Tg por 8 h. Las células no permeabilizadas-se tiñeron primero con anticuerpo anti-GRP78 (MAb159) para detectar sGRP78 (
verde
) (izquierda). Después las células se permeabilizaron y tiñeron a continuación con anticuerpo anti-p85 (
red
). (B) Co-localización de la superficie celular F-GRP78 con p85 en células HeLa. células no permeabilizadas HeLa transfectadas con el vector de expresión de F-GRP78 se tiñeron primero con el anticuerpo anti-FLAG para detectar superficie F-GRP78 (
verde
) (izquierda), a continuación, se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpo anti-p85 (
rojo
). En ambos (A) y (B), los núcleos se tiñeron por DAPI (
azul
) y las regiones en caja (cuadrados en blanco) de las imágenes Z-pila comprimida (paneles de la izquierda) se ampliaron y se muestra en la paneles de la derecha en la sección confocal planos individuales (grosor de 0,38 micras) .El fusionaron imágenes mostraron co-localizaciones (
amarilla) de GRP78 de la superficie celular y p85 detectada en varios sitios correspondientes (
flechas blancas
) . Las barras de escala representan 2 micras. (C) Método de detección de la interacción entre la superficie de células F-GRP78 y p85. proteínas de superficie celular biotiniladas se purificaron por columna de avidina monomérica, seguido por inmunoprecipitación (IP) y Western blot. (D) Las células 293T se transfectaron con vector de expresión de F-GRP78. proteínas de la superficie celular eluidas de la columna de avidina monomérica (entrada) como se describe en (C) se sometieron a inmunoprecipitación (IP) con anticuerpo anti-FLAG o isotipo IgG que sirve como control negativo. F-GRP78, los niveles de p85 y p110α en el complejo inmunoprecipitado se midieron mediante Western blot con anticuerpos anti-FLAG, anti-p85 y anti-p110α.
Para extender estas observaciones, se transfectaron células HeLa con el vector de expresión de FLAG-GRP78 (F-GRP78). El uso de GRP78 marcado con el epítopo FLAG permitió el uso del anticuerpo altamente específico anti-FLAG para detectar la expresión GRP78 de la superficie celular en las células no permeabilizadas. Se utilizaron células HeLa, ya que se adhieren más fuertemente a portaobjetos de microscopio, lo cual es crítico para las múltiples etapas de manipulaciones experimentales de las células transfectadas. Nuestros resultados mostraron abundante co-localización de la superficie celular F-GRP78 con p85 (Figura 3B).
A continuación, para determinar si bioquímicamente sGRP78 formó complejo con PI3K, las células 293T se transfectaron con F-GRP78. Se utilizaron células 293T debido a su alta eficiencia de transfección. El uso de F-GRP78 nos permitió inmunoprecipitar GRP78 con alta especificidad y afinidad. El diseño experimental se muestra en la Figura 3C. Después de la transfección, se biotinilaron las células y los lisados celulares se incubaron con perlas de agarosa con avidina monoméricas que permiten el aislamiento de proteínas de superficie celular biotiniladas por condición de elución suave debido a su débil afinidad a la proteína biotinilada. Las proteínas de superficie de células eluidas se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-FLAG o el control de isotipo IgG. Los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia de Western y se sondearon con anticuerpos contra p85 y p110α, así como el anticuerpo anti-FLAG. Hemos observado que la superficie de la célula F-GRP78 complejo formado tanto con el regulador (p85) y catalizador (p110α) subunidades de PI3K, en contraste con el control de IgG que no mostró unión (Figura 3D). En conjunto, estos resultados sugieren que sGRP78 interactúa directa o indirectamente con p85 y p110α.
sobreexpresión GRP78 de la superficie celular estimula la PI (3,4,5) P3 y la producción de co-localización
La formación de complejos entre sGRP78 y PI3K sugiere que puede conducir a la modulación de la actividad de PI3K. Tras la activación, PI3K se localiza en la superficie celular y fosforila PI conduce a PI (3,4,5) P3 (4,5) P2 (en adelante, PIP3) producción.