Extracto
(-) - epigalocatequina-3-galato (EGCG) es la más extensa polifenol del té estudiado por su función anti-cáncer. En este estudio, se presenta un nuevo mecanismo de acción para la muerte celular mediada por el EGCG mediante la identificación de la función crítica de la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP). En primer lugar, se encontró que la muerte celular inducida por EGCG en las células de cáncer humano (tanto HepG2 y HeLa) a ser independiente de caspasas y acompañado por vacuolización citosólica evidente, solamente observable cuando se trataron las células en medio libre de suero. La vacuolización citosólica observada en las células tratadas con EGCG muy probablemente fue causado por la dilatación lisosomal. Curiosamente, EGCG fue capaz de interrumpir el flujo de autofagia en la etapa de la degradación por la alteración de la función lisosomal, y la muerte celular inducida por EGCG era independiente de ATG5 o la autofagia. La principal conclusión de este estudio es que el EGCG es capaz de desencadenar LMP, como lo demuestra la tinción Liso-Tracker Red, translocación citosólica de catepsina D y la acidificación citosólica. Consistentemente, un agente lysosomotropic, cloroquina, rescata efectivamente la muerte celular a través de la supresión de la acidificación causada citosólica-LMP. Por último, hemos encontrado que EGCG promueve la producción de ROS intracelulares aguas arriba de LMP y la muerte celular, como se evidencia por el aumento de nivel de ROS en células tratadas con EGCG y los efectos protectores de antioxidante N-acetilcisteína (NAC) contra la muerte LMP y la célula EGCG mediada . Tomados en conjunto, los datos de nuestro estudio revelan un nuevo mecanismo que subyace a la muerte celular inducida por la participación de EGCG ROS y LMP. Por lo tanto, la comprensión de esta vía de muerte celular lisosoma asociada a arrojar nuevas luces sobre los efectos anticancerígenos de EGCG
Visto:. Zhang Y, Yang ND, Zhou M, Shen T, T Duan, Zhou J, et al . (2012) (-) - epigalocatequina-3-galato induce a la no-apoptóticos muerte celular en células humanas de cáncer a través de ROS mediada permeabilización de la membrana lisosomal. PLoS ONE 7 (10): e46749. doi: 10.1371 /journal.pone.0046749
Editor: Shi-Yong Sun, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2012; Aceptado: 4 Septiembre 2012; Publicado: 8 Octubre 2012
Copyright: © Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (81028014 y 81172659 a ZXQ y SHM) y de Singapur Consejo de investigación médica Nacional (NMRC /1260/2010-IRG09nov070 a SHM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los beneficios del consumo de té para la salud han sido bien establecidos a través de diversos estudios en seres humanos. La mayor parte de estos beneficios, incluyendo la prevención del cáncer y las enfermedades cardiovasculares, se han atribuido a los componentes polifenólicos del té [1]. A medida que el constituyente más abundante y biológicamente activa entre los polifenoles del té, (-) - epigalocatequina-3-galato (EGCG) ha recibido una gran atención en la investigación del cáncer [2]. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la función de anti-cáncer de EGCG se han estudiado ampliamente. Se sabe que el EGCG puede unirse a dianas moleculares múltiples, incluyendo los receptores transmembrana, quinasas u otras proteínas clave, por lo tanto afecta a una variedad de vías de señalización, lo que resulta en el crecimiento de la inhibición, la apoptosis o la supresión de la invasión, la angiogénesis y la metástasis [3]. Entre ellos, la capacidad del EGCG para la inducción de la muerte celular en células de cáncer se considera como uno de los mecanismos clave relacionados con su función anti-cáncer [4]. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos de la muerte celular inducida por el EGCG no han sido completamente aclarada. La mayoría de los informes anteriores han concluido que EGCG induce la apoptosis mediada por caspasa en diversas células tumorales a través de vía mitocondrial [5], [6] o a través del receptor de muerte [7], mientras que sólo unos pocos estudios demostraron la muerte de células no apoptosis causada por EGCG [8], [9].
Entre los diversos mecanismos de muerte celular mediada por EGCG, especies reactivas de oxígeno (ROS) y el estrés oxidativo parece ser particularmente importante. Aunque EGCG con una estructura de tipo pirogalol en el anillo B procesa una fuerte actividad antioxidante, esta estructura se prueba que es inestable en célula del sistema cultivadas [10]. La auto-oxidación de EGCG en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) produce cantidad sustancial de ROS, especialmente H
2O
2, que desempeña un papel importante en el efecto citotóxico de EGCG contra líneas celulares de cáncer [11], [12]. Se informó de adición de antioxidantes en el medio de cultivo para inhibir EGCG apoptosis inducida por [13], [14]. Recientemente, las implicaciones de ROS y estrés oxidativo en la muerte de células no apoptóticas o necrosis han ido aumentando apreciado [15]. Por lo tanto, es de interés para comprender mejor el papel de ROS y del estrés oxidativo en la muerte celular mediada por EGCG, incluyendo tanto la apoptosis y la muerte celular no apoptótica.
lisosomas son orgánulos rodeados de membrana citoplásmica que contienen enzimas hidrolíticas y que el control del volumen de negocios intracelular /degradación de macromoléculas [16]. En los últimos años, la función biológica de los lisosomas se ha apreciado cada vez más, y se sabe que juega un papel crítico en diversos procesos fisiológicos tales como la autofagia y en enfermedades humanas tales como enfermedades de almacenamiento lisosomal, el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas [17]. proteasas lisosomales, que se celebran dentro de la membrana en condiciones normales, se filtraban en el citosol, en tanto la apoptosis y necrosis [18]. Uno de los procesos clave que se sabe que está estrechamente asociado con el proceso de la muerte celular es permeabilización de la membrana lisosomal (LMP) [19]. El resultado exacto de LMP depende de la extensión del daño de la membrana lisosomal. Una ruptura masiva de los lisosomas y liberación rápida de sus contenidos ácidos son a menudo un paso crítico para la necrosis; mientras que la fuga lisosomal parcial y selectiva se asocia a menudo con el proceso de apoptosis [20], [21]. Hay muchos factores conocidos para interrumpir la integridad de la membrana lisosomal y causar LMP, incluyendo ROS, detergentes lisosomotrópicos, toxinas microtúbulos y algunos lípidos [17], [19]. Por ejemplo, se sabe que algunos agentes anticancerígenos tales como vincristina y siramesine para causar la muerte lisosoma-dependiente de células [22], [23]. Hasta el momento, no se sabe si el lisosoma está implicado en la muerte celular inducida por el EGCG en las células cancerosas.
En este estudio tuvo como objetivo examinar más a fondo los mecanismos moleculares que subyacen a la muerte celular mediada por el EGCG. Nuestros resultados demostraron que primero EGCG induce una forma de caspasa-independiente de la muerte de células no apoptóticas, que puede ser aumentada de manera significativa en el medio libre de suero. En segundo lugar, se encontró que EGCG desencadena LMP, dando lugar a fugas de sus proteasas clave (catepsinas) en el citosol, y la muerte celular. Curiosamente, como la muerte celular es independiente de la autofagia. Por último, hemos proporcionado una clara evidencia que muestra que el EGCG promueve la formación de ROS intracelular que funciona como un proceso clave que conduce a LMP y la muerte celular. Por lo tanto, los datos de este estudio identifican un nuevo mecanismo de la muerte celular inducida por EGCG en las células de cáncer que implica el estrés oxidativo, daño lisosomal y, finalmente, la muerte celular.
(A) la privación de suero promueve la muerte celular inducida por EGCG en una concentración -dependiente y del curso del tiempo. células HepG2 fueron tratados con diferentes dosis de EGCG en medio completo o libre de suero durante 12 h (panel izquierdo) o con 60 mM EGCG para tiempo diferente como se indica (panel derecho). La viabilidad celular se determinó por Hoechst-PI doble tinción (n = 3, media ± SD). (B) Representante imágenes de Hoechst-PI doble tinción. las células HepG2 se cultivaron en medio completo (como control); tratados con 60 mM EGCG durante 12 h en medio libre de suero; o se incubaron con 20 ng /ml TNF y 10 mg /ml CHX durante 12 h en medio completo (como un control positivo para la apoptosis). (C) EGCG induce la muerte celular independiente de caspasas. células HepG2 fueron tratados con EGCG (60 mM x 24 h) o en la ausencia o presencia de 40 mM z-VAD-fmk. Se utilizó la co-tratamiento con TNF (20 ng /ml) y CHX (10 mg /ml) durante 12 h como control positivo. Se determinó la viabilidad celular como se describe en el Panel A. **
p Hotel & lt; 0,005 en comparación con el grupo sin z-VAD (de Student
t-test
, n = 3). (D) No caspasa-3 y PARP activación causa la escisión por la muerte celular inducida por EGCG. Las células fueron tratadas con EGCG o TNF /CHX como se describe en el panel C, y se recogieron y sujeto a transferencia de western de lisados celulares.
Materiales y Métodos
Productos químicos, reactivos y anticuerpos
(-) - epigalocatequina-3-galato (EGCG, & gt; 90%) se adquirió de la Universidad de Zhejiang Tea Research Institute. 5- (y-6) -chloromethyl-2 ', éster de diacetato de acetil 7'-dichlorodihydrofluorescein (CM-H
2DCFDA), Hoechst33342, y liso-Tracker® Red (DND-99) se obtuvo de Invitrogen. z-VAD-FMK era la forma Enzo. naranja de acridina era de Inmunoquímica Technologies. E-64 D y N-acetilcisteína eran de Merk. El yoduro de propidio (PI), digitonina, la cloroquina (CQ), bafilomycin A1 (Baf A1), pepstatina A y otros productos químicos comunes fueron todos adquiridos de Sigma-Aldrich. Los anticuerpos primarios utilizados en el estudio incluyen los siguientes: anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), anti-caspasa-3 y deshidrogenasa anti-gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) de señalización celular, anti-β-actina y anti-microtúbulos asociada a la proteína 1 de la cadena ligera 3 (LC3) de Sigma-Aldrich, anti-p62 de Abnova, anti-ATG5, anti-catepsina D y proteína de membrana anti-lisosoma-asociado (LAMP-1) de Santa Cruz. La secundaria de anticuerpos, rábano picante de cabra conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón, IgG de cabra anti-conejo y conejo anti-IgG de cabra, eran todos de Thermo Scientific.
(A) Las alteraciones morfológicas de las células tratadas con EGCG en el suero medio exento se analizaron mediante microscopía de luz. imágenes representativas de células HepG2 tratadas con EGCG a las concentraciones indicadas durante 12 h (panel superior) o con EGCG 60 micras para los cursos indicados tiempo (panel inferior) se muestran (barra de escala: 50 micras). (B) las células HepG2 fueron tratados con EGCG (60 o 240 mM) durante 12 h. Después las células se fijaron y se tiñeron por hematoxilina, después se analizaron por microscopía de luz (barra de escala: 30 micras). (C) El contenido de vacuolas no son gotas de lípidos. células HepG2 fueron EGCG (60 M) durante 12 h. células cultivadas en medio completo durante 12 h se utilizaron como un control negativo, y las células tratadas con ácido oleato de 1 mM (OA) en medio DMEM que contenía 1% de BSA para Se han usado 12 h como control positivo. Las células se fijaron y se tiñeron con 0,5% Oil Red O y hematoxilina (barra de escala: 30 micras). (D) Las vacuolas son de origen lisosoma. La tinción de inmunofluorescencia de LAMP-1 se realizó en células MEF después del tratamiento con o sin EGCG (60 mM) durante 9 h (barra de escala: 10 micras).
Cultivo celular y tratamientos
línea celular HepG2 heptoma humana era de la American Type Culture Collection. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), ambos de tipo salvaje (WT) y las células m5-7 con deleción inducible de ATG5 fueron proporcionados por el Dr. N. Mizushima (Tokio Universidad Médica y Dental) [24]. Ambos se cultivaron en DMEM (Sigma-Aldrich) que contiene 10% de suero bovino fetal (Hyclone) y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), en un CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C.
Ensayos de viabilidad celular
En este estudio, la viabilidad celular se cuantificó mediante la prueba de exclusión PI como se ha descrito anteriormente con modificaciones [25]. Para cada muestra, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a 5 x 10
3 por pocillo. El día siguiente, las células se trataron primero como se describe en los resultados y en las leyendas de las figuras, seguido de incubación con 10 mg /ml Hoechst33342 y 5 mg /ml PI durante 15 minutos a temperatura ambiente. Hoechst puede manchar todas las células en azul, mientras que las células muertas se muestran por PI tinción nuclear en rojo. Para cada muestra, se visualizaron sobre 500 células, al azar capturado y se contaron para la viabilidad celular basado en la relación de PI-positiva para células negativas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse TE2000-S).
(A) EGCG aumenta LC3-II y nivel de proteína p62. HepG2 y células MEF se trataron con EGCG (60 M) para las duraciones indicadas en medio completo o en medio libre de suero como se indica. Los lisados celulares se recogieron por western blot. (B) EGCG aumenta la formación de puntos lagrimales GFP-LC3. MEF con la expresión estable de GFP-LC3 (m5-7 células) se trataron con o sin 60 mM EGCG durante 9 h en medio libre de suero y se analizó por microscopía confocal (barra de escala: 20 micras). (C) EGCG no promueve flujo autohpagic. células HepG2 se trataron en medio libre de suero con 60 mM EGCG, 50 nM Baf A1, o ambos durante 9 horas. Los lisados celulares fueron recogidos y sometidos a Western blot. (D) EGCG no tiene ningún efecto sobre la fusión autophagosome-lisosoma. células MEF con la expresión estable de GFP-LC3 se cultivaron en medio libre de suero durante 9 h (como control); tratados con EGCG (60 M × 9 h) en medio libre de suero; o cultivadas en medio EBSS durante 2 h (como control positivo). Las células fueron entonces, se tiñeron LAPM-1 como se describe en la Figura 2D. Las células fueron analizadas por microscopía confocal (barra de escala: 10 micras).
Oil Red O para los lípidos de la gotita de tinción
tinción gotas de lípidos se lleva a cabo utilizando un método establecido [26]. Brevemente, las células HepG2 se sembraron a placa de 24 pocillos en un cubreobjetos y cultivadas durante la noche. Para el control positivo, las células fueron tratadas con ácido oleico 1 mM en DMEM libre de suero que contenía 1% de BSA. Después del tratamiento, las células fueron fijadas con formaldehído, y luego teñidas utilizando 0,5% de aceite-rojo-O en isopropanol durante 30 minutos y los núcleos se tiñeron-contador con hematoxilina.
La tinción de inmunofluorescencia
En este estudio, la proteína de membrana lisosoma-asociado (LAMP-1) fue examinada por la tinción de inmunofluorescencia, basado en un método establecido [27]. Las células tratadas fueron fijadas con 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 min a temperatura ambiente, y se permeabilizaron con 0,01% de saponina en PBS durante 10 min. Después de bloquear con BSA al 1% en PBS durante 30 min, las células se incubaron con LAMP-1 de rata anti-ratón (1D4B) anticuerpo primario (Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma) en una dilución 1:100 durante la noche a 4 ° C, seguido de Alexa Fluor 555 de cabra anti-rata anticuerpo secundario (Invitrogen). Las células se examinaron usando un microscopio confocal (Olympus Fluoview FV1000) y se seleccionaron y se fotografiaron las células representativas.
(A) células MEF con deleción inducible de ATG5 (m5-7 células) se cultivaron con o sin 10 ng /ml de Dox durante 4 días, a continuación, se recogieron y se sujeta a western blot EGCG (60 M × 6 h) y los lisados celulares. (B) La formación de vacuolas es ATG5-independiente. m5-7 células como se describe en el panel A fueron tratados con EGCG (60 M) durante 12 horas y se observaron al microscopio óptico (barra de escala: 30 micras). (C) la muerte celular inducida por EGCG es independiente de la autofagia. células m5-7 como se describe en el panel A se trataron con EGCG (60 M) durante 24 h. La viabilidad celular se determinó por Hoechst-PI doble tinción (n = 3, media ± DE).
lisosomal tinción
lisosomal tinción se realizó utilizando liso-Tracker, una sonda lysosomotropic (Invitrogen) [28]. Se incubaron las células tratadas durante 30 min a 37 ° C con 5 nM de liso-Tracker. Las células fueron examinadas utilizando un microscopio confocal y se fotografiaron representativas imágenes.
Preparación de fracción de membrana por digitonina Extracción
Se utilizó el método para separar las fracciones citosólicas de fracciones de membrana como se informó anteriormente [29 ]. tratamientos Después designadas, las células se suspendieron primero en el tampón de extracción (sacarosa 250 mM, 20 mM HEPES pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM
2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, con la adición de 250 g /ml de digitonina (Sigma) durante 10 minutos en hielo con agitación repetida, seguido de centrifugación (90 segundos, 13.000 rpm, 4 ° C). el resultado entonces sobrenadante se mantuvo como la fracción citosólica y pellet como la fracción de membrana. Esta concentración óptima de digitonina en el tampón de extracción se determinó por el cual se da la extracción eficiente de proteínas citosólicas (analizado por inmunotransferencias utilizando GAPDH como un marcador), al mismo tiempo dejan las membranas lisosomales intacta (usando catepsina D como un marcador).
Western blotting
al final de los tratamientos designados, las células se lisaron en tampón de lisis de células enteras (62,5 mM Tris-HCl a pH 6,8, 20% de glicerol, 2% SDS, DTT 2 mM, PMSF 100 mM y proteinasa cóctel inhibidor). Las muestras con la misma cantidad de proteínas se sometieron a SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad). Después de bloquear con leche no grasa al 5%, se sondeó con anticuerpos primarios y secundarios designados. La membrana se desarrolló con el método de quimioluminiscencia (Thermo Scientific) y se visualizó con la imagen de Kodak estación 4000R (Kodak).
(A) Efecto de EGCG en compartimentos intracelulares ácidos. células HepG2 fueron con EGCG (60 M) para las duraciones indicadas o con Baf A1 (50 nM) durante 6 h. Los compartimentos ácidas fueron etiquetados por 5 nM Lyo-Tracker Red y examinados por confocal (barra de escala: 20 micras). (B) EGCG induce la fuga de las catepsinas de lisosoma al citosol. fraccionamiento celular se realizó para separar lisosomales y citosólicas fracciones en HepG2 tratadas con 60 mM EGCG en medio libre de suero como se indica. La catepsina D se detectó por Western Blot en las diferentes fracciones y lisados de células enteras. se utilizó LAMP-1 como un marcador para lisosoma. (C) EGCG provoca la neutralización lisosomal y la acidificación citosólica. células HepG2 fueron tratadas con 60 mM EGCG como se indica en medio libre de suero, seguido por tinción con 5 mg /ml de naranja de acridina (AO) durante 30 min y se analizaron por confocal (barra de escala: 20 micras).
naranja de acridina (AO) tinción
AO es un metacromática y débil tinte fluorescente base de la membrana permeable, cuya emisión de fluorescencia es dependiente de la concentración, de rojo a altas concentraciones (en lisosomas) a verde a bajas concentraciones (en el citosol), con el amarillo como producto intermedio en algunas condiciones [19]. En nuestros experimentos, las células se sembraron a una cámara de cubreobjetos diapositiva en 3 × 10
4 por pocillo. Después de los tratamientos designados, que se cargaron con AO (5 mg /ml) a 37 ° C durante 15 min, se enjuagaron, y luego examinado bajo el microscopio confocal con longitud de onda de excitación a 488 nm, mientras que dos bandas de emisión separados (505-570 nm y 615 -754 nm) se recogieron de forma simultánea.
la detección de especies reactivas del oxígeno
el análisis de la producción de ROS intracelular se llevó a cabo utilizando un método establecido [30]. Brevemente, las células HepG2 con tratamientos indicados se incubaron con 10 mM CM-H
2DCFDA a 37 ° C durante 15 y se analizaron con un microscopio de fluorescencia. Se seleccionaron y se fotografiaron imágenes representativas de los cursos de tiempo.
Análisis estadístico
Los datos numéricos se presentan como media ± desviación estándar de al menos 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se calculó utilizando
t-test
(distribución de dos colas, una varianza desigual) de Student.
(A) inhibidores de lisosomas presentes diferentes efectos diferentes sobre la muerte celular inducida por el EGCG. células HepG2 fueron tratados durante EGCG (60 mM x 24 h) en medio libre de suero en ausencia o presencia de diferentes inhibidores, incluyendo E64-D (10 mg /ml) + pepstatina A (10 mg /ml), cloroquina (CQ , 25 M), Baf A1 (50 nM). La viabilidad celular se determinó por Hoechst-PI doble tinción (n = 3, media ± SD). El
Los valores p se determinaron utilizando
de Student
t-test
(*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,005). (B) CQ, pero no Baf A1 bloquea el acidificación citosólico inducida por el EGCG. células HepG2 fueron con EGCG (60 mM), CQ (25 M) o Baf A1 (50 nM) en medio libre de suero durante 6 h seguido de tinción con 5 mg /ml AO para 30 min y analizados por confocal (barra de escala: 20 micras).
(A) EGCG induce la producción de ROS intracelulares. células HepG2 fueron tratados con EGCG (60 mM) durante 6 h en medio completo o en el tratamiento del medio libre de suero con H
2O
2 (200 mM) de 3 h se utilizó como control positivo. El ROS intracelular se detectó por CM-H
2DCFDA y se analizó bajo un microscopio de fluorescencia. (B) NAC previene la formación de ROS inducida por EGCG en medio libre de suero. Las células se trataron con EGCG (60 M × 6 h) en ausencia o en presencia de N-acetilcisteína (NAC, 5 mM). (C) La protección por NAC de la muerte celular inducida por el EGCG. células HepG2 fueron tratados por EGCG (60 mM) o H
2O
2 (200 mM) como se muestra durante 12 h en ausencia o presencia de NAC 5 mM. La viabilidad celular se determinó por Hoechst-PI doble tinción (n = 3, media ± SD). **
P Hotel & lt; 0,005 en comparación con el grupo sin NAC (de Student
t-test
). (D) NAC impide la catepsina D translocación causada por EGCG. células HepG2 fueron tratados con EGCG (60 M × 6 h) con o sin NAC 5 mM. Tanto el lisosomal y las fracciones citosólicas se analizaron por Western blot. (E) NAC impide la acidificación citosólico inducida EGCG. células HepG2 fueron tratados con EGCG (60 M × 6 h) o H
2O
2 (200 M × 3 h) con o sin NAC 5 mM. Las células fueron teñidas con AO de 30 min y se analizaron por confocal (barra de escala: 20 micras). (F) CQ no puede afectar a la producción de ROS inducida por el EGCG. las células HepG2 se cultivaron en medio libre de suero durante 1 h, después se añadieron 60 M EGCG, con o sin la presencia de CQ 20 M durante 6 h. (G) Ilustración para los mecanismos que subyacen a la muerte celular independiente de caspasas mediada por el EGCG, con la participación de ROS y LMP.
Resultados
privación de suero Mejora EGCG muerte celular inducida por
EGCG se ha informado anteriormente para inducir la muerte celular apoptótica en una variedad de líneas celulares de cáncer humano [31]. Un hallazgo sorprendente en el curso de nuestro estudio es que la presencia de suero al 10% tiene un impacto importante en la citotoxicidad de EGCG probado. Como se muestra en la Figura 1A, las células HepG2 fueron en gran medida resistentes a la EGCG en medio completo tan alta como 240 mM cultivan durante hasta 36 horas, mientras que el EGCG es capaz de reducir notablemente la viabilidad celular de las células HepG2 cuando se tratan en medio libre de suero. Se observaron efectos similares en otras líneas celulares de cáncer humano, tales como células HeLa (datos no mostrados). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la privación de suero es capaz de promover la muerte celular inducida por el EGCG.
A continuación se establece para determinar la forma de la muerte celular inducida por el EGCG en medio libre de suero. Para ello, lo primero que examinó los cambios morfológicos de los núcleos con tinción de Hoechst. Como se muestra en la Figura 1B, los núcleos de las células tratadas con EGCG no mostraron cambios obvios, mientras que se observó condensación nuclear evidente en las células tratadas con TNF y CHX, como control positivo para la muerte celular apoptótica típica. Además, z-VAD-fmk, un inhibidor general de caspasa no protegió contra la muerte celular inducida por EGCG, al tiempo que evita completamente la muerte celular inducida por TNFa y CHX (Figura 1C). Consistentemente, no había activado caspasa-3 (17 kDa) o PARP escindida (89 kDa) detectada por Western Blot (Figura 1D) en células HepG2 tratadas con EGCG. Por el contrario, dichas características distintivas de la apoptosis se han encontrado en las células tratadas con TNF y CHX y prevenir por z-VAD-fmk. Tomados en conjunto, es claramente que el EGCG induce la muerte celular en condiciones libres de suero es probable que sea independiente de caspasas la muerte de células no apoptóticas.
EGCG Triggers citosólica vacuolización Debido a Lysosome Dilatación en Serum-Free Medium
Una característica morfológica observable al microscopio óptico era vacuolización citosólico en las células tratadas con EGCG en medio libre de suero y el tiempo y los cambios dependientes de la dosis fueron presentados en la Figura 2A. En particular, no hay tal vacuolización se encontró en células tratadas con EGCG en medio completo (Figura 2B). También se encontraron resultados similares en células HeLa con el mismo tratamiento (datos no mostrados). Tal vacuolización también era visible en células teñidas con hematoxilina, un tinte nuclear (Figura 2B). Otra característica morfológica visible en las células tratadas con la mayor concentración de EGCG en medio libre de suero es la pérdida de contenido citosólico, con un aumento de tamaño de las células (Figura 2B).
Teniendo en cuenta la estrecha relación entre la vacuolización y la muerte celular, que luego intentamos averiguar las fuentes naturales de las vacuolas citosólicas. Se informó que la vacuolización ser inducida por una amplia gama de estímulos inductivos y que participan muchos orgánulos y estructuras diferentes, tales como retículo endoplásmico (ER), Golgi, y lisosoma [32]. En nuestro estudio, se excluyeron primera la posibilidad de que las vacuolas inducidos por EGCG son gotas de lípidos, ya que son negativos para la tinción con Oil Red O (Figura 2C), en contraste con las células tratadas con OA que se utiliza un control positivo. Además, tales vacuolas fueron también no asociados con el ER o Golgi basado en la inmunotinción de las respectivas proteínas marcadoras (datos no mostrados). Curiosamente, encontramos que tales vacuolas así co-localizar con la proteína de la membrana lisosomal LAMP-1 (Figura 2D), lo que sugiere que las vacuolas estaban estrechamente asociados con los lisosomas.
EGCG bloques de autofagia Flux
La hecho de que la privación de suero aumenta la muerte celular inducida por el EGCG nos lleva a examinar el papel de la autofagia en la muerte celular mediada por el EGCG. Ha sido bien establecido que el hambre induce la autofagia y la autofagia está estrechamente implicada en el proceso de muerte celular, ya sea como un pro-supervivencia o el mecanismo a favor de la muerte [33]. Para probar esto, se examinó por primera vez el nivel de la autofagia en las células tratadas con EGCG, analizando el nivel de LC3-II, un marcador ampliamente utilizado para autofagosomas [34]. Como se muestra en la Figura 3A, hubo aumento significativo de LC3-II en las células tratadas con EGCG, tanto en HepG2 y MEF, en medio libre de suero, pero no en medio completo. Del mismo modo, hubo aumento significativo de puntos lagrimales GFP-LC3 en MEF con la expresión estable de GFP-LC3 (Figura 3B). En este estudio, hemos utilizado una serie de enfoques para examinar si el aumento de los marcadores autofágicos observados en las células tratadas con EGCG es debido al aumento del nivel de flujo de autofagia o bloqueo de la maduración autofagosoma o degradación en la etapa tardía. En primer lugar, se utilizó bafilomicina A1 (Baf A1), un inhibidor de lisosomal V-ATPasa, para bloquear autophagosome-lisosoma fusión [35]. En particular, Baf A1 no logró aumentar aún más los niveles LC3-II (Figura 3C). En segundo lugar, se analizó el cambio de nivel de la proteína p62. Se sabe que la p62 se incorpora selectivamente en autofagosomas a través de la unión directa a LC3 y eficiente degradado por la autofagia [34]. Hemos observado la acumulación de la proteína p62 evidente tanto en HepG2 y MEF tratados con EGCG (Figura 3A, 3C). Finalmente, encontramos que el tratamiento EGCG mejora de forma significativa la co-localización de autophagosome (marcada por GFP-LC3) y lisosomas (marcado por LAMP-1), en comparación con las células de control con suero-inanición (Figura 3D). Tomados en conjunto, todos los datos anteriormente descritos indican claramente que el EGCG es capaz de inhibir el flujo de autofagia mediante el bloqueo de la tarde degradación etapa autolysosome.
muerte celular EGCG mediada es independiente de autofagia
Después de establecer la efecto inhibidor de EGCG en la autofagia, que tuvo como objetivo comprobar si el flujo autophagic interrumpido contribuye a la muerte celular inducida por EGCG. Aquí hemos utilizado las células m5-7 con inducible ATG5 eliminación [24]. Como se muestra en la Figura 4A, la adición de doxiciclina (Dox) eliminado ATG5 y el cambio de LC3-II. Curiosamente, la supresión de ATG5 no tuvo efecto sobre la vacuolización citosólico inducida por EGCG (Figura 4B), y, finalmente, la muerte celular (Figura 4C). Por lo tanto, se cree que la muerte celular mediada por el EGCG es independiente de ATG5 o la autofagia.
EGCG induce la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP)
Los primeros datos encontrados en este estudio indican la posibilidad de daños lisosomal causada por EGCG. Para examinar aún más los cambios de la función lisosomal causada por EGCG, se utilizó primero Lyso-Tracker Red (LTR) para etiquetar y rastrear los compartimentos intracelulares ácidos (lisosomas) en células vivas. Como se muestra en la Figura 5A, la adición de EGCG reduce notablemente la fluorescencia de una manera dependiente del tiempo, lo que indica una reducción de componentes ácidos intracelulares causados por el tratamiento EGCG. Como era de esperar, el tratamiento de Baf A1 completamente abolido la tinción LTR debido a la acidificación lisosomal abolido.
Como una sonda acidotropic, la disminución de la fluorescencia LTR puede no sólo reflejan un aumento del pH lisosomal, sino también sugerir la posibilidad de lisosomal permeabilización de la membrana (LMP) [19]. Para determinar si EGCG podría desencadenar el LMP, la distribución de la catepsina B y catepsina D, dos enzimas clave lisosomales, se comparó por inmunotransferencias entre las fracciones citosólicas y de membrana. Como se muestra en la Figura 5B, se observó un aumento dependiente del tiempo de una forma madura de la catepsina D en la extracción de citosólico en las células tratadas con EGCG, que corresponde a la disminución de la fracción de membrana. Tal patrón temporal es de hecho consistente con la reducción de la tinción de LTR se muestra en la Figura 5A, lo que indica una fuga de contenido lisosomal en el citosol.
EGCG inducida por LMP se confirmó adicionalmente por tinción de naranja de acridina (AO) , un fluorocromo metacromática lysosomotropic, que normalmente presenta fluorescencia roja en el interior de los lisosomas donde se encuentra altamente concentrada, y débilmente verde en el citosol con una concentración más baja [19]. Como se muestra en la Figura 5C, el tratamiento EGCG llevó en función del tiempo a la pérdida de puntos lagrimales rojo en los lisosomas, e incremento de la fluorescencia roja difusa en el citosol, con un patrón temporal consistente con la tinción de LTR y las fugas de la catepsina D se mostró anteriormente. Por tanto, tales observaciones sugieren que EGCG provoca la ruptura de lisosoma, que entonces desencadena una liberación de los contenidos ácidos del lumen lisosomales a citosol, con reducción de la acidificación lisosómica y dramático aumento de la acidificación citosólica. Digno de mención, la fluorescencia verde nucleico también se ha mejorado con el tiempo, lo que indica la acidificación núcleos con el tratamiento prolongado de EGCG (Figura 5C). aún no se ha estudiado aún más la importancia de este tipo de cambios en la muerte celular inducida por el EGCG.
EGCG Induce LMP dependiente de la muerte celular
Hasta este punto, hemos demostrado que el EGCG induce la caspasa-independiente la muerte celular, independientemente de la autofagia. Más importante aún, hemos identificado lisosoma como el principal objetivo de EGCG, evidenciado por permeabilización de la membrana lisosomal, la pérdida de la acidificación citosólica y dilatación lisosoma. Aquí se intentó probar si el deterioro de los lisosomas juega un papel causal en la muerte celular inducida por EGCG. En primer lugar, hemos utilizado varios inhibidores diferentes lisosoma y entre ellos, cloroquina (CQ), un agente lysosomotropic, ofreció la protección más eficaz contra la muerte celular inducida por el EGCG (Figura 6A). Dos inhibidores de catepsina (E64-D y pepstatina A) también fueron eficaces, aunque en un grado mucho menor.