Las células tumorales positivas y negativas para el cáncer común Stem marcadores de células son capaces de iniciar el crecimiento del tumor y la generación de dos progenies

: PLOS ONE
Extracto

El cáncer de células madre (CSC) modelo muestra que los tumores se organizan jerárquicamente y mantenidos por los CAC se extiende en el ápice. CSC se han "identificado" en una variedad de tumores a través de el ensayo de formación de tumor, en el que las células tumorales que se distinguen por un determinado marcador de superficie celular (conocido como un marcador CSC) se transplantaron por separado en ratones inmunodeficientes. En estos ensayos, las células tumorales positivas pero no negativa para el marcador CSC (por la presente se define como CSC
+ y CSC
- células, respectivamente) tienen la capacidad de un tumor a la droga y la generación de ambos progenie. Sin embargo, aquí se muestra que CSC
+ y CSC
- células presentan la proliferación similar en los estados nativos. El uso de un método de rastreo celular, demostramos que la CSC
- células presentan la tumorigénesis y la proliferación similar a la CSC
+ células cuando se co-trasplantadas en ratones inmunodeficientes. A través de la construcción de una sola célula sublínea derivada de serie, hemos demostrado, además, que CSC
+ y CSC
- células de marcadores expresar CSC tumores, invariablemente, podrían generar tanto progenie, y sus características se mantienen entre las diferentes generaciones, independientemente de los orígenes (CSC
+ - derivados o CSC
- derivada). Estos resultados demuestran que las células tumorigénicas no pueden distinguirse por los marcadores CSC comunes solos y proponemos que precauciones deben tomarse cuando se utilizan estos marcadores de forma independiente para identificar células madre de cáncer debido a la plasticidad fenotípica de las células tumorales

Visto:. Huang SD, Yuan Y, Tang H, Liu XH, Fu CG, Cheng HZ, et al. Las células (2013) tumorales positivas y negativas para el cáncer común Stem marcadores de células son capaces de iniciar el crecimiento del tumor y la generación de dos progenies. PLoS ONE 8 (1): e54579. doi: 10.1371 /journal.pone.0054579

Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América

Recibido: 3 Noviembre 2011; Aceptado: 13 de diciembre de 2012; Publicado: 21 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 30471718, 30801094, 30872552 y) y la Fundación Municipal de Shanghai de Ciencias Naturales (subvención 10140902300). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Una cuestión fundamental en el campo de la investigación es que las células del tumor pueden iniciar los tumores. Dos modelos se han propuesto para explicar la iniciación de tumores [1], [2]. El modelo de evolución clonal (también conocido como el modelo estocástico) implica que los tumores comprenden células con igual potencial tumorigénico y que cualquier heterogeneidad funcional es atribuible a las influencias aleatorios o estocásticos (intrínseca o extrínseca) que pueden alterar el comportamiento de las células individuales en el tumor. Por el contrario, la célula madre de cáncer modelo (CSC) (también conocido como el modelo de jerarquía) sostiene que, al igual que los tejidos normales, que son las jerarquías celulares mantenidas por las células madre, los tumores pueden ser explicados por las organizaciones jerárquicas, en las que las CSC situadas en el vértice mantener la capacidad para la iniciación del tumor, auto-renovación, y la generación de fenotípicamente diversas células sin o con capacidad proliferativa limitada. Los defensores del modelo CSC proponen que las CSC puede dar cuenta de los comportamientos de tumores tales como metástasis [3], [4] y la resistencia a la quimioterapia o la radioterapia [5] - [9]. Por lo tanto, la terapia dirigida-CSC puede ser la dirección futura del tratamiento del tumor [10] - [13].

A través del ensayo de formación de tumor en el que fenotípicamente diversas células fueron trasplantadas en ratones inmunodeficientes separado, CSC fue el primer "identificados "en la leucemia mieloide aguda humana (AML), ya que sólo CD34
+ CD38
- se han encontrado células que tienen la capacidad de iniciación del tumor, la auto-renovación, y la generación de células de otros subconjuntos en estas condiciones [14]. Desde entonces, el modelo experimental xenotrasplante ha sido ampliamente utilizado en los estudios de CSC. El uso de varios marcadores de la superficie celular, una gran cantidad de literatura se ha publicado que sugiere la existencia de células madre cancerosas en una variedad de tumores tales como la leucemia mieloide crónica (CML) [15], [16], la leucemia promielocítica aguda (APL) [17], [18], el cáncer de mama [19], el glioblastoma [20] - [23], el cáncer de colon [24] - [26] y el melanoma [27] - [30].

controversia Sin embargo, no está resuelta en cuanto a si la capacidad de formación de tumor de las células tumorales humanas se reflejó correctamente en estudios previos [31], [32]. Dado que la eficiencia de los xenotrasplantes en la mayoría de los casos es considerablemente inferior a la de los trasplantes singénicos, Kelly et al. sugirió que la capacidad de formación de tumor de las células tumorales humanas puede ser seriamente comprometida en el medio del ratón debido a las diferencias específicas de las especies en la afinidad (o reconocimiento) de los receptores de citoquinas y factores de crecimiento para sus ligandos afines [33]. Además, Quintana et al. empleado una cepa más altamente inmunocomprometidos ratón (NOD /interleucina-2 SCID receptor cadena gamma null [ll2rg - /-]) para el ensayo de los xenotrasplantes y encontró que esto podría aumentar dramáticamente la frecuencia detectable de células con potencial tumorigénico en el melanoma humano, lo que sugiere que la la capacidad de formación de tumor de las células tumorales humanas podría verse comprometida en gran medida debido a la influencia inmune en el medio exterior [34]. Esto nos llevó a cuestionar si la capacidad proliferativa y tumorigénico de las células tumorales humanas, especialmente el de la "no-células madre cancerosas" podría haber sido subestimado en los estudios anteriores.

En el presente estudio, se evaluó la proliferación y la apoptosis de las células madre cancerosas putativas (CSC
+ células) y no las CSC (CSC
- células) en tumores primarios, así como líneas de células tumorales por citometría de flujo. En contraste con los informes anteriores de los ensayos de xenotrasplantes convencionales (transplante de CSC
+ y CSC
- células por separado), donde CSC
-, se mostró que las células no tienen o tienen una limitada capacidad proliferativa [1], [35] , [36], no se encontraron diferencias significativas en la proliferación y la apoptosis entre los dos subconjuntos en el estado nativo. Se empleó además una técnica de rastreo celular para seguir la proliferación, la tumorigenicidad de CSC
+ y CSC
- células. Elegimos estudiar las células de varias líneas de células tumorales en lugar de tumores primarios, que podría comprender genéticamente diversas células [27], [37]. Se encontró que CSC
- células expuestas proliferativa similar y capacidades tumorigénicas como CSC
+ células cuando los dos subconjuntos coexistieron. Por otra parte, ambos subconjuntos podrían dar lugar a CSC
+, así como CSC
- progenie, mientras que las características de la CSC
+ (o CSC
-) las células se mantuvieron entre diferentes generaciones, independientemente de su orígenes (CSC
+ - derivados o CSC
- derivada). Nuestros resultados sugieren que los marcadores CSC debe utilizarse con precaución para diferenciar células madre de cáncer de otras células tumorales debido a su plasticidad fenotípica.

Resultados

Expresión de marcadores de CSC varía enormemente en tumores primarios humanos y líneas de células tumorales

estudios previos han sugerido que las células leucemógénos /tumorigénico se limitaron a una población rara de células tumorales que expresan ciertos marcadores CSC [35], [36]. El uso de un protocolo de disociación libre de tripsina (para mantener la integridad epítopo), se detectó el porcentaje de células positivas CSC marcador (por ejemplo, CD34
+ CD38
- para la LMA, APL, y CML, CD44
+ CD24
- para el cáncer de mama, CD133
+ para el glioblastoma y el cáncer de colon, y CD271
+ para el melanoma) en tumores primarios humanos, así como líneas de células tumorales mediante análisis de citometría de flujo. Se encontró que un número considerable de tumores primarios o líneas de células tumorales no expresan los marcadores de CSC (Figura 1A), que es coherente con otros informes [38], [39]. Además, se realizó RT-PCR cuantitativa y encontramos que las células (tanto CSC
+ y CSC
-) de CSC marcador de tumores que expresan, pero no las células de CSC marcador de tumores no expresan, expresar ARNm marcador CSC (Figuras 1B-F y la Figura S1), lo que sugiere que el marcador CSC expresar y tumores no expresan podría proceder de diferentes tipos de células tumorales. En los tumores primarios y líneas celulares tumorales que expresan los marcadores de CSC, el porcentaje de células positivas de marcador CSC varió enormemente, que van desde 0,4% en un AML a tan alto como 82,7% en un cáncer de colon (Figura 1A).

(a) El porcentaje de células positivas CSC marcadores de tumores primarios humanos (n = 10 para cada tipo) y líneas celulares tumorales. Se prepararon suspensiones de células individuales, seguido de análisis de citometría de flujo. Los puntos representan el porcentaje de células CD34
+ CD38
- células de AML, APL, y CML, CD44
+ CD24
- las células de cáncer de mama, CD133
+ en las células de glioblastoma y cáncer de colon y CD271
+ células en muestras de melanoma. (B-F) El ARNm marcador de nivel de expresión CSC de las células (CSC
+ y CSC
- células de CSC marcador que expresan las líneas celulares tumorales y células de líneas celulares tumorales no expresión) se analizó mediante qRT-PCR y normalizado a
GAPDH
. El nivel de CD34 mRNA en KG-1 CSC
+ células, CD44 mRNA en células MCF-7 CSC
+ células, ARNm CD133 en SHG-44 y Caco-2 CSC
+ células, CD271 mRNA en A375 CSC
+ células, se designó arbitrariamente como 1,0 para la leucemia, cáncer de mama, glioblastoma, cáncer de colon, muestras de melanoma, respectivamente. Las fotografías muestran los productos y los histogramas de RT-PCR muestran el nivel de expresión de ARNm marcador de CSC de las células de leucemia (B), el cáncer de mama (C), glioblastoma (D), cáncer de colon (E), y líneas celulares de melanoma (F). Tenga en cuenta que las células de CSC marcador no expresan líneas celulares tumorales (U37, U81, COLO320, LoVo, LS174T) no expresan ARNm marcadores CSC

CSC
-. Células tumorales muestran la proliferación similar CSC
+ células tumorales en los
estado nativo
Para investigar la proliferación de las células madre cancerosas putativas (CSC
+ células) y no las CSC (CSC
- células) en el estado nativo, se midió el porcentaje de proliferación y apoptosis de los dos subconjuntos en CSC marcador de tumores que expresan primarios (por ejemplo, AML, APL, CML, cáncer de mama, glioblastoma, cáncer de colon y melanoma) por citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, el porcentaje de Ki-67 células positivas, y el porcentaje de Anexina V
+ 7-AAD
- células no difirieron significativamente entre los dos subconjuntos. Resultados similares se obtuvieron en
in vitro gratis (Figuras 2C y 2D) y
in vivo
estudios de CSC marcador que expresan líneas celulares tumorales humanas (Figuras 2F y 2E). Estos resultados sugieren que la capacidad proliferativa de CSC
- células es similar a la de CSC
+ células en el estado nativo

(A, B) fueron seleccionados CSC marcador expresando muestra primaria a someterse. expresión Ki-67 y análisis de apoptosis. Los datos representan la media ± SEM; n = 10 para cada tipo de leucemia, n = 8 para el glioblastoma y el cáncer de colon, n = 9 para el cáncer de mama y para el melanoma. (A) Ki-67 expresión de CSC
+ y CSC
- las células de los tumores primarios humanos. suspensiones de células individuales de tumores primarios humanos se tiñeron con anticuerpos específicos para los marcadores de CSC y Ki-67-FITC, seguido de análisis de citometría de flujo. (B) Ensayo de apoptosis de CSC
+ y CSC
- las células de los tumores primarios humanos. suspensiones de células individuales de tumores primarios humanos se tiñeron con anticuerpos específicos para los marcadores de CSC y Anexina V-FITC /7-ADD, seguido por análisis de citometría de flujo. (C-D) Ki-67 expresión (C) y la apoptosis (D) ensayo de CSC
+ y CSC
- células de líneas de células tumorales humanas cultivadas en medio que contenía suero. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. (E-F) Ki-67 expresión (E) y la apoptosis (F) de ensayo de CSC
+ y CSC
- células de xenoinjertos derivados de líneas de células tumorales humanas. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. marcado con DsRed (G) CSC
+ y EGFP marcado con CSC
- células procedentes de las mismas líneas de células tumorales se mezclaron de acuerdo con sus proporciones originales y co-cultivaron en medio que contiene suero durante 20 pasajes. Puntos muestran la relación de CSC
+ - derivada a CSC
- (DsRed: EGFP) derivada de células en diferentes pasajes. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes

Para seguir la proliferación de CSC
+ y CSC
-. Células, se emplean, además, una técnica de rastreo celular diseñada para simular el
entorno in situ
en el que coexisten dos subconjuntos. marcado con DsRed CSC
+ y EGFP marcado con CSC
- células procedentes de las mismas líneas de células tumorales se mezclaron de acuerdo con sus proporciones originales y co-cultivaron en medio que contiene suero durante 20 pasajes (véase Procedimientos Experimentales para más detalles ). La citometría de flujo El análisis mostró que la proporción de CSC
+ - derivada a CSC
- derivados (DsRed: EGFP) las células se mantuvo básicamente sin cambios durante todo el proceso (Figura 2G). Estos datos sugieren que tanto CSC
+ y CSC
- células podrían propagar ampliamente

CSC
-. Células tumorales muestran la capacidad de formación de tumor similar al CSC
+ células tumorales sobre co -transplantation

a la luz de todo lo anterior, se determinó la capacidad de formación de tumores de CSC
+ y CSC
- células de co-trasplante, así como los xenotrasplantes convencional (CSC trasplantar
+ y CSC
- células por separado). marcado con DsRed CSC
+ y marcado con EGFP CSC
- células originó a partir de las mismas líneas celulares tumorales se mezclaron en su proporción original. Diferentes números de CSC
+, CSC
-, o se inyectaron células mixtas bajo la cápsula renal de ratones irradiados subletalmente NOD-SCID, respectivamente. Se encontró que ambos CSC
+ y CSC
- células podrían iniciar la formación de tumor cuando se trasplantan por separado, aunque la frecuencia de la formación de tumores por CSC
- células fue significativamente menor que en CSC
+ células (Tabla S1). Cuando CSC
+ y CSC
- células se co-trasplantado, los xenoinjertos fueron compuestas tanto de CSC
+ - derivado (DsRed) y CSC
- células derivadas (EGFP), como se muestra en las figuras 3A y 3B. Es importante destacar que, citometría de flujo El análisis mostró que las proporciones de CSC
+ - derivado de CSC
- derivados: células (DsRed EGFP) en los xenoinjertos no fueron significativamente diferentes de las proporciones de CSC
+ a CSC
- (DsRed: EGFP) las células en las mezclas que se había inyectado (Figuras 3C y 3D, la Tabla 1). Se llevó a cabo el xenotrasplante hasta el tercer pasaje. Citometría de flujo El análisis mostró que las proporciones de CSC
+ - derivados de CSC
- derivados (DsRed: EGFP) células en los xenoinjertos permanecieron básicamente sin cambios entre los diferentes pasajes (Tabla 1). Estos datos sugieren que aunque CSC
+ células pueden ser más tumorigénico cuando se estudian por separado, pre-aislado CSC
- las células se pueden mantener en el modelo de co-transplatation. Los estudios también implican que la capacidad de formación de tumor de CSC
-. Células podrían ser subestimados si se estudian por separado en un medio exterior

(A y B) marcado con DsRed CSC
+ y marcado con EGFP CSC
- células procedentes de las mismas líneas celulares tumorales se mezclaron a su relación original y co-trasplantado en ratones irradiados subletalmente NOD-SCID. Las fotografías representan imágenes fluorescentes (A) y hematoxilina y eosina (B) de las secciones de serie de los xenoinjertos derivados de KG-1, MCF-7, SHG44, Caco-2 y A375. Barra de escala = 100 micras. (C) El flujo de gráficos de contorno de citometría muestran el porcentaje de células EGFP DsRed y en los xenoinjertos. (D) Los histogramas muestran la relación de CSC
+ para CSC
- (DsRed: EGFP) en células inyecciones y la relación de CSC
+ - derivada a CSC
- derivados (DsRed: EGFP ) células en xenoinjertos. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes.

plasticidad de CSC jerarquía basada en el marcador CSC marcador de tumores que expresan

De forma inesperada, se encontró que un número considerable de CSC
+ estaban presentes en el CSC
- poblaciones derivadas tanto
in vitro
y
in vivo
y el porcentaje de CSC
+ en el CSC
+ - y CSC
- poblaciones derivadas fueron comparables después culta (o xwnotransplantado) durante varios pasajes (Tabla S2), lo que sugiere que CSC
- las células que expresan el marcador en CSC tumores pueden dar lugar a CSC
+ células . Para confirmar que el CSC
+ en las células CSC
- población derivada de hecho fueron progenie de CSC
- células y no el resultado de contaminación de células introducidas durante la clasificación celular [40], que mide (en CSC marcador expresando líneas celulares tumorales, mediante citometría de flujo) el porcentaje de células positivas CSC marcadores en un solo CSC
+ - derivados o CSC
- sublíneas derivada. Como se muestra en la Figura 4 y la Figura S2, tanto CSC
+ y CSC
- células eran capaces de generar sublíneas de células derivadas individuales y dando lugar a los dos subconjuntos. Inicialmente, el porcentaje de células positivas CSC marcadores en un solo CSC
- sublíneas derivados fue significativamente menor que en un solo CSC
+ - sublíneas derivados. Sin embargo, durante un período prolongado de cultivo (aproximadamente 20 pasajes, véase Procedimientos Experimentales para más detalles), el porcentaje de células positivas CSC marcadores en cada sublínea se convirtió estadísticamente similar a la de las líneas de células tumorales originales. Además, se encontró que el clon de la formación de la eficiencia de CSC
- células variaron de 36,1% en las células Caco-2 a 70,3% en células THP-1 (Figura S3). Cabe destacar que el porcentaje de clon formando CSC
- células es mucho más alta que la tasa de contaminación por CSC
+ células (células falsos negativos, por lo general inferior a 0,1%) en el CSC
- población ordenados por FACS. Estos resultados indican que CSC
- células pueden dar lugar a CSC
+ en las células que expresan CSC marcador de tumores humanos

(A-E) CSC
+ y CSC
-. Células desde el tumor original se seleccionaron líneas de células para generar sublíneas de células individuales derivados (SCDSLs). El porcentaje de células positivas CSC marcadores en las líneas de células tumorales originales o SCDSLs (paso 1 y el paso 20) de KG-1 (A), MCF-7 (B), SHG44 (C), HT-29 (D), y A375 (E) se analizó por citometría de flujo. Los diagramas de caja indican el porcentaje de células positivas CSC marcador en SCDSLs, con los bigotes representan los valores mínimos y máximos, las líneas centrales que representan el valor de la mediana, y las cajas que representan el 25 y el 75 por ciento. Los histogramas muestran el porcentaje de células positivas CSC marcadores en líneas de células tumorales originales y SCDSLs. Los datos de SCDSLs representan la media ± SEM de 100 muestras; Los datos de las líneas de células tumorales originales representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes; **
P Hotel & lt; 0,01 por independientes
t-test


Se realizó la construcción sublínea derivada de una sola célula hasta la tercera generación (Figura 5A. ). Independientemente de las generaciones u orígenes (CSC
+ - derivados o CSC
- derivada), todos y cada sublínea contenía un número considerable de CSC
+ células (Figuras 5B y 5C, las figuras S4A y S4B) , y el porcentaje de células positivas CSC marcador en el único CSC
+ - derivado (o CSC
- derivados) sublíneas fue comparable entre todas las generaciones (Figuras 5D y 5E, Figuras y S4C S4D). En concreto, los dos subconjuntos podrían generar invariablemente CSC
+ y CSC
- progenie en todas las generaciones, y no hay sublíneas estaba compuesta exclusivamente por CSC
+ o CSC
- células. Además, se estudió la proliferación y la tumorigénesis de la CSC
+ (o CSC
-) células de diferentes generaciones (Figura 6A). Como se muestra en las figuras 6B, 6C y la Figura S5, el porcentaje de 67 Ki-células positivas, el porcentaje de Anexina V
+ 7-AAD
- las células, y la frecuencia de células oncogénicas fueron estadísticamente similares a través de todas las generaciones a pesar de los orígenes. Estos resultados muestran que CSC
-. Las células son capaces de generar CSC
+ células y sugieren que existe una considerable plasticidad de estos marcadores comunes CSC en estos tumores

(A) Diagrama esquemático muestra la construcción sublíneas de serie de una sola célula derivados (SCDSLs). CSC
+ y CSC
- Se seleccionaron las células de las líneas celulares tumorales originales para generar SCDSLs y arbitrariamente clasificados como generación 1 SCDSLs (incluyendo G
1
+ y G
1
-). CSC
+ y CSC
- células de G fueron seleccionados
1 SCDSLs para generar G
2 SCDSLs (incluyendo G
1
+ G
2
+, G
1
-G
2
+, G
1
+ G
2
- y G
1
-G
2
-). Se repitió el procedimiento hasta que se obtuvieron G
3 SCDSLs. (B-E) El porcentaje de células positivas de marcador CSC en SCDSLs de KG-1, MCF-7, SHG44, Caco-2 y A375 se analizó por citometría de flujo cuando la cantidad de células alcanzó aproximadamente 1 × 10
6. Los diagramas de caja indican el porcentaje de células positivas CSC marcadores en un solo CSC
+ - derivada (B) y CSC
- derivados (C) sublíneas de diferentes generaciones, con los bigotes representan el valor mínimo y máximo, el centro líneas que representan el valor de la mediana, y las cajas que representan el percentil 25 y 75. Los histogramas muestran el porcentaje de células positivas CSC marcadores en un solo CSC
+ - derivada (D) y CSC
- derivado (E) sublíneas de diferentes generaciones. Los datos representan la media ± SEM de 100 muestras, cada una de una serie de construcción SCDSL independiente.

(A) Diagrama esquemático que muestra la clasificación celular basada en la generación y la expresión de marcadores de CSC. Las células de las líneas celulares tumorales originales fueron arbitrariamente clasificados como células de generación 1 (G
1) y clasificados en el marcador CSC positivo (G
1
+) y negativo (G
1
- ) Células. G
1
+ y G
1
- células fueron propagadas (de 1 × 10
2 a aproximadamente 1 × 10
8) para generar G
2 ( incluyendo G
1
+ G
2
+, G
1
+ G
2
-, G
1
-G
2
+ y G
1
-G
2
- células). Se repitió el procedimiento hasta que se obtuvieron G
3 células. (B y C) CSC
+ y CSC
- se utilizaron células de diferentes generaciones para los ensayos de proliferación y tumorigénicas. Los histogramas muestran el porcentaje de 67 Ki-células positivas, el porcentaje de Anexina V
+ 7-AAD
- las células, y la frecuencia de células oncogénicas del CSC
+ células (B) y CSC
- células (C) de diferentes generaciones en KG-1, MCF7, SHG44, Caco-2 y A375. Frecuencia de células oncogénicas se calculó utilizando extrema limitación de software de análisis de dilución. Otros datos se expresan como media ± SEM de 3 experimentos independientes.

Discusión

La cuestión de que las células tumorales contribuyen a la progresión tumoral tiene implicaciones fundamentales para la terapia. Basado principalmente en los hallazgos de que las células tumorales que expresan únicamente ciertos marcadores de superficie celular podría iniciar el crecimiento del tumor cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes, los defensores del modelo CSC proponen que los tumores se organizan jerárquicamente y por lo tanto la terapia de tumores debe ser dirigida a la eliminación de las células oncogénicas (es decir, Los CSC) [2], [41], [42]. Sin embargo, aquí se muestra que los marcadores CSC previamente identificados (por ejemplo, CD34
+ CD38
- para la LMA, APL, y CML, CD44
+ CD24
- para el cáncer de mama, CD133
+ para el glioblastoma y el cáncer de colon, CD271
+ para el melanoma) no necesariamente a filtrar las células oncogénicas en estos tumores, debido a que ambos CSC
+ y CSC
- células pueden iniciar el crecimiento del tumor y dar lugar a ambos progenie ( es decir, CSC
+ y CSC
- células). Nuestros datos plantean cuestiones interesantes con respecto a la plasticidad de la jerarquía de tumor.

El modelo CSC postula que la iniciación de la formación de tumores es impulsado por células madre cancerosas mientras que el no CSC, que componen la mayor parte de las células en un tumor, no tienen o capacidad limitada para la iniciación de la formación de tumores [1], [35], [36]. Por otra parte, se informó de CSC a ser más quiescente que los no-CSC [41], [43]. Si las diferencias fundamentales en el potencial proliferativo sí existe entre células madre cancerosas y no las CSC, tales diferencias deben ser fácilmente detectados por análisis de citometría de flujo o inmunohistoquímica de la proliferación celular. Sin embargo, aquí se demostró que la proliferación y la apoptosis de las células madre cancerosas putativas (CSC
+ células) y no células madre cancerosas (CSC
- células) fueron muy similares en los tumores primarios y líneas de células tumorales, lo que sugiere que la capacidad proliferativa de CSC
- células podrían haber sido subestimado en estudios previos en los que CSC
+ y CSC
- células fueron transplantadas por separado en los animales. Por lo tanto, hemos establecido un método de rastreo celular diseñada para simular el
entorno in situ
donde CSC
+ y CSC
- coexisten células. En contraste con los informes anteriores de que CSC
- células no tenían ninguna o limitada capacidad de proliferación y, por tanto, no inició el crecimiento del tumor [35], [36], que puso de manifiesto que CSC
- células mostraron proliferación similar o sostenibilidad como CSC
+ células cuando ambos subgrupos fueron co-cultivadas
in vitro
o co-trasplantado en los animales de acuerdo a sus proporciones originales. Estos datos sugieren fuertemente que, además de CSC
+ células, CSC
-. Células también son capaces de proliferación y tumorigénesis

El modelo CSC representa a un tumor como una jerarquía celular en el que sólo los CAC tumbado en el vértice tienen la capacidad de auto-renovación y la generación de células del resto. La evidencia disponible apoyar el modelo CSC en su mayoría proviene de estudios que forman tumores. Como se mencionó anteriormente, el ensayo de formación de tumor puede no ser suficiente para demostrar una organización jerárquica ya que la capacidad de formación de tumor de las células tumorales podría ser influenciado de manera espectacular por los factores intrínsecos y extrínsecos [33], [34], especialmente cuando diferentes subconjuntos de las células tumorales se estudian por separado en un medio exterior. Por otra parte, aunque algunos estudios mostraron que CSC
- (CD133
-) células en glioblastoma [38] y el cáncer de colon [39] podría iniciar el crecimiento del tumor, si hay o no una jerarquía basada CSC marcador en estos tumores no fueron investigados extensivamente. En el presente estudio, se determinó el destino de las células derivadas de células madre cancerosas putativas (CSC
+ células) y no las CSC (CSC
- células) de células de rastreo bajo condición en la que coexisten los dos subconjuntos. Encontramos tanto CSC
+ y CSC
- células podrían ser detectados en la progenie derivada de CSC
+ (o
CSC -) de las células tanto
in vitro
y
In
vivo. A través de la construcción sublínea derivada de una sola célula en serie con células de líneas de células tumorales, hemos demostrado, además, que CSC
- así como CSC
+ células de CSC marcador de tumores que expresan invariablemente podría dar lugar a ambos progenie, y el proliferativa o tumorigénico capacidad de CSC
+ (o CSC
-) las células se mantuvo entre las diferentes generaciones, independientemente de los orígenes (CSC
+ - derivados o CSC
- derivada). Estos datos proporcionan fuertes evidencias de que no existe una jerarquía común marcador CSC basadas en estos tumores.

marcadores de superficie celular han sido ampliamente utilizados para distinguir los CAC de no células madre cancerosas y la mayoría de los estudios previos sugirieron que los CAC se limita a una población rara de células tumorales [35], [36]. Sin embargo, nuestros datos sugieren que la expresión de marcadores de superficie celular es más complejo que previamente reconocido. De acuerdo con algunos otros informes [38], [39], se mostró por análisis de citometría de flujo que el porcentaje de células positivas de marcador CSC variar enormemente (que van desde 0,4% en un AML a tan alto como 82,7% en un cáncer de colon) en CSC marcador de tumores que expresan y que un número considerable de tumores primarios o líneas celulares tumorales no expresan los marcadores de CSC. A través de RT-PCR cuantitativa, que reveló además que las células (tanto CSC
+ y CSC
-) de CSC marcador de tumores que expresan pero no las células de CSC marcadores tumores no expresan expresado mRNA marcador CSC, lo que sugiere que el marcador CSC expresar y tumores no expresan podrían originarse a partir de diferentes tipos de células tumorales. Cabe destacar que, en contraste con el modelo de CSC y modelo de evolución clonal, en el que la heterogeneidad fenotípica se atribuye a los cambios epigenéticos y genéticos, respectivamente, se muestra que la expresión de marcadores de CSC en las células de CSC marcador que expresan líneas de células tumorales puede ser dinámico. Tal fenómeno también fue observado por otros en algunos tumores primarios humanos [44] - [46 líneas] y de células tumorales [45], [46]. . Si existe tal fenómeno en otros tumores primarios de nuevas investigaciones

Los datos actuales muestran que tanto CSC
+ y CSC
- células tienen la capacidad de la tumorigénesis y que la expresión de marcadores de CSC es reversible . Sin embargo, no descartamos la heterogeneidad funcional entre los dos subconjuntos como CSC
+ células expuestas más alta tumorigenicidad de CSC
- células cuando se trasplantaron en ratones por separado. Anteriormente, se informó de CSC
+ células a exhibir una mayor tolerancia inmune (por ejemplo, CD271
+ células de melanoma humano [29]) y una mayor secreción de factores de crecimiento (por ejemplo, CD133
+ células de glioblastoma humano [47] ) que CSC
- células. Por lo tanto, cuanto mayor sea la tumorigenicidad de CSC
+ células en xenotrasplantes puede ser o bien debido a su mejor adaptación al entorno exterior y /o su capacidad para secretar factores de crecimiento que son críticos para la supervivencia y la proliferación celular. Si el CSC
+ y CSC
- células pueden mostrar diferencias manifiestas en la iniciación del tumor, metástasis y la resistencia a la quimioterapia o la radioterapia en el medio humano que queda por investigar aún más. Una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de la heterogeneidad funcional podría proporcionar pistas importantes para el desarrollo y evaluación de nuevas terapias contra el cáncer.

Conclusiones

La presente investigación muestra que la limitación de la utilización de marcadores comunes a CSC identificar una población de células (es decir, células madre cancerosas) que son

exclusivamente capaces de proliferar e iniciar el crecimiento del tumor en las líneas de células tumorales que hemos estudiado. Nuestros datos apoyan más el modelo de evolución clonal en la que la mayor parte de las células tumorales son capaces de proliferación y tumorigénesis y la heterogeneidad funcional de las células tumorales es atribuible a influencias aleatorios o estocásticos (intrínsecos o extrínsecos). Esta conclusión se basa en la constatación de que la coexistencia de células madre cancerosas putativas (CSC
+ células) y no las CSC (CSC
- células) exhibieron capacidad similar para la proliferación y la tumorigénesis y que ambos subconjuntos podrían dar lugar a CSC
+ y CSC
- progenie. Nuestros resultados sugieren que las limitaciones del uso de estos marcadores de forma independiente para diferenciar las células madre del cáncer de células no tumorigénicas debido a la plasticidad fenotípica de las células tumorales.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética
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