Extracto
evaluación preclínica terapéutica actualmente se basa en la respuesta de crecimiento de líneas celulares humanas establecidas en xenoinjertados ratones inmunodeprimidos, una estrategia que por lo general no es predictivo de los resultados clínicos. Inmunocompetentes ratón genéticamente modificado (GEM) modelos de aloinjertos de tumores -derivado ofrecen alternativas preclínicos altamente tratables y facilitar el análisis de agentes inmunomoduladores clínicamente prometedores. reporteros capaces de formar imágenes son esenciales para el crecimiento y un seguimiento preciso de la respuesta del tumor, sobre todo para las metástasis. Por desgracia, los reporteros como luciferasa y GFP son antígenos extraños en ratones inmunocompetentes, potencialmente obstaculizan el crecimiento del tumor y las respuestas terapéuticas de confusión. Aquí evaluamos el valor de las joyas reportero-tolerantes como receptores de aloinjertos por la orientación mínima expresión de un reportero de fusión luciferasa-GFP a la glándula pituitaria anterior (conocido como el "Brillante Cabeza" o GH ratón). El indicador de luciferasa-GFP expresada en las células tumorales inducidas respuestas inmunes adversas en ratón de tipo salvaje, pero no en GH de ratón, como anfitriones de trasplante. La antigenicidad de reporteros ópticos resultó en una disminución tanto en el crecimiento y el potencial metastásico del tumor marcado en ratones de tipo salvaje en comparación con los ratones de GH. Por otra parte, la expresión del indicador también puede alterar la respuesta del tumor a la quimioterapia o la terapia dirigida de una manera dependiente del contexto. Por lo tanto los ratones GH y enfoques experimentales examinados en este documento proporcionan validación del concepto y una estrategia para la evaluación preclínica efectiva, reproducible de crecimiento y de respuesta cinética para tumores trazables
Visto:. Día CP, Carter J, Ohler ZW, Bonomi C, El Meskini R, Martin P, et al. (2014) Ratones "Brillante Cabeza": Una herramienta genética Activación fiable preclínicos basado en imagen Evaluación de los cánceres en inmunocompetentes de aloinjertos. PLoS ONE 9 (11): e109956. doi: 10.1371 /journal.pone.0109956
Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 29, 2014; Aceptado: 9 de septiembre de 2014; Publicado: 4 de noviembre 2014
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Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este proyecto ha sido financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E . Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa de Desarrollo Terapéutica en la División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer y el Programa de Investigación Intramural del Centro para la Investigación del Cáncer, NCI, NIH. Leidos Biomedical Research Inc. prestado apoyo en forma de salarios de los autores John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-cereza, y Lionel Feigenbaum, pero no tuvo ningún papel adicional en el el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Los co-autores John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-cereza y Lionel Feigenbaum son empleados por leidos Biomedical Research Inc. leidos Biomedical Research Inc., se dedica a un solo contrato para operar el Laboratorio de Frederick Nacional para la Investigación del cáncer (FNLCR), con fondos federales de un Centro de Investigación y Desarrollo. No está involucrado en ningún empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados etc. relacionados con este estudio. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El fármaco desarrollado por medio de las principales compañías farmacéuticas ha sido un costo estimado de entre 4 y 11 millones de dólares [1], con un costo que el paciente promedio de cáncer de aproximadamente $ 100.000 por año. Estas enormes costos se deben en parte por una incapacidad temprano en la tubería de desarrollo para identificar de forma fiable los fármacos que será eficaz, y la tasa global de aprobación de un compuesto oncológico es actualmente de unos 5% [2]. Gran parte de este fracaso puede atribuirse a la insuficiencia de los modelos preclínicos usados en la evaluación terapéutica. líneas Históricamente, los estudios preclínicos en animales han utilizado décadas de edad establecidos humanos de células trasplantadas, como xenoinjertos en ratones inmunocomprometidos por vía subcutánea [3]. Por desgracia, estos modelos han tenido un valor predictivo de eficacia-limitado para el desarrollo de fármacos, sin embargo, han sido considerados críticos para la mejora de la productividad farmacéutica y cuidado del paciente [4].
El dominio de los estudios preclínicos de cáncer está vinculado a la idoneidad de la modelo animal en sí. Paramount es la presencia de un sistema inmune completamente funcional, que está implicado en prácticamente cada paso del desarrollo de la enfermedad, y determina críticamente la respuesta al tratamiento [5]. Las células tumorales interactúan recíprocamente y dinámicamente con las células inmunes microambientales y otros a lo largo del curso de la progresión metastásica y también después de la intervención terapéutica [6]. Esta interacción se modela adecuadamente tanto en modelos de cáncer autóctonas ratón genéticamente modificado (GEM) y por el trasplante ortotópico de aloinjertos derivados de GEM (GDA) en ratones receptores completamente inmunocompetentes [7], pero no de manera efectiva en los modelos actuales de xenoinjerto de cáncer humano. Por último, la evaluación terapéutica y biomarcador ideal debe basarse en modelos preclínicos de cáncer recapitulando
de origen natural
metástasis, la fase de cáncer más mortal.
modelos preclínicos tratable requieren la capacidad de controlar con precisión la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica , facilitando la adopción de criterios de valoración clínicos pertinentes [8]. seguimiento de la enfermedad es esencial para la metástasis y tumores de otro modo indetectables. Imágenes ópticas de células que expresan proteínas generadores de luz-domina actualmente las tecnologías de monitoreo debido a su capacidad para medir eventos en tiempo real, la rentabilidad y la eficiencia de tiempo [9]. Sin embargo, las proteínas marcadoras trazables más, incluyendo la luciferasa de luciérnaga populares (ffLuc) y medusas aumento de proteína verde fluorescente (EGFP), son xenobióticos a los mamíferos. Su expresión induce naturalmente diferentes respuestas inmunes en animales inmunocompetentes, lo que resulta en la actividad inconsistente [10], [11], rechazo de injertos [12] y la supresión de la actividad metastásica [13], confundiendo la validez de las conclusiones preclínicos. Por lo tanto, el uso eficaz de los reporteros xenobióticos se limitó a los estudios a corto plazo, o modelos animales totalmente inmunocomprometidos, lo que limita las opciones preclínicos [9], [13].
Para superar estos problemas, hemos desarrollado una joya modelo que es inmune tolerante tanto a ffLuc y eGFP para servir como huésped para el trasplante de los tumores singénicos etiquetados. Uso de la hormona del crecimiento de rata (rGH) promotor, la expresión de una proteína de fusión ffLuc-eGFP estaba dirigido a la hipófisis anterior, un sitio privilegiado no inmune distante de órganos comúnmente supervisados en los estudios preclínicos, creando de este modo la "brilla Head" (GH) ratón [14]. Se demuestra que en la respuesta inmune de tipo salvaje ratones inducidos por los reporteros xenobióticos afecta sustancialmente a la progresión y las respuestas terapéuticas de tumores capaces de formar imágenes trasplantado. Es importante destacar que el uso de ratones pre-tolerantes GH minimiza o elimina estas aberraciones, lo que resulta en modelos preclínicos más fiables, manejables.
Materiales y métodos
Lentiviral Vectors
El lentiviral vector que expresa la proteína luciferasa de luciérnaga-mejorada verde fluorescente proteína de fusión (Ferh-ffLuc-eGFP) se describió anteriormente [10]. Fue aquí modificado para eliminar eGFP e insertar un sitio de unión al ribosoma (IRES) y la histona H2B-etiquetados eGFP (H2B-eGFP) para generar Ferh-ffLuc-IRES-H2B-eGFP, que se dirige la expresión de ffLuc y eGFP a la citoplasma y el núcleo, respectivamente. La información detallada de la secuencia del vector se proporcionará a petición del Dr. Dominic Esposito (e-mail:
[email protected])., leidos Investigación Biomédica, Frederick, MD, EE.UU.
Animales
para reducir la absorción de bioluminiscencia y la variación experimental, albino de 6 a 8 semanas de edad ratones hembra endogámicos en un C57BL /6 (C57BL /6
c-d a /c-brd /Cr) o de fondo FVB /N se utilizaron como huéspedes para los estudios de trasplante. los ratones F1 en la cría de ratones C57BL /6 con 129 (B6; 129) los ratones fueron utilizados como anfitriones isogénicas en el estudio de la ANR
Q61K /p19
melanoma ARF-nulo, que se deriva de una mezcla de antecedentes genéticos [ ,,,0],15], [16]. Todos los animales utilizados en este proyecto de investigación fueron atendidos y se utilizan con humanidad de acuerdo con las siguientes políticas: La Política de Servicio de Salud Pública de EE.UU. humana de Cuidado y Uso de Animales (1996); la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (1996); y los Principios de Gobierno EE.UU. para uso y cuidado de los animales vertebrados utilizados en las pruebas, investigación y formación (1985). Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo en estricta conformidad con los protocolos de estudio de animales aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo (ACUC), Instituto Nacional del Cáncer, en el Laboratorio Nacional de Frederick para la Investigación del Cáncer, que está acreditada por AAALACi y sigue la Política de Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. Los siguientes protocolos fueron aprobados por la ACUC para la realización de este estudio:. ASP#08-084, 11-044, 11-058 y
Los ratones en este estudio fueron sacrificados por asfixia con CO2 siguiendo las directrices aprobadas por el NCI ACUC : (1) la transferencia de los ratones a una cámara de CO2 justo antes de la eutanasia. (2) Encienda el CO2 a 2 litros por minuto para un estándar de tamaño de la cámara. (3) Dentro de aproximadamente dos a tres minutos, los ratones adultos deben ser inmóvil e insensible; cuando esto es evidente, aumentar la velocidad de flujo a alta o aproximadamente 10 litros /min. (4) Cuando cesa la respiración para todos los animales vistos a través de la jaula, ajustar el temporizador durante 2 minutos. Al final de dos minutos, los ratones puede ser retirado de la jaula CO2-llenado. Asegurar la muerte, asegurándose de que no hay movimientos de ningún tipo durante 60 segundos adicionales fuera de la jaula de CO2-llenado, mediante el temporizador.
Generación de la "Brillante Cabeza" ratón
El rGH -hGH construir [17] (un regalo del Dr. Rhonda Kineman, Universidad de Illinois en Chicago, Chicago, IL) se modificó por inserción de un gen de fusión ffLuc-eGFP para generar el vector de metas de la glándula pituitaria anterior, que se utilizó para generar ratones transgénicos tanto en el C57BL /6 y FVB /N antecedentes genéticos mediante microinyección de blastocisto. Pequeñas colonias de ratones transgénicos homocigotos fueron mantenidos con fines de reproducción, y su progenie heterocigótica utilizados para todos los estudios preclínicos. Todos los transgénicos y la cría de trabajo se llevó a cabo a través del Programa de Ciencias de Animales de Laboratorio, Laboratorio Nacional de Frederick.
tumores murinos, líneas celulares de cáncer, y su etiquetado
El carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) fue tejido mantengan solamente
in vivo
desde su derivación del tumor de pulmón original de ratones C57BL /6 [8]. La metástasis espontánea serie Hgf-tg /CDK4
trasplante de piel melanoma R24C se generó a partir de un melanoma primario inducido en Hgf-tg /CDK4
R24C C57BL /6 ratones mediante la aplicación epicutánea del carcinógeno DMBA [18]. HGF-tg /CDKN2A
- /- melanoma se deriva de tumores inducidos en HGF-tg /CDKN2A
- /- ratones FVB por irradiación UV [19]. Estos tumores se mantuvieron sólo en ratones singénicos. Para el trasplante, los tejidos tumorales recogidas se dividieron en trozos de 3 mm x 3 mm y cada uno se insertó en un corte de 5 mm en la piel de un ratón. MVT-1 en las células de cáncer de mama murino se derivaron de tumores de mama de la MMTV-c-Myc /MMTV-VEGF de ratón bi-transgénico en un FVB /N fondo endogámica [20]. Ellos se establecieron como una línea celular y se mantienen mediante el cultivo in vitro. Para el transplante, se prepararon 1,0 × 10
6 células de la cultura y se inyecta por vía subcutánea en cada ratón. Mutante ANR
Q61K /p19
se generaron células de melanoma ARF-nulos como se describe [15], [16]. En el primer pasaje, 1,0 x 106 células de cultivo in vitro se inocularon en ratones F1 C57BL /6x129 para formar tumores. En los siguientes pasajes, los fragmentos divididos por el tumor cosechada se utilizaron para el trasplante, como se ha descrito anteriormente.
Para etiquetar el
in vivo
tumores mantenimiento, suspensiones celulares preparadas a partir de
in vivo
-EXPANDED tumores fueron infectadas
ex vivo con lentivirus por
ex vivo
espinoculación [10], [21]. LLC tejido se infecta con codificación lentivirus ffLuc-eGFP o ffLuc-IRES-H2B-eGFP y después se sometió a
in vivo
bicicleta para obtener tumores etiquetados de manera uniforme, como se describe anteriormente [8]. Las líneas celulares se marcaron con ffLuc-eGFP lentivirus
in vitro
, y la eGFP
+ poblaciones se aislaron utilizando el clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS).
Los estudios preclínicos y análisis patológico
en estudios preclínicos, un tumor marcado criogénicamente preservado fue restablecido y ampliado por el trasplante subcutáneo en ratones. Estos tumores se resecaron al llegar a 500 mm
3 y se expandieron a través del paso en el número requerido de los ratones para los estudios reales que se describen en el texto. El tamaño del tumor se midió manualmente y calcula V (mm
3) = 0,5 x L x W
2, donde L es la longitud y W es la anchura en mm. Para el modelado de preclínica de los tumores primarios, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de acuerdo al diseño del estudio, cuando sus tumores alcanzaron 125 mm
3. El grupo de control recibió solución de vehículo, y el grupo experimental recibió tratamientos de agentes quimioterapéuticos. La dosis y el horario en cada experimento se han especificado en los resultados. Cuando los tumores crecieron hasta 2000 mm
3, los ratones habían alcanzado sus puntos finales y fueron sacrificados para estudios posteriores.
En modelos preclínicos de metástasis espontánea, tumores primarios fueron retirados quirúrgicamente al llegar a 500 mm
3, y los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de acuerdo con el diseño del estudio. Metástasis y recurrencia fueron controlados periódicamente por la formación de imágenes utilizando el sistema Xenogen IVIS [8] para medir el flujo de BL (fotones /s /grado radial). El grupo de control recibió solución de vehículo, y el grupo experimental recibió tratamientos de agentes quimioterapéuticos. La dosis y el horario en cada experimento se han especificado en los resultados. Cuando los ratones mostraron signos de morbilidad, definido por el protocolo de estudio en animales (por ejemplo, por debajo de voz aérea, dificultad en el movimiento), que llegaron a su punto final y fueron sacrificados para estudios posteriores.
Los fármacos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir Drogas de Síntesis & amp; Rama Química, DTP, NCI (Bethesda, MD). Paclitaxel se disolvió en 10 veces la concentración deseada en etanol al 100%, se diluyó con un volumen igual de Cremaphor EL y después se diluyó a la concentración 1x con solución salina antes de la inyección intravenosa en ratones. La gemcitabina se disolvió en agua y se inyecta por vía intraperitoneal en ratones. Crizotinib se resuspendió en 0,5% de metilcelulosa en 0,9% de solución salina, y dado una vez al día por sonda oral (PO) durante un período de 3 semanas a 10 ml /Kg. Los ratones con tumores subcutáneos fueron asignados al azar en 3 grupos basados en la medición del tumor (200-500 mm
3), y se trató con vehículo solo, crizotinib a 50 mg /kg, o crizotinib a 100 mg /kg.
tejidos cosechados fueron fijadas en formol al 10% y embebidos en parafina. de serie de secciones adyacentes fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para el análisis histológico, o utilizados para inmunohistoquímica GFP (ab6556, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). La histopatología fue realizado por el Dr. Miriam Anver (Patología y Laboratorio Histotecnología, leidos Investigación Biomédica, Frederick, MD). Para el análisis cuantitativo, las diapositivas fueron escaneados utilizando el sistema XT ScanScope y las imágenes fueron analizadas por el software de análisis de espectro de patología Plus (Aperio Technologies, Vista, CA).
hormonal y el análisis de marcadores inmunológicos
Los sueros fueron preparado a partir de la sangre entera recogida siguiendo protocolos convencionales y se almacena a -80 ° C. Para el análisis de anticuerpos anti-GFP en el suero, placas ELISA (Nunc MaxiSorp, cat#439454, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) se revistieron con 31,25 ng de GFP recombinante (MB-0752, Laboratorio Vector, Burlingame, CA, EE.UU.) en cada pocillo durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, sueros y controlar anticuerpo anti-GFP monoclonal (11814460001, Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) fueron sometidos a dilución en serie con solución de bloqueo (leche 3% en solución salina tamponada con fosfato [PBS]) para alcanzar el rango 1:25-1:2000 para el primero y 6.25-200 ng /ml para el segundo. se añadieron 50 l de anticuerpo de sueros o control diluido a los pocillos revestidos, seguido de incubación durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS que contiene 0,05% de Tween 20 (PBST). peróxido rojizo caballo (HRP) conjugada con anticuerpo de cabra anti-ratón (115-035-062, Jackson ImmunoResearch Laboratories) a una dilución 1:1000 en solución después se añadió en cada pocillo, seguido de la adición de sustrato de peroxidasa de bloqueo (TMB 2- componente de micropocillos de sustrato de peroxidasa Kit, 50-76-00, KPL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) para el desarrollo de color de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La absorción A450 de las placas se midió utilizando un lector de microplacas (Vmax Kinetic ELISA lector de microplacas de Absorción, 97059-546, VWR Corp., Radnor, PA, EE.UU.). los niveles de la hormona del crecimiento en el suero de ratón se analizaron mediante la hormona de crecimiento (GH) Kit ELISA (M0934, Biotang Inc., CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante de la siguiente manera. Los sueros se diluyeron 2 veces con medio RPMI 1640, y las soluciones estándar se prepararon para el rango de concentración de 0,3125 a 100 ng /ml. Se añadieron los patrones y las muestras en la placa de ELISA proporcionado, que se incubó a 37 ° C durante 40 min y se lavó con tampón de lavado. Cada pocillo se añadió con 50 l de agua y 50 l de anticuerpo anti-GH biotinilado, y se incubó a 37 ° C durante 20 min. Después del lavado, se añadieron 100 l de HRP conjugada con estreptavidina a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 10 min. Después de otro lavado, se añadieron 100 l de solución de sustrato HRP a cada pocillo, se incubaron a 37 ° C durante 15 min, seguido de la adición de 100 l de solución de parada. La absorción A450 de las placas se midió usando el lector de microplacas Vmax.
Para analizar marcadores de superficie celular, una sola célula suspensiones se prepararon a partir de bazos de ratón cosechadas y se incubaron con 5 l /ml de anticuerpo Fc gamma Receptor (14- 0161-85, eBiosciences, San Diego, CA, EE.UU.) para el bloqueo durante 20 minutos. Tras un lavado con solución de tinción (PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino [BSA]), se incubaron con 0,3 l /ml de rata anti-CD4 de ratón (550728, BD-Pharmingen, San Jose, CA, EE.UU.) o CD8a ( 550.281, anticuerpo BD-Pharmingen, o anticuerpo de control de isotipo (559073, BD-Pharmingen) a 4 ° C durante 1 hora, seguido de lavado con solución de tinción de tres veces. Las células se incubaron después con 4 l /ml de Alexa 488- conjugado de cabra anti-rata anticuerpo secundario (A11006, Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) a 4 ° C durante 20 min. Después de lavar con solución de tinción por tres veces, las células se sometieron a análisis FACS (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) o cámara de análisis equipado con un módulo óptico de filtro para la detección de FITC para cuantificar la expresión de marcadores de células (Cellometer Vision, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, EE.UU.). se analizaron los datos generados por FACS y Cellometer Visión y se cuantificó con el software FlowJo (TreeStar, Inc. Ashland, Oregón, EE.UU.) y FCS Express (software de Novo, Los Ángeles, CA, EE.UU.), respectivamente.
El análisis estadístico
Las diferencias en la cantidad distribución (por ejemplo, el tamaño del tumor, la intensidad de la bioluminiscencia, CD8 /CD4) entre los grupos de estudio se analizaron mediante la prueba t no pareada paramétrico. Para los estudios preclínicos, el punto final fue la supervivencia global, definida como el tiempo hasta que la morbilidad del ratón de acuerdo con el protocolo del estudio animal. Los ratones vivos al final del estudio fueron censurados en esa fecha. El método de Kaplan-Meier y log-rank test de Mantel-Cox se realizaron para comparar las tasas de supervivencia de los grupos de ratones. La significación estadística se estableció en el
P-valor
& lt; 0,05. El tiempo medio de supervivencia fue calculado como el menor tiempo de supervivencia para los cuales la función de supervivencia llegó a 50%. Los cálculos se realizaron con GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA).
Resultados
reportero de la actividad de los tumores murinos marcados con ffLuc-eGFP es inconsistente en inmunocompetentes singénicos ratones
La vía subcutánea trasplantado carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) es un modelo metastásico bien caracterizado que ha sido recientemente explotados en varios estudios preclínicos de alto perfil [22] - [24]. Recientemente hemos recuperado archivamos LLC tejido nunca se adaptó al cultivo celular, y demostraron que tras el trasplante y la resección de metástasis se produjo con muy poca latencia en & gt; 90% de los ratones WT C57BL /6 singénicos receptores [8]. Aquí hemos denominado LLC con un lentivirus codificado-ffLuc-eGFP
ex vivo [10]. Dado que los resultados de transducción viral en la población heterogénea de células [25], nos sometemos a este tumor marcado a
in vivo
bicicleta para hacerlos uniformemente etiquetados [8], [26]. Brevemente, los ratones portadores de tumores transplantados son monitoreados para la metástasis, y nódulos metastásicos se cosecharon para el trasplante subcutáneo para iniciar el próximo ciclo. Dado que cada nódulo se deriva de una sola célula, el tumor derivado de él es presumiblemente clonal. Por lo tanto, la homogeneidad se verá reforzada a través de cada ciclo. Como se muestra en la Fig. 1A, después de un trasplante por vía subcutánea y la resección de la LLC marcado en cinco ratones, metástasis derivadas fueron detectados fácilmente por
bioluminiscencia de imágenes in vivo (BL). En este pasaje, aunque los tumores crecieron en todos los hosts, se detectaron metástasis en un solo (# 160 en la Fig. 1A, panel inferior). Se cosecharon los pulmones de ese ratón y examinado con
ex vivo de imágenes (Fig. 1B, panel superior). La intensidad BL distribuido de forma desigual refleja la heterogeneidad de las células transducidas en el tumor primario (Fig. 1B, panel superior). Hemos recogido de los ratones receptores tres metástasis pulmonares bien etiquetados individuales, que se presumen clonal, que se dividen en cinco fragmentos para el trasplante en cinco ratones C57BL /6. se recogieron y se trasplantan en otros cinco ratones C57BL /6 nódulos pulmonares etiquetadas de que el ratón; sin embargo, estos tumores luego crecieron muy lentamente y /o no exhibieron actividad de reportero detectable (Fig. 1B). Estos resultados demuestran que la actividad del indicador en células de la etiqueta no se pudo mantener constantemente durante pasajes en ratones inmunocompetentes singénicos, incluso después de la selección clonal.
, murinos carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) células A fueron infectadas con ffLuc-eGFP-expresión lentivirus
ex vivo, por vía subcutánea y trasplantado en cinco albino singénico ratones C57BL /6 (c-BRD) (# 160-164). la actividad del indicador se controló mediante formación de imágenes BL del crecimiento subcutáneo del tumor (cuerpo) y la metástasis pulmonar (pecho). Al día 15 después de la inoculación, se encontró una señal BL metastásico en uno de los ratones (# 160 en el panel inferior). B, El pulmón fue cosechada de#160, y un solo nódulo metastásico brillante seleccionada utilizando
ex vivo de imágenes (panel superior) fue trasplantado en ratones cinco c-Brd en el segundo pasaje. resultados de las imágenes mostraron que la actividad de reportero no pudo mantenerse constantemente en los tumores palpables resultantes (panel inferior).
Para determinar si la consistencia reportero dependía del tipo de tumor, hemos ampliado nuestro análisis de melanoma de ratón. Una ANR
Q61K-transformada, p19
ARF deficientes en línea melanocíticos celular [15], [16] fue etiquetado con el lentivirus ffLuc-eGFP y trasplantó subcutáneamente en ratones inmunocompetentes singénicos. Después de la resección se seleccionó un nódulo pulmonar de altura BL para el trasplante subcutáneo en dos ratones (Fig. S1A, paneles de la izquierda). Tanto los tumores mostraron una reducción significativa en la actividad de BL normalizado durante el crecimiento subcutáneo (Fig. S1A, paneles de la derecha). Hemos corroborado estos resultados en otros dos modelos. Las células del melanoma cosechados directamente de un /FVB HGF-transgénico knock-out para el gen CDKN2A /N de ratón fueron transducidas con el gen ffLuc-eGFP
ex vivo, y se trasplantan subcutáneamente en FVB /N ratones singénicos. Si bien todos los tumores crecieron, la intensidad de BL se redujo ya sea o aumentó más lentamente (Fig. S1B), y la intensidad BL /relación de tamaño, que sirve como indicador de la retención de etiquetado, se redujo en tres de los cinco tumores. En otro modelo, las células cancerosas Mvt-1 de mama de ratón ffLuc-eGFP-expresión de trasplantaron ortotópicamente en almohadillas de grasa mamaria de FVB singénico /N ratones también demostraron mala retención de la señalización de BL (ver abajo). Llegamos a la conclusión de que la expresión ffLuc-eGFP en aloinjertos en wildtype inmunocompetentes (WT) los ratones se mantiene una coherencia en ratones y /o pasajes, con independencia del tipo de tumor, los antecedentes genéticos o sitio del trasplante.
Generación de un modelo GEM inmunológicamente tolerante a GFP y reporteros de luciferasa
Nuestros resultados sugieren que la inmunogenicidad de los productos génicos reportero xenobióticos es en gran parte responsable de su falta de coherencia en el contexto de un sistema inmunitario completamente funcional. Para sortear este problema, hemos generado /6 y los modelos basados GEM-N FVB /C57BL que reconocen proteínas ffLuc y eGFP como auto. Para su alta especificidad, las secuencias de genes RGH [17] (Fig. 2A) se emplearon para dirigir la expresión de un gen de fusión ffLuc-eGFP a la glándula pituitaria anterior del ratón, evitando de este modo la interferencia de señalización a partir de los sitios de metástasis más comunes.
a, Estructura del vector de expresión para la generación de brillantes Cabeza (GH) ratones transgénicos. La expresión de un gen de la luciérnaga de fusión luciferasa-eGFP (ffLuc-eGFP) fue dirigida a la glándula pituitaria anterior del ratón mediante el uso del promotor de la hormona del crecimiento de rata (rGH) y las secuencias de gen de la hormona de crecimiento humana, que incluyen un sitio polyadenylylation (hGHpA)
20. B, patrón de expresión de transgén óptico en ratones GH como se visualiza mediante formación de imágenes BL. se detectó la actividad del indicador en la glándula pituitaria anterior de ambos sexos y de los testículos de ratones machos. C, Los niveles séricos de la hormona del crecimiento de los ratones de tipo salvaje y de GH de la misma edad (WT) los ratones c-Brd se evaluó mediante ELISA (media ± DE). Se extrajo sangre a la misma hora del día. No se encontraron diferencias significativas en los niveles circulantes de la hormona del crecimiento entre los ratones GH y WT. tumores LLC marcadas con ffLuc-eGFP D, se trasplantaron por vía subcutánea en WT, GH, y los ratones NOD-SCID. Se extrajo sangre para preparar sueros cuando los tumores alcanzaron 500 mm
3, y se analizaron por ELISA los niveles en suero de anticuerpos anti-GFP. Los niveles de anticuerpo anti-GFP en ratones WT son significativamente más altos que los de GH y los ratones NOD-SCID (p & lt; 0,005), pero no se encontró ninguna diferencia entre los de GH y los ratones NOD-SCID (p = 0,19). Los sueros de ratones sanos sin trasplante tumoral sirvieron como controles para definir el punto cero.
La glándula pituitaria anterior no es un sitio privilegiado inmune y por lo tanto es parte de la circulación sistémica [27]. Las proteínas ffLuc y eGFP transgén codificado expresadas en la glándula pituitaria anterior durante el desarrollo embrionario, por tanto, participan en la selección de las células T y B y son reconocidos como antígenos propios, lo que resulta en su tolerización. Para reducir la adsorción de la luz por el pigmento del transgén ffLuc-EGFP fue criado en el albino C57BL /6F (c-BRD) de fondo. líneas fundadoras fueron escogidos de cada cepa que demostró la herencia mendeliana transgén y la fecundidad normal. En nuestro estudio anterior, hemos identificado el límite de detección de la señal BL a partir de imágenes de ratón in vivo fue de 1,5 × 10
5 fotones /s /rad [8]. Para evitar posibles efectos de confusión asociados con la expresión de alto transgén, esas líneas fundadoras expositoras señal de baja pero consistente BL por encima de la lectura de fondo (aproximadamente 2-6 × 10
5 fotones /s /rad) fueron seleccionados (Fig. S2A). En consonancia con la focalización reportado para el promotor rGH [17], la señal BL fue evidente en la cabeza y los testículos de líneas transgénicas (Figura 2B.); señal modesta también podría ser detectada en las glándulas tiroideas, pero sólo mediante el uso de
ex vivo
formación de imágenes (no mostrado). Los niveles de BL en el cuerpo de los ratones GH son cercanos a los de los ratones WT, lo que indica la alta especificidad del transgén (Fig. S2 B). Con base en el lugar de la actividad de reportero y promotor rGH utilizado para la orientación de estas joyas eran conocidos como "Cabeza Brillante" (GH) ratones.
Se evaluó el posible impacto de la expresión del transgen en función de la hipófisis mediante la comparación de los niveles circulantes de la hormona del crecimiento en GH y WT ratones C57BL /6. Se encontró que los niveles de hormona del crecimiento en suero no fueron significativamente diferentes entre los transgénicos y WT (Fig. 2C), independientemente de su sexo, lo que indica que la expresión del transgén ffLuc-eGFP no afecta abiertamente función pituitaria anterior en ratones GH.
Para evaluar las consecuencias inmunológicas de la expresión del indicador, las células de tumores marcados con ffLuc-eGFP LLC se trasplantaron por vía subcutánea en 6 ratones GH y WT C57BL /, así como MHC-sin igual, inmunocomprometido no obesos inmunodeficiencia combinada /grave diabético (NOD /SCID) los ratones (BALB /c de fondo). Cuando los tumores alcanzaron 500 mm
3 se extrajo sangre y se ensayó el suero para la presencia de anticuerpo anti-GFP. Mientras que los ratones WT portadores de tumores poseían niveles significativos de anticuerpos circulantes anti-GFP (Fig. 2D y Fig. S2C), no se encontró diferencia significativa entre tumor de soporte de GH y los ratones NOD-SCID, que se conoce incompetente para producir anticuerpos (Fig . S2C). Estos datos muestran que mientras inmunogénica en ratones WT, ffLuc-eGFP se tolera y reconocido como auto en ratones de GH.
de crecimiento y metástasis de células tumorales que expresan la prensa xenobióticos capaces de formar imágenes se alteran en WT y ratones NOD /SCID en comparación con GH ratones
Para probar la función de los ratones de GH, se implantó tumores ffLuc-EGFP-etiquetados por vía subcutánea en ratones WT y GH singénicos. Aunque el tamaño del tumor aumentó de manera similar en ambos tipos de ratones huésped, BL aumentos en tumores se retrasaron significativamente en los ratones WT en comparación con los ratones GH (Fig. S3A). Este resultado sugiere que el uso de ratones GH como receptores de aloinjertos podría ayudar a corregir las incoherencias observadas en señales BL de tumores marcados trasplantadas en ratones inmunocompetentes. Para validar este punto, hemos probado GH ratón en un estudio a gran escala que implica tanto del tumor primario y la metástasis. Metastásicas MVT-1 en las células de cáncer de mama [20], [28] fueron transducidas con lentivirus ffLuc-eGFP y trasplantados de forma ortotópica en almohadillas de grasa mamaria de GH o FVB ratones receptores singénicos WT /N. células Mvt-1 marcadas mostraron una mejora significativa en la señalización BL con el tiempo cuando se trasplantan en ratones GH vs. WT, que no pudo retener la señalización (Fig. 3A y paneles superiores de la Fig. S4A). Desde la prensa capaces de formar imágenes son esenciales para la supervisión metástasis, responsables de la gran mayoría de las muertes de pacientes de cáncer, tumores primarios Mvt-1 se resecaron y ratones host seguido con el tiempo.