: PLOS ONE
Extracto
Para explorar la diversidad y la consistencia de las vías de señalización que regulan la migración de células tumorales, elegimos tres líneas celulares de tumores humanos que migraron después del tratamiento con EGF. Posteriormente cuantificamos el efecto de los inhibidores de quince en los niveles de expresión o los niveles de fosforilación de nueve proteínas que fueron inducidos por la estimulación de EGF en cada una de estas líneas celulares. Sobre la base de los datos obtenidos en este estudio y los supuestos químico-biológicas, hemos deducido rutas de migración de células en cada línea de células tumorales, y luego los comparamos. Como resultado, se encontró que tanto la MEK /ERK y JNK vías /c-Jun se activan en las tres líneas celulares que migran. Por otra parte, se encontró que la GSK-3 y p38 para regular la vía PI3K /Akt en células sólo EC109, y JNK se encontró a la diafonía con p38 y Fos relacionados con la vía en que sólo las células TT. Tomados en conjunto, nuestro sistema analítico podría fácilmente distinguir entre las vías específicas de tipo común y celulares responsables de la migración de células tumorales
Visto:. Magi S, Saeki Y, Kasamatsu M, E Tashiro, Imoto M (2014) Química Los análisis genómicos Pathway-basados para la señalización mediada por el Factor de Crecimiento epidérmico en las células cancerosas migratorias. PLoS ONE 9 (5): e96776. doi: 10.1371 /journal.pone.0096776
Editor: Laszlo Buday, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 10 de noviembre de 2013; Aceptado: April 11, 2014; Publicado: 12-may 2014
Derechos de Autor © 2014 Magi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas para impugnar la investigación exploratoria y JSP Fellows, el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La migración celular es fundamental para muchos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la reparación de heridas, las respuestas inmunes, así como la invasión de células tumorales y la metástasis [1]. Cuando una célula tumoral se mueve, varias vías de señalización son iniciados a través de receptores tirosina quinasas (RTK), los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), integrinas, y otros receptores. Un ejemplo notable de un RTK es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que se activa por la unión de su ligando, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) [2]. La activación de EGFR conduce a la activación de una o más ramas de la red de señalización intermedio que regulan la motilidad celular, tales como la vía extracelular regulada quinasa (ERK) [3], el phosphoinositide 3-OH quinasa vía (PI3K) [4], la quinasa Janus (Jak) vía [5], la c-Jun NH2 terminal de quinasa (JNK) vía, y la ruta de p38 [6], [7].
los elementos básicos de la migración en la señalización intracelular la red se ha demostrado en estudios previos. Sin embargo, es probable que las moléculas de señalización que regulan la migración celular en una célula de cáncer pueden no regular la migración celular en las otras células cancerosas genéticamente distintas. Varios informes anteriores han indicado que cada tipo de célula de cáncer inicia la migración en diferentes contextos utilizando repertorios moleculares distintas, a pesar de que el mismo proceso básico de la migración celular se induce [8], [9]. Por lo tanto, la comprensión de la diversidad y la generalidad de las vías de señalización que regulan la migración de células tumorales en diversos tipos de células es importante no sólo para la investigación básica en la migración celular, sino también para el desarrollo de fármacos anti-tumorales anti-metastáticos.
para abordar esta cuestión, hemos investigado previamente el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas de diez tipos de células del sistema migración. Hemos distinguido entre las señales específicas de tipo común y celulares responsables de la migración celular [10]. Investigaciones anteriores han indicado qué moléculas están realmente involucrados en la migración de células de cada tipo de célula cancerosa. Sin embargo, las redes de señalización de estas moléculas que regulan la migración celular no están claros. En este informe, para abordar esta cuestión, hemos utilizado un enfoque que combina la genética química y la biología de sistemas, que poco a poco se ha reconocido como un método útil para deducir las redes vía de señalización [11]. En nuestro informe anterior, se encontró que tres líneas celulares de cáncer (es decir, células de carcinoma epidérmico A431, células de carcinoma EC109 esofágicas, y células de la tiroides carcinoma TT) adquirieron la motilidad celular por la estimulación de EGF, pero el análisis de conglomerados quimiosensibilidad mostraron que las células A431 y células EC109 son agrupados en el mismo grupo, por otro lado, las células TT se clasifican en los diferentes clúster. Por lo tanto, en este estudio, para revelar la diversidad y la comunidad de vía de señalización inducida por EGF regulación de la migración celular en estos tres células, se analizó cuantitativamente el efecto de los inhibidores químicos en los niveles de expresión inducida por EGF o el nivel de fosforilación de varias moléculas de señalización para identificar que actúa molécula de señalización aguas arriba de otras moléculas de señalización. Utilizando los resultados de estos experimentos, hemos mapeado una vía de migración de las células en cada línea celular de cáncer, y se compararon los mapas de ruta para revelar la topología de la red como siendo común a todas las células cancerosas o específica a ciertos tipos de células.
resultados
los diferentes patrones de activación de la señalización de EGF entre tres líneas celulares de cáncer
en primer lugar, hemos detectado la fosforilación o la expresión de moléculas inducidas por EGF en tres líneas celulares de cáncer de más de un transcurso de tiempo de señalización (Figura 1 y S1). La autofosforilación del receptor de EGF y la posterior fosforilación inducida por EGF de p38 se observó tanto en todas las líneas celulares después de 5 min después de la estimulación de EGF, como es bien conocido. El aumento en la expresión de c-fos y la fosforilación de c-Jun se observaron en todas las líneas celulares 1 h después de la estimulación de EGF. Por otro lado, varias otras moléculas mostraron diferentes perfiles de activación dependientes del tiempo entre las tres líneas celulares de cáncer. Por ejemplo, se indujo la fosforilación de Akt (residuos de p-Akt, S473 y T308) entre 5 min y 1 h después de la estimulación de EGF en las células EC109 y células TT. Sin embargo, los niveles de fosforilación de Akt-p (S473) y p-Akt (T308) en las células A431 fueron algo constante, incluso después de la estimulación de EGF de hasta 12 h. Además, la intensidad relativa de p-Akt (T308) mostró un máximo de intensidad 5 min después de la estimulación de EGF en las células TT, pero después de 1 h en células EC109. El patrón de la fosforilación de ERK (p-ERK) también es diferente entre las tres líneas celulares de cáncer. ERK fue transitoriamente fosforilado por la estimulación de EGF en las tres células, mientras que su pico se observó 5 min después de la estimulación de EGF en células A431 y células EC109, y después de 1 h en las células TT. El nivel de expresión de EGFR comenzó a disminuir después de la estimulación de EGF en las células EC109 y células TT, pero no en células A431.
células A431, células EC109, y las células TT se estimularon por EGF (30 ng ml
-1) durante el tiempo indicado y los lisados de células totales fueron sometidos a transferencia Western. A.u., unidad arbitraria normalizó por la intensidad de la actina. Se muestran las medias y DE de tres experimentos independientes. Los colores del gráfico representan los datos de cada línea celular: las células A431 (rojo), las células EC109 (verde), y las células TT (Azules). La línea discontinua indica que la estimulación de EGF no causó un cambio significativo de a.u. de cada molécula (ANOVA de una vía). inmunoblot imágenes originales se muestran en la Figura S1.
Los efectos de los inhibidores de la migración sobre la migración inducida por EGF señalización
A continuación, se examinaron los efectos de los inhibidores de 15, lo que afectó la capacidad de las células migren en nuestro informe anterior [10], en la fosforilación o la expresión de estas moléculas de señalización en el punto de tiempo que muestra la más alta intensidad de cada molécula de señalización inducida por EGF como se indica por los datos del curso del tiempo (Tabla S1) en cada línea celular de cáncer ( Figura S2). Tabla S2 enumera los nombres y las concentraciones experimentales utilizadas de los inhibidores químicos de la transducción de señales utilizadas en este estudio, y sus modos de acción. Las imágenes de inmunotransferencia en la Figura S2 incluyen bandas para cada una de cuatro condiciones: control negativo (EGF - y inhibidor -, carril 1), control positivo (EGF + e inhibidor -, carril 2), tanto EGF y tratados con inhibidor de la condición (EGF + y el inhibidor de +, carril 4) - y el inhibidor +, carril 3), y la condición (EGF inhibidor-tratada. Para cuantificar el efecto de los inhibidores, se normalizaron luego la intensidad de la señal de manera que el carril 1 (es decir, no tratado condición) fue designado como 0, y el carril 2 (es decir, la condición de EGF-tratado) fue designado como 1. Sobre la base de estas normas, se cuantificó la intensidad relativa de la señal de las calles 3 y 4, y finalmente se obtuvieron datos cuantitativos sobre el efecto de los inhibidores químicos de la señalización de la migración inducida por EGF en cada línea celular (Figura 2).
los mapas de calor representar los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas en la señalización inducida por EGF en células A431 (arriba), las células EC109 (centro), y las células TT (parte inferior). Los datos se normalizaron por el centrado condición de no tratar como 0, y la ampliación condición tratados con EGF a 1. Todas las líneas celulares se trataron con EGF después de un tratamiento previo con inhibidores de 15 min. Después del tiempo indicado, las células se recogieron y se sometieron a transferencia de Western. AMD; Actinomicina D, CHX; La cicloheximida, HMA; Herbimicina A. La concentración de inhibidores químicos se enumeran en la Tabla S2. inmunoblot imágenes originales se muestran en la Figura S2.
Deducción de la señalización de la migración en tres líneas celulares de cáncer
Luego trató de deducir la red de señalización que regula la migración de células en cada línea celular de cáncer basan en los perfiles de chemosensitivity obtenidos en el estado de la expresión de EGF inducida por moléculas de señalización. En el campo de la biología química, una vía de señalización puede deducirse utilizando el concepto descrito en la figura 3 (véase también, Procedimientos Experimentales). Para determinar si los inhibidores de las moléculas de señalización perturbados o no, que definen ± 0,5 como umbral. En el caso de la figura 3a, el inhibidor de MEK U0126 suprimió la fosforilación inducida por EGF de ERK (p-ERK) en más de un 50%. En tales casos, definimos dos reglamentos de señales positivas; uno de EGFR para MEK, y el otro de MEK a p-ERK. En el caso de la figura 3b, el inhibidor de PI3K LY294002 aumentó la expresión de c-Fos inducida por EGF en más de un 50%. En estos casos, se definió la existencia de una relación de regulación positiva del EGFR en c-Fos y una relación de regulación negativa de PI3K de c-Fos. En el caso de la figura 3c, el SB415286 inhibidor de GSK-3 aumentó la expresión de c-Jun sin estimulación EGF. En estos casos, se definió la existencia de una relación de regulación positiva de EGFR a c-Jun y una relación de regulación negativa de GSK-3 a c-jun. De esta manera, basado en el perfil semi-cuantitativa (Figura 2 y el concepto descrito en la figura 3), se deduce una red de señalización para cada línea celular de cáncer como un gráfico dirigido firmado (Figura 4). La vía de la migración inducida por EGF en células A431 constaba de 19 nodos y 39 bordes (Figura 4a), la ruta en células EC109 consistió de 22 nodos y 62 bordes (Figura 4b), y la ruta en células TT consistió en 21 nodos y 51 bordes (Figura 4c). La razón por la que el número de vías en las células A431 es menor que en las otras dos líneas de células podría ser que los niveles de p-Akt (T308) y p-Akt (S473) no pudieron ser evaluados en las células A431.
una descripción detallada se presenta en la sección de la sección de resultados y procedimientos experimentales.
EGF inducida por la migración de la red de señalización en (a) células A431, (b) células EC109, y (c) las células TT. El umbral se fijó en ± 50% de control positivo. El color del borde se decide en base a la señal de bordes; rojo indica la señalización positiva y azul indica señalización negativa. El tamaño del nodo indica el número de bordes de conexión. El color del nodo indica el número de vías de salida:. Una escala de color degradado de verde a rojo, interpolados sobre amarillo
Comparación de las vías de señalización en cada línea celular de cáncer
Based en estos mapas de ruta, se extrajo la estructura común de las vías de señalización para la migración celular en las tres líneas celulares de cáncer examinados en este estudio. La figura 5a representa la topología común entre las tres líneas celulares. Esta vía común incluye la vía MEK /ERK /c-Fos y la vía /c-Jun JNK, que ambos han sido ampliamente investigado en el campo de la migración celular [6], [7], [12], [13]. También se encontró que MEK regula los niveles de expresión de c-Fos y p21, y que PI3K suprimió los niveles de expresión de c-Fos en las tres líneas celulares de cáncer. Por otro lado, otras señales de EGFR-regulada, como el rock y CysLT1 no tenían vías de salida, lo que sugiere que las señales descendentes de estas moléculas pueden variar entre cada línea celular de cáncer. A continuación, se evaluaron las estructuras específicas de las vías de señalización relacionadas con la migración en cada una de las líneas celulares de cáncer (Figura 5b~d). La vía específica en células A431 incluye sólo 11 vías, incluyendo p-JNK → la expresión de c-Jun y 5-lipoxigenasa (5-LO) → c-Fos. El número de vías específicas en las células EC109 y en las células TT son 24 y 13, respectivamente, lo que indica que aproximadamente un quinto a un tercio de las vías en estas células son las vías de células de tipo dependiente.
(una ) de la red de señalización común EGF inducida entre tres líneas celulares de cáncer. (B~d) de red de señalización inducida por EGF específica en (b) células A431, (c) células EC109, y (d) las células TT. El color del borde se decide en base a la señal de bordes; rojo indica la señalización positiva y azul indica señalización negativa.
En un estudio anterior, se predijo que las vías similares inducen y regulan la migración celular en las células A431 y células EC109, pero estas vías pueden ser diferentes de TT las células [10]. Para aclarar la diferencia de caminos entre los dos grupos de señalización, que luego se compararon las vías de señalización de las células y las células TT EC109 que incluye todos los mismos nodos (Figura 6). La figura 6a muestra la topología de la vía solapada en ambas líneas celulares. Este itinerario de ruta incluye PI3K → p-Akt, JNK → p-Akt (S473) y Rock → p-p38, lo que sugiere que estas vías juegan un papel consistente en la migración celular. Figura 6b, c presenta las topologías vía específica en las células EC109 y células TT, respectivamente. Un total de 29 vías (47% de las vías en las células EC109), tales como MEK → c-Jun, GSK-3 → p-Akt (S473) y HMG-CoA → pAkt (T308), son específicos para células EC109, y 18 vías (35% de las vías en las células TT), incluyendo p-JNK → p-p38, y Rock → c-Fos, son específicos de las células TT. La fosforilación de la p-Akt está regulado por p38, GSK-3, y de la HMG-CoA en las células EC109, mientras que no había una vía positiva específica de p-Akt en células TT. Por otro lado, JNK es necesaria para el aumento tanto de la expresión de c-Fos y la fosforilación de p38 en las células TT, mientras que dicha regulación no se observó en células EC109. Por otra parte, hay un EGFR-p38 Lazo de retroalimentación positiva en las células TT pero no hay tal ruta en células EC109. Estos resultados indican que la activación de Akt puede ser esencial para la migración celular de las células EC109, pero vía de activación de Akt depende de los tipos de células de cáncer. Por otra parte, vía MAPK de respuesta al estrés puede ser dominante en la vía de regulación de la migración celular de las células TT
.
(a) a la red de señalización común entre las células y las células TT EC109. (B) la red de señalización inducida por EGF específica en las células EC109. (C) de red de señalización inducida por EGF específica en células TT. El color del borde se decide en base a la señal de bordes; rojo indica la señalización positiva y azul indica señalización negativa.
Discusión
En este estudio, hemos mapeado las vías de señalización de regulación de la migración celular en las células A431 de carcinoma epidérmico, células de carcinoma esofágico EC109 y células de carcinoma de tiroides TT. Mediante la comparación de ellos, que reveló las vías comunes en las tres líneas celulares y se identificaron las vías de señalización celular de tipo específico, basado en un enfoque de la biología genética y sistemas químicos. Para lograr este objetivo, en primer lugar, se compararon los patrones de activación dependientes del tiempo de las moléculas de señalización en cada línea celular implicado en la migración celular inducida por EGF. Los patrones de activación de algunas moléculas de señalización son parcialmente diferentes entre las tres líneas celulares de cáncer (Figura 1). Por ejemplo, los patrones de activación de c-Fos y p-p38 son muy similares entre las tres líneas celulares de cáncer probadas, mientras que los patrones de p-ERK y p-c-Jun son diferentes. Las intensidades relativas de sostenido p-ERK y p-c-jun en células TT son más altos que los de las células A431 y células EC109. Curiosamente, esta diferencia está de acuerdo con las clasificaciones de informes anteriores de los perfiles chemosensitivity de estas tres líneas celulares [10], lo que sugiere que ERK sostenido y la fosforilación de c-Jun están implicados en las vías específicas de tipo celular para la migración celular en las células TT. Teniendo en cuenta un mecanismo de retroalimentación positiva por el cual sustenta la actividad de JNK puede promover la señalización a través de IRS-2 ERK [14] se informó, estos mecanismos también pueden operar en la migración celular TT. Por el contrario, la fosforilación de Akt se indujo mediante la estimulación de EGF en las células EC109 y células TT, pero los niveles de fosforilación de Akt eran algo constante en las células A431 después de la estimulación de EGF. Anteriormente, se informó de que la migración inducida por EGF de células A431 es suprimida por la adición de inhibidores de PI3K [10]. Por lo tanto, aunque EGF no indujo significativamente la fosforilación de Akt, Akt fosforilada estado estacionario y activado se requiere para la migración inducida por EGF de células A431. Otra diferencia en los datos de curso de tiempo entre las tres líneas celulares de cáncer se muestra por el nivel de expresión de EGFR. estimulación EGF disminuyó el nivel de expresión de EGFR en las células EC109 y células TT, pero no en células A431. Cuando EGF se une a EGFR, EGFR se conoce para ser internalizado rápidamente de la superficie celular a través de varias vías, incluyendo depresiones revestidas de clatrina [9], [15]. receptores internalizados o bien se reciclan a la superficie celular o transportados a lisosomas para degradación. Es bien sabido que el destino de los receptores es controlada por varias proteínas tras la internalización, tales como Cbl y LRRK1 [16], [17]. Por lo tanto, nuestros resultados podrían indicar que la regulación de la degradación del receptor de EGF inducida es diferente entre las tres líneas celulares de cáncer, y esta diferencia determina la activación sostenida de los objetivos de señalización corriente abajo.
vías de regulación de la migración de células en cada cáncer línea celular se determinó mediante el examen de los efectos de los inhibidores de la migración celular en las moléculas de transducción de señales (Figura 4). La topología vía solapada en las tres líneas celulares sometidas a prueba incluye JNK → p-c-Jun, que se prevé como un regulador común en un estudio anterior. Esto sugiere que la señalización de regulación para la migración de células de cáncer de JNK a través de la fosforilación de c-Jun es en realidad un mecanismo común en todos los tipos de células cancerosas. Debido a que no hemos podido detectar importantes sobre regulación de p-Akt en células A431 EGF-estimulado en este estudio, EGF mapa vía de señalización en las células A431 no podía incluir la regulación de p-Akt y por lo tanto incluye un menor número de nodos y bordes de aquel en el EC109 las células y las células TT en nuestro método de análisis. Por lo tanto, una interpretación de la comparación entre los mapas de ruta entre tres líneas celulares de cáncer debe hacerse con precaución.
Para discutir y confirmar los resultados del análisis de conglomerados en nuestro informe anterior [10], que finalmente se comparó el itinerario de ruta responsables para la migración celular entre las células y las células TT EC109, y determina la topología solapada o de tipo celular específico (Figura 6). ondas de la fosforilación de Akt en células EC109 son más lentas que la de las células TT (Figura 1 y Tabla S1), lo que sugiere que las proteínas más intermedios regulan la fosforilación de Akt en células EC109 que las células TT. De hecho, el nivel de fosforilación de Akt fue hasta reguladas por p38, GSK-3, y HMG-CoA en las células EC109, mientras que estas vías no se incluyeron en las células TT (Figura 6b, c). Por otro lado, ERK ondas de fosforilación en células TT son más lentos y más continuo que en las células EC109 (Figura 1 y Tabla S1), lo que sugiere que las proteínas más intermedios regulan la fosforilación de ERK en las células TT que las células EC109. Sin embargo, no hemos podido detectar ninguna regulación específica, que puede sostener el nivel de fosforilación de ERK en células TT. Consideramos que otra molécula que no se evaluó en este estudio puede contribuir a la fosforilación de ERK sostenido. Estas diferencias en la vía de señalización inducida por EGF pueden reflejar diferencias en el modo de la migración celular basado en la morfología celular. En nuestro estudio anterior, encontramos que las células EC109 se trasladaron al tiempo que conserva los contactos célula-célula (migración colectiva), pero las células TT cambiaron como células individuales (migración individual) [10]. A la luz de los resultados anteriores, es probable que las células cancerosas se mueven como una sola célula cuando vía MAPK se activa continuamente, mientras que, las células migran colectivamente y mantienen la adhesión célula-célula cuando la vía PI3K /Akt se activa continuamente por p38 y GKS- 3. Estas funciones distintas de las vías de MAPK y PI3K para los modos de migración también son compatibles con los siguientes informes anteriores. la activación de MAPK por consiguiente induce la activación de RhoA y epitelio-mesenquimal transición, mientras que la activación de PI3K suprime la actividad de RhoA en el cáncer de colon [9]. Además, PI3K es reclutado para los complejos de adhesión [18] donde su activación a través de impactos de señalización cadherina función de las cadherinas y la adhesión célula-célula [19], [20] fortalece. Esto podría implicar la activación de PI3K Rac1 inducida, debido a la E-cadherina-estimulado la reorganización del citoesqueleto de actina requiere la activación de Rac activada y GEF-PI3P Tiam1 [21].
En conjunto, nuestros análisis de vías, con base genómica química en las células del cáncer de tres líneas demuestran la consistencia y la variedad en la vía de señalización de regulación inducida por EGF para la regulación de la migración de células de cáncer entre los tipos de células utilizando un enfoque de combinación de la biología y la química biología de sistemas. En particular, la GSK-3 y p38 regula p-Akt en sólo células de carcinoma de esófago EC109, por otra parte, JNK regula ruta de p38 y Fos relacionados sólo en las células TT de carcinoma de tiroides. Estos hallazgos indican que algunas células de tipo específico vía de señalización de la migración de células de regulación sería dianas moleculares terapéuticos para el tipo de células de metástasis de cáncer específica: GSK-3 y p38 vías relacionadas en el carcinoma de esófago, y las vías de estrés sensibles al MAPKs-relaterd en carcinoma de tiroides . Sin embargo, para entender la coherencia y la variedad de la vía de señalización de regulación más precisa, hay varias cuestiones que debemos tratar en el futuro. Aunque se utilizó un inhibidor contra una molécula de señalización en este estudio, varios inhibidores contra una molécula de señalización deben ser usados para confirmar la especificidad de los inhibidores. Por otra parte, el tiempo cuando evaluamos los efectos de los inhibidores de la fosforilación o la expresión de estas moléculas de señalización inducida por EGF debe ser verificada. Cabe también ideó cómo distinguir vía de reglamentación para la migración celular de la de otras respuestas celulares, tales como el crecimiento celular. Sin embargo, en este estudio, proporcionar un nuevo enfoque para la comprensión de las características de la señalización de la migración de las células cancerosas, y abrir el potencial para revelar una vía molecular novela como un objetivo para la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
células A431 (obtenido de ATCC CRL-1555) se mantuvieron en DMEM suplementado con 5% de suero de ternera (CS), 0,1 gl
-1 kanamicina, 100 unidades de ml
-1 penicilina G, 0,6 gl
-1 L-glutamina, y 2,5 gl
-1 NaHCO
3. EC109 (regalo del Dr. Doki, Universidad de Osaka, Japón), las células TT (dotado de la compañía KIRIN, Japón) se mantuvieron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio suplementado con 5% de FBS, 0,1 gl
-1 kanamicina , 100 ml unidades
-1 penicilina G, 0,6 gl
-1 L-glutamina, y 2,5 gl
-1 NaHCO
3. Para el cultivo de rutina, las células se incubaron en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en 5% de CO
2.
Reactivos
AG1478 (inhibidor de EGFR), rapamicina (inhibidor de mTOR), y Y27632 (inhibidor de ROCK) se adquirieron de Calbiochem. MK571 (inhibidor de CysLT1) se adquirió de Cayman. AA861 (inhibidor de la 5-lipoxigenasa), actinomicina D (inhibidor de la transcripción), cicloheximida (inhibidor de la traducción), LY294002 (inhibidor de PI3K), mevastatina (HMG-CoA reductasa), MG132 (proteasoma inhibidor), SB203580 (inhibidor de p38), SB415286 ( GSK-3 inhibidor), SP600125 (inhibidor de JNK), U0126 (inhibidor de MEK), y Factor de Crecimiento epidérmico (EGF) fueron adquiridos de Sigma. Herbimicina A (inhibidor de la Hsp90) se purificó a partir de cultivos de
Streptomyces sp
. en nuestro propio laboratorio.
Western Blot
Tras el pretratamiento con vehículo o inhibidores durante 15 minutos, las células fueron tratadas con EGF durante el tiempo indicado. Las células se lisaron en tampón RIPA (25 mM Hepes pH 7,8, 1,5% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, 0,5 M NaCl, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, vanadato de sodio 0,1 mM, PMSF 1 mM, y 0,1 mg ml
-1 leupeptina) a 4 ° C con ultrasonidos. Los lisados se centrifugaron y se recuperaron los sobrenadantes. Después de determinar la concentración de la proteína en cada lisado, y punto de ebullición en un volumen igual de tampón de carga (150 mM Tris pH 6,8, 30% de glicerol, 3% de SDS, 15 mg ml
-1 bromofenol colorante, y 100 mM 2 mercaptoetanol), las muestras fueron entonces a electroforesis en un gel de poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF, y a inmunotransferencia. Los anticuerpos empleados para inmunotransferencia fueron: anti-EGF receptor de anticuerpos (# 2232), el anticuerpo anti-Akt (# 9272), anti-fosfo-Akt anticuerpo (Thr308) (# 9275), el anticuerpo anti-fosfo-Akt (Ser473) (# 9271),-Jun anti-c de anticuerpos (# 9165), el anticuerpo anti-fosfo-p38 (# 9211), anti-MAPK (ERK 1/2) de anticuerpos (# 9102), anti-fosfo-MAPK (ERK 1/2 ) de anticuerpos (# 9101) (Cell Signaling); anti-c-Fos anticuerpo (sc-7202), el anticuerpo anti-p38 (sc-7972), el anticuerpo anti-p21 (sc-397) (Santa Cruz Biotechnology); anticuerpo anti-fosfo-tirosina (05-321) (Upstate); anti-fosfo-c-Jun anticuerpo (558.036) (BD Pharmingen); anti-β-actina de anticuerpos (A5316) (Sigma).
El análisis estadístico
Un modelo lineal se utiliza para determinar diferencias significativas en los conjuntos de datos de series de tiempo. Un coeficiente de correlación momento-producto de Pearson se utilizó para confirmar la reproducibilidad de los datos. Estos análisis estadísticos se calcularon utilizando el R (www.r-project.org/).
deducción de red basado en biología química
La red dirigida firmado se dedujo a partir de una diferencia en la fosforilación de proteínas o los niveles de expresión entre modelo de tratamiento y tratados con inhibidor de datos, de acuerdo a la regla se muestra en la Figura 3. Esta norma incluye tres supuestos simples que se usan comúnmente en biología química: a) que existe una regulación positiva de una molécula a otra X y cuando el nivel de la molécula de y en la presencia tanto de EGF y un inhibidor de X es más de 50% menor que en la condición tratados con EGF; b) Existe una regulación negativa de molécula a molécula X Y cuando el nivel de la molécula de Y en la presencia tanto de EGF y el inhibidor de X es más de 50% mayor que en la condición tratados con EGF; c) Existe una regulación negativa de molécula a molécula X Y cuando el nivel de la molécula de Y en presencia de inhibidor de X es mayor que la media del nivel en condición tratados con EGF. El procesamiento de datos que finalmente da salida a la información vía consiste en nodo de origen, nodo de destino, y el tipo de regulación (positiva o negativa) se llevó a cabo mediante el uso de R. Este archivo se importa en el software Cytoscape (www.cytoscape.org/), y la señalización mapas de ruta fueron generados. La comparación de la topología vía también se lleva a cabo utilizando Cytoscape plugin de fusión avanzada de red.
Apoyo a la Información
Figura S1.
imágenes representativas de inmunoblot presentan en la Figura 1. (a) células A431, (b) células EC109, y (c) las células TT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s001 gratis (PDF)
figura S2.
imágenes representativas de inmunoblot presentan en la Figura 2. (a) células A431, (b) células EC109, y (c) las células TT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s002 gratis (PDF)
Tabla S1. . Francia El cronograma de evaluación de los efectos de los inhibidores
doi: 10.1371 /journal.pone.0096776.s003 gratis (DOCX)
Tabla S2.
Las concentraciones del compuesto y objetivos de la inhibición utilizaron en este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s004 gratis (DOCX)