Extracto
Antecedentes
El problema de la progresión del cáncer de próstata a la independencia de andrógenos ha sido ampliamente estudiado. Varios estudios analizaron sistemáticamente perfiles de expresión génica en el contexto de las redes biológicas y las vías, el descubrimiento de nuevos aspectos de cáncer de próstata. A pesar de los importantes esfuerzos de investigación, los mecanismos que subyacen a la progresión del tumor, son poco conocidos. Se aplicó un enfoque novedoso para reconstruir eventos moleculares de todo el sistema después de la estimulación de las células de cáncer de próstata LNCaP con andrógeno sintético y de identificar posibles mecanismos de progresión andrógeno-independiente de cáncer de próstata.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos efectuado mediciones simultáneas de la expresión génica y los niveles de proteína después del tratamiento utilizando microarrays y proteómica iTRAQ. Conjuntos de genes y proteínas hasta reguladas fueron analizados utilizando nuestro nuevo concepto de "significación topológica". Este método combina los datos moleculares de alto rendimiento con la red mundial de las interacciones proteína para identificar nodos que ocupan posiciones significativas de la red con respecto a los genes o proteínas expresadas diferencialmente. Nuestro análisis identificó la red de la regulación del factor de crecimiento del ciclo celular como el módulo principal respuesta para el tratamiento de andrógenos en células LNCaP. Se demuestra que la mayoría de los nodos de esta red de señalización ocupan posiciones significativas con respecto a la expresión génica observada y perfiles proteómicos provocados por el estímulo de andrógenos. Nuestros resultados indican además que la señalización del factor de crecimiento probablemente representa una respuesta "segunda fase", no depende directamente de el estímulo inicial de andrógenos.
Conclusiones /Importancia
Se concluye que en las células de cáncer de próstata el proliferativas señales son susceptible de transmitirse a partir de múltiples receptores de factores de crecimiento por una multitud de vías convergen en varios reguladores clave de la proliferación celular, tales como c-Myc, ciclina D y CREB1 señalización. Por otra parte, estas vías no son aislados sino que constituyen un módulo de red interconectada que contiene muchas rutas alternativas de entradas en salidas. Si toda la red está implicada, una terapia de combinación formulada con precisión puede ser necesaria para luchar contra el crecimiento del tumor de manera efectiva
Visto:. Vellaichamy A, Dezső Z, L JeBailey, Chinnaiyan AM, Sreekumar A, Nesvizhskii AI, et al . (2010) Análisis "Importancia topológica" de la expresión génica y perfiles proteómicos de las células del cáncer de próstata revela mecanismos clave de andrógenos respuesta. PLoS ONE 5 (6): e10936. doi: 10.1371 /journal.pone.0010936
Editor: Patrick Tan, Duke-NUS Graduate Escuela de Medicina, Singapur
Recibido: 13 Noviembre 2009; Aceptado: May 6, 2010; Publicado: Junio del 3, 2010
Derechos de Autor © 2010 Vellaichamy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Proteómica Alianza de Michigan para la Investigación del cáncer de los Institutos nacionales de Salud (NIH) CA134175-01, concesión R01CA126239 y por GeneGo, Inc. los patrocinadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Andrej Bugrim, Zoltan Dezso y Lellean JeBailey son empleados de GeneGo, Inc. que ha financiado parcialmente este estudio. Los autores confirman que este hecho no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de próstata es uno de los cánceres más comúnmente diagnosticado y la segunda líder causa de muerte por cáncer en los hombres de América del Norte [1]. Aunque la terapia de privación de andrógenos es a menudo eficaz en un principio, la mayoría de los casos evolucionan con el fenotipo mucho más agresivo independiente de andrógenos. A pesar de los importantes esfuerzos de investigación, los mecanismos que subyacen a la progresión del tumor, son poco conocidos. Roles para varias vías de señalización se han establecido, pero no una imagen sistémica. Por ejemplo, la señalización de IGF se ha implicado en la progresión de la dependiente de andrógenos a los estados independientes de andrógenos [2], pero también se ha demostrado que suprimir la trans-activación de AR a través de FoxO1 y por lo tanto tiene efectos inhibidores sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata [ ,,,0],3], se informó de EGF para imitar los efectos de los andrógenos en la expresión génica y de forma independiente estimular el crecimiento de células de cáncer de próstata dependientes de andrógenos [4]. Otros estudios han producido evidencia de interacción entre la señalización de andrógenos y TGF-beta [5], [6], FGF [7], [8] y VEGF [9].
La mayor parte de la investigación antes citada ha sido basado en hipótesis, en lugar de en datos. Formulación de hipótesis es susceptible de sesgo debido a las preferencias de los investigadores y las tendencias actuales de investigación sobre lo que se percibe como "interesante". Un enfoque impulsado por los datos complementarios utilizando perfiles moleculares de alto rendimiento y los algoritmos de análisis de datos avanzados podrían mejorar la comprensión de los muchos procesos celulares que subyacen a la progresión del cáncer de próstata a la etapa independiente de andrógenos y podría abrir el camino a nuevas terapias y para lograr una mayor eficacia de una mejor utilización dirigida de las terapias existentes.
todo el genoma de perfiles de expresión remanso sido ampliamente aplicada a las enfermedades complejas, incluyendo el cáncer de próstata [4], [10], [11], [12], [13], [14]. Varios estudios recientes también analizaron sistemáticamente perfiles de expresión génica en el contexto de las redes biológicas y las vías, el descubrimiento de nuevos aspectos de cáncer de próstata [15], [16], [17]. A pesar de este progreso, análisis verdaderamente sistémica que tenga en cuenta tanto la expresión génica y los datos proteómicos de la misma muestra sigue siendo un objetivo difícil de alcanzar. Un reto fundamental es llevar a cabo un análisis integrado robusta de los conjuntos de datos producidos por las plataformas moleculares tan diferentes. Este es un problema difícil porque la informática los datos de microarrays y proteómica no podían, en la mayoría de los casos, se pueden comparar directamente entre sí. Por ejemplo, los estudios en levaduras han demostrado que la correlación entre los niveles de ARNm y las proteínas correspondientes fueron insuficientes para hacer predicciones fiables sobre los niveles de proteína a partir de los datos de expresión de genes [18]. Un estudio reciente de muestras de cáncer de próstata mostró concordancia entre los datos proteómicos y genómicos que van del 46% al 68% sobre la base de los "presentes ausentes /" llamadas; Sin embargo, las correlaciones fueron bajos cuando los niveles reales de expresión se compararon [19]. Como se muestra en un reciente trabajo [20], mucho más extensa caracterización de proteínas cuantitativa conduce a una mejora significativa en la correlación entre los niveles de la proteína y la expresión génica. Aún así, hay múltiples fuentes intrínsecas de la discordancia, incluyendo la degradación del ARNm, corte y empalme alternativo, la regulación de traducción, modificaciones posteriores a la traducción, y la degradación de la proteína [21]. Estos no pueden ser superados mediante mejoras de la tecnología por sí solos y deben ser abordados por los nuevos enfoques analíticos para la integración de datos. Los esfuerzos anteriores en esta área utilizan conjuntos predefinidos de los genes (vías, categorías de ontología de genes) para buscar la concordancia entre los datos proteómicos y genómicos en este nivel [22], [23].
Recientemente hemos desarrollado una nueva metodología de cálculo que puede ayudar a avanzar en el análisis integrado de múltiples tipos de datos de un paso más allá [24]. Nuestro enfoque combina datos moleculares con enfermedades o condición específica, de alto rendimiento con la red global de las interacciones proteína para identificar nodos que ocupan posiciones significativas de la red con respecto a los genes expresados diferencialmente o proteínas en las bases de datos moleculares presentados. Incluso cuando hay ruido y discordancia significativo en los datos en sí, las predicciones del algoritmo son propensos a converger en un conjunto común de las proteínas de señalización en las vías responsables de los cambios en la expresión de genes diana y proteínas. A menudo, la actividad de estas proteínas de señalización se modifica mediante sutiles modificaciones posteriores a la traducción, la unión a segundos mensajeros, o la contratación a un lugar en particular subcelular. Estos eventos no se reflejan de forma explícita en los perfiles moleculares correspondientes; por lo tanto, permanecen "ocultos" de los ensayos moleculares estándar. Nuestra metodología es capaz de encontrar muchas de estas proteínas "ocultos" mediante la identificación de conjuntos de sus probables objetivos de abajo y evaluar el enriquecimiento de dichos conjuntos de genes o proteínas expresadas diferencialmente. Llamamos a este procedimiento "de puntuación topológica" (consulte la sección para más detalles "Métodos").
En nuestro trabajo a principios de este método fue probado en un conjunto de genes de microarrays de expresión de datos de los pacientes con psoriasis en las que era capaz de identificar correctamente muchas proteínas reguladoras clave cuya relación con la enfermedad se confirma por estudios independientes [24]. En el presente estudio hemos aplicado el sistema de puntuación topológica para investigar la respuesta de las células de cáncer de próstata LNCap al tratamiento con andrógeno sintético (R1881), como un sistema modelo bien estudiado para la progresión del cáncer de próstata. Tomamos un enfoque impulsado por los datos, sin tener ninguna hipótesis preconcebida respecto a los procesos celulares activados por andrógenos en estas células. Hemos recogido y analizado tanto la expresión génica y los datos proteómicos con el fin de validar la cruz-predicciones basadas en diferentes tipos de datos y evaluar la utilidad de este enfoque para el análisis de datos integradora.
y las proteínas afectadas por el tratamiento con andrógenos identificado por microarrays de proteínas y espectrometría de masas
con el fin de interrogar a la función de los andrógenos en el cáncer de próstata, la línea celular de cáncer de próstata LNCaP sensible a los andrógenos se trató con andrógeno sintético R1881 (ver " sección de métodos "para más detalles). células LNCaP tratadas con andrógenos mostraron un aumento de la proliferación celular, mientras que las células de control dejaron de crecer en el medio de andrógenos agotado. Utilizando el análisis estadístico de los datos de expresión de genes que hemos identificado 347 y 257 genes que estaban arriba y hacia abajo reguladas, respectivamente, en los tratados frente a las células no tratadas (FDR≤1%) (Tabla S1). Los genes regulados incluidos conocen los genes inducidos por andrógenos tales como calicreína 3 (
KLK3
; también conocido como
PSA
), proteína de unión FK506 5 (FKBP5), N-myc regula aguas abajo 1 (NDRG1 ) y la sintasa de ácidos grasos (FASN). El uso de perfiles proteómicos basada en MS iTRAQ 2DLC-MS /de andrógenos tratados frente a las células LNCaP no tratadas, se han identificado 70 y 39 proteínas que fueron elevados o hacia abajo-regulados, respectivamente, en las células tratadas en comparación con las células no tratadas (Tabla S1) ( los detalles de la espectrometría de masas y análisis estadísticos se describen en [25]). Los productos de andrógenos reguladas proteína conjunto de datos incluidos genes de los genes regulados hasta conocidos mencionados anteriormente, así como varias otras proteínas previamente conocidos y desconocidos a ser reguladas por andrógenos. Conjuntos de genes y proteínas hasta reguladas tienen 13 miembros comunes, que es ~ 17% del conjunto más pequeño. Para los genes y proteínas reguladas por el nivel de concordancia es ~ 8%.
nodos Topologically significativas en la red de señalización mundial
Con el fin de investigar los mecanismos de señalización que activan putativo de genes y la expresión de la proteína después de estimulación androgénica, hemos aplicado nuestra técnica recientemente desarrollada de importancia el análisis topológico [24]. Hemos presentado las listas de genes regulados y proteínas a la versión en línea de nuestra herramienta de puntuación topológica (http://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi) para identificar las proteínas reguladoras clave cuya actividad en las células tratadas podrían han representado los cambios en los niveles de genes y proteínas. Expresión de genes y proteómica de datos se someterán al procedimiento de puntuación por separado, dando lugar a dos conjuntos de proteínas reguladoras topológicamente significativos. Cada nodo de la red global de las interacciones proteína se asignó puntajes topológicos (valores p topológicos) con respecto a cada conjunto de datos moleculares. Para controlar la tasa de falso descubrimiento se aplicó (FDR), el filtro de nivel de significación. Usando FDR≤5% se identificaron 962 proteínas topológicamente significativas de datos de expresión génica y 577 proteínas topológicamente significativos de los datos proteómicos (Tabla S2). Curiosamente, los dos conjuntos de proteínas topológicamente significativos contienen 301 elementos comunes (o el 52% del conjunto más pequeño) .Este resultado está en marcado contraste con sólo el 17% de superposición entre las listas de genes regulados y regulados hasta proteínas.
factor de crecimiento de la red de señalización es altamente implicados en la respuesta de andrógenos
Para el análisis funcional, ambos conjuntos de las proteínas topológicamente significativos fueron cargados en el paquete de software MetaCore ™ (GeneGo, Inc.), donde se calculó el enriquecimiento en el ontología de procesos funcionales según la definición de "redes de procesos GeneGo". Utilizamos todas las proteínas en la (configuración "por defecto") a la red MetaCore como la lista de referencia para el cálculo de los valores de p de enriquecimiento. Como era de esperar, el proceso más alta calificación es la "señalización de receptores nucleares de andrógenos" (Figura 1a). Sorprendentemente, sin embargo, este proceso es altamente enriquecido sólo en proteínas cuyas puntuaciones topológica se derivan del perfil de expresión génica; 82 de 126 nodos en esta red proceso se consideran significativas con respecto a los genes sobre-expresados. En contraste, sólo 19 nodos se consideraron significativas con respecto a las proteínas hasta reguladas del conjunto de datos iTRAQ. La red siguiente proceso es altamente enriquecido "Regulación del factor de crecimiento del ciclo celular". A diferencia de la señalización de andrógenos, esta red es altamente enriquecido en proteínas que son topológicamente significativo tanto para la expresión génica y los datos proteómicos. De los 186 nodos en esta red, 95 son altamente obtuvieron con respecto a los genes sobre-expresados mientras que 63 son altamente obtuvieron con respecto a las proteínas identificadas-iTRAQ regulados hasta después del tratamiento de andrógenos. En combinación, 49 nodos se confirman como topológicamente significativa de ambos conjuntos de datos moleculares. Un examen de este proceso revela que las proteínas topológicamente significativos están presentes en todos los niveles de señalización de jerarquía, incluyendo varios factores de crecimiento (EGF, FGF, VEGF-A), receptores (IGFR, EGFR, ActRIIB, VEGFR-2), quinasas de señalización (AKT , GSK3, PI3K, JNK, ERK1 /2, PKC), factores de transcripción (c-Myc, IRF1, Tcf (ABL), Smad3, SMAD4, STAT1, STAT3) y, por último, las quinasas ciclina (ciclina D, ciclina e) que regular directamente del ciclo celular (Figura 2). Es importante destacar que, el significado topológico de muchas de estas proteínas se confirmó para ambos conjuntos de datos. A modo de comparación, también hemos realizado análisis de vías de enriquecimiento de los conjuntos originales de los genes y las proteínas hasta reguladas. Curiosamente, la mayoría de los mapas de ruta identificados tanto para la expresión de genes y proteómica conjuntos están relacionados con los procesos metabólicos, la mayoría de ellos en el metabolismo de ácidos grasos (Tabla S3). Además, varias vías de señalización son reveladas por este análisis, en particular la señalización a través MAPK y PIK3, la regulación del metabolismo de los lípidos y un itinerario de ruta relacionados con el ciclo celular factor de crecimiento. Sin embargo, ninguna de las vías de señalización es muy altamente clasificado y el significado general de la enriquecimiento es bajo en comparación con los resultados obtenidos para las proteínas identificadas por la puntuación topológica. Enriquecimiento de las redes GeneGo por proteínas hasta reguladas revela andrógenos red de señalización, sino que también es en la parte inferior de la lista (p = 0,007). A excepción de la señalización de la insulina no parece haber ninguna coherencia entre las redes enriquecidas en genes regulados y proteínas hasta reguladas. En general, parece que el análisis funcional de los genes y proteínas expresadas diferencialmente tiende a identificar las vías blanco de la base, tales como el metabolismo, mientras que la de las proteínas anaylysis topológicamente significativos revela de señalización clave procesado activa en las células estimuladas con andrógenos.
(A) El enriquecimiento de las redes de proceso GeneGo por proteínas topológicamente significativos identificados utilizando todos los genes y las proteínas hasta reguladas. (B) el enriquecimiento de las redes de proceso GeneGo por proteínas topológicamente significativos identificados utilizando conjuntos truncados de datos (con exclusión de los genes y las proteínas directamente regulados por los receptores de andrógenos). Naranja barras de enriquecimiento por proteínas significativos identificados usando conjunto de datos de la proteómica. Azul bares de enriquecimiento por proteínas significativos identificados utilizando los datos de expresión de genes.
Los puntos rojos indican las proteínas identificadas como topológicamente significativa utilizando el perfil de expresión génica. Los puntos azules indican las proteínas identificadas como topológicamente significativa utilizando el perfil de la proteómica. Red cajas proteínas identificadas como topológicamente significativa de ambos conjuntos de datos.
Con el fin de investigar si las diferencias significativas en los tamaños de los conjuntos utilizados en nuestro análisis podrían haber afectado a los resultados que muestra al azar de la piscina genes y proteínas y les añaden a los conjuntos expresados diferencialmente. Este paso fue seguido por análisis de enriquecimiento de los conjuntos extendidos. Sin embargo, los resultados muestran que no hay nuevos mapas o redes se vuelven significativas para los conjuntos más grandes y, además, la importancia de los mapas y las redes previamente identificados va disminuyendo a medida que se añaden más genes al azar. (Ver Tabla S4).
Delimitación dependiente de andrógenos y la actividad independiente de andrógenos
Los resultados presentados anteriormente sugieren que una mayoría de las proteínas en la red de señalización de conexión múltiples factores de crecimiento para la regulación del ciclo celular puede llegar a ser activo después de la estimulación androgénica. La activación resultante de la proliferación celular podría convertirse en un mecanismo que contribuye clave para el cambio a la independencia de andrógenos en el cáncer de próstata. A fin de verificar esta conjetura es necesario investigar si o no este resultado depende de la actividad directa de los receptores de andrógenos. Por lo tanto, nuestro siguiente paso fue para delinear los efectos que son independientes de la activación directa de los receptores de andrógenos de señalización.
En primer lugar, hemos utilizado MetaCore ™ para identificar cuáles de los genes sobreexpresados y hasta regulado proteínas son blancos directos de la regulación transcripcional por el receptor de andrógenos. Con este fin hemos construido la red "vecinos más cercanos" alrededor del receptor de andrógenos con el filtro de la interacción en conjunto para permitir MetaCore único tipo "regulación de la transcripción" de enlaces. Las listas de los genes y las proteínas hasta reguladas fueron asignadas en la red resultante. El uso de esta red se seleccionaron más nodos que son a la vez: "aguas abajo" del receptor de andrógenos y tienen datos experimentales asociados con ellos. Encontramos 45 objetivos directos del receptor de andrógenos entre exceso de genes expresados y 9 de las metas entre el conjunto de proteínas hasta reguladas. Estas moléculas fueron excluidos de las listas originales y conjuntos truncados se volvieron a analizar con la herramienta significado topológico con posterior análisis funcional de los nodos topológicamente anotados en MetaCore ™. Se identificaron 565 proteínas importantes en la base de datos iTRAQ y 668 proteínas importantes en la base de conjunto de datos de la expresión génica (con FDR & lt; 5%, Tabla S5). Una observación inmediatamente perceptible a partir del examen del diagrama de enriquecimiento es la ausencia de la red de señalización de andrógenos (Figura 1b). Esta ausencia confirma que muchas proteínas en la vía de andrógenos recibieron puntuaciones altas topológicas en la fuerza de la sobre expresión de un gran número de objetivos directos de receptor de andrógenos. Una vez que estos objetivos se eliminan de la consideración, las puntuaciones de las proteínas en la vía regulada por andrógenos cayeron por debajo de nivel de significación. En contraste, alto enriquecimiento para la red de la regulación del factor de crecimiento del ciclo celular se mantuvo prácticamente intacta. Mientras que el número de nodos en esta red obtuvo sobre la base de datos de microarrays disminución de 95 a 78, el número de nodos anotó basa en datos iTRAQ aumentó de 63 a 71. El solapamiento entre los dos conjuntos de proteínas significativas también aumentó a 54 (o 76% del conjunto más pequeño). Este hallazgo apoya la sugerencia de que la actividad de esta vía es independiente de la acción de los andrógenos directa y puede representar un importante mecanismo para el cambio a la proliferación independiente de andrógenos en el cáncer de próstata.
proteínas reguladoras Las mejores clasificados y sus vías
a continuación examinamos las moléculas de alta clasificación en los grupos de proteínas topológicamente anotados. Nuestro objetivo fue determinar los factores de transcripción específicos que impulsan la expresión de genes de respuesta tras el tratamiento con andrógenos e identificar las cascadas de regulación que los activan. Hay varios factores de transcripción que pueden regular la expresión de un número significativo de "blancos" entre los genes sobreexpresados o hasta reguladas proteínas o ambos (Tabla 1). Por ejemplo c-Myc tiene 25 platos entre 70 proteínas hasta reguladas identificados por iTRAQ y 63 objetivos entre los 347 genes sobreexpresados identificados por el análisis de microarrays. c-Myc es el número 1 en la puntuación topológica basada en los datos iTRAQ y#11 en la puntuación basado en la expresión génica (todavía en la parte superior del 2%). Otros factores de transcripción que recibieron las puntuaciones topológicas de altura con respecto a ambos conjuntos de datos son SREBP1 y YY1, los cuales son importantes reguladores de enzimas que participan en ácidos grasos de los lípidos y el metabolismo. Por el contrario, CREB1 y ATF-4 son los principales reguladores de la transcripción-marcador con respecto a los datos de microarrays, pero no reciben ninguna puntuación basada en los datos iTRAQ. La razón de tal diferencia es la falta de número significativo de objetivos Creb1 y ATF-4 entre las proteínas hasta reguladas identificadas por espectrometría de masas (Tabla 1). Esto puede indicar la actividad de algunos procesos posttranscriptional bloqueo de la síntesis o la inducción de la degradación de estas proteínas en el momento del muestreo. Mientras que los factores de transcripción a menudo reciben alta puntuación topológica debido al número importante de sus objetivos directos de los conjuntos de datos experimentales, las moléculas de señalización aguas arriba están marcados basan en el enriquecimiento de sus conjuntos de -genes y proteínas "objetivos a distancia" a pocos pasos aguas abajo de señalización vías.
el examen de las cascadas de señalización individuales que conducen a los principales reguladores de la transcripción revela que la señalización de PI3K es apoyado por consistentemente altas puntuaciones topológicos derivados de ambos conjuntos de datos de microarrays y proteómica. La Figura 3 muestra esta cascada en el contexto de la señalización de IGF. La cascada de PI3K se pone de relieve por la línea roja, mientras que todos los elementos que permitan alcanzar altas puntuaciones topológicos con respecto a ambos conjuntos están marcados por cajas de color rojo. Dicha puntuación coherente sugiere el papel central de esta vía en la regulación de eventos que siguen tratamiento con andrógenos. Lo más probable, su papel en este sistema es la inhibición de GSK3 quinasa y su capacidad para fosforilar c-Myc y ciclina D (Fig. 3). Normalmente tales fosforilación apuntaría a estas moléculas para la proteolisis, limitando así la proliferación celular. En esta situación, sin embargo, c-Myc parece estar activado persistentemente a juzgar por el elevado número de sus objetivos directos presentes en ambos conjuntos. Una razón probable para la actividad persistente de la señalización de PI3K es mutación homocigota de PTEN en las células LNCaP que conducen a la falta de su expresión en este sistema [26]. Este efecto puede ser exacerbada por la combinación de alto nivel de calicreína 3, la sobre-expresión del receptor de IGF, y bajo la expresión de las proteínas de unión a IGF-(IBP). Calicreína 3 (también conocido como PSA) es altamente regulados hasta en cáncer de próstata y es consistentemente sobre-expresa en tanto ARNm y los niveles de proteína en nuestros datos experimentales. Fue demostrado previamente que el PSA tiene potencial proteolítica con respecto a las proteínas de unión a IGF [27], [28]. Por otra parte, se sugirió que esto podría ser un mecanismo por el cual se aumenta la biodisponibilidad de IGF, contribuyendo al crecimiento de las células del cáncer de próstata [29], [30].
Nivel rojo en los "termómetros" representa relativa rango (percentil) de una proteína en la lista correspondiente de las proteínas topológicamente significativos. El número identifica el conjunto de datos a partir del cual se calculó la significación: 1-iTRAQ, 2-Affymetrix. Cajas de color rojo y la trayectoria de destacadas ilustran en cascada con el apoyo más fuerte de los dos conjuntos de señalización.
En nuestro análisis hemos obtenido varias piezas adicionales de evidencia para apoyar esta hipótesis. En primer lugar, las proteínas de unión a IGF recibieron puntuaciones altas topológicos basados tanto en los datos de microarrays y iTRAQ. Este resultado confirma que son altamente relevantes para cambios observados en la expresión de genes y proteínas después del tratamiento de andrógenos de las células LNCaP. En segundo lugar, tras el tratamiento de andrógenos que encontramos que los niveles de expresión de al menos una de las proteínas de unión a IGF-(IBP3) y de desplazamiento de receptor de IGF en direcciones opuestas. IBP3 es 30% bajo-expresado en las células tratadas, mientras que IGF-receptor es 46% sobre-expresado. Baja regulación de IBP3 en el nivel genómico, además de la actividad proteolítica de PSA contribuiría a una menor concentración de proteína IBP3 y una mayor disponibilidad de IGF. Cuanto más alto sea el nivel de IGF resultante se corresponde con la sobre expresión de su receptor, lo que lleva a la alta actividad de las vías descendentes.
Discusión
red de factores de crecimiento como el módulo principal respuesta a la estimulación androgénica en LNCaP células
Nuestro análisis topológico identifica la red de la regulación del factor de crecimiento del ciclo celular como el módulo principal respuesta para el tratamiento de andrógenos en células LNCaP. Como se describe en la introducción, diferentes aspectos de la señalización del factor de crecimiento han sido ampliamente investigado en el contexto del interruptor de cáncer de próstata en el modo independiente de andrógenos. Nuestros resultados apoyan estas observaciones anteriores de forma complementaria a nivel de sistemas, la perspectiva basada en los datos. En lugar de centrarse en la actividad de las proteínas individuales, se muestra que la mayoría de los nodos de la red que conectan múltiples factores de crecimiento para los principales reguladores del ciclo celular de señalización ocupan posiciones importantes con respecto a la expresión de genes observados y perfiles proteómicos provocadas por estímulo androgénico. Esta red contiene múltiples "vías" convencionales que transmiten señales desde receptores de factores de crecimiento. Estos incluyen señalización a través de MAP quinasas, y la vía PI3K señalización a través de SMADs y la diafonía entre estos sistemas. Por lo tanto, es razonable concluir que en las células de cáncer de próstata las señales proliferativas se transmiten desde los receptores del factor de crecimiento por una multitud de vías convergen en varios reguladores clave de la proliferación celular, tales como c-Myc, ciclina D y CREB1 señalización. Por otra parte, estas vías no son aislados sino que constituyen un módulo de red interconectada que contiene muchas rutas alternativas de entradas a salidas.
Nuestros resultados indican además que la señalización del factor de crecimiento probablemente representa una respuesta de células "segunda fase" de estímulo androgénico. Cuando todos los objetivos directos de receptor de andrógenos se eliminan de la consideración, la mayoría de las proteínas en la red del factor de crecimiento están aún muy marcados con respecto a los juegos restantes de la sobre-expresado genes y proteínas. Esta respuesta podría ser mediada por los efectos combinados de los altos niveles de PSA y receptores de factores de crecimiento y niveles bajos de inhibidores de factores de crecimiento, tales como proteínas de unión de IGF-(IBP) (Fig. 3). la acción proteolítica de PSA puede contribuir aún más a la reducción de los niveles de IBP. Al mismo tiempo, la expresión de PSA se puede mantener independientemente del receptor de andrógenos por CREB1 y algunos otros factores de transcripción [31]. Cuando estos factores se activan a través de las vías de señalización del factor de crecimiento, un bucle de retroalimentación positiva se plantea que puede mantener altos niveles de PSA y la proliferación celular, incluso en ausencia de receptor de andrógenos activado. Hemos observado que CREB1 es el número 1 en la puntuación topológica de datos de expresión génica, lo que implica que es muy activo en este sistema.
Aunque se necesita más trabajo experimental, tales como siRNA estudios para confirmar estas inferencias, si resultó ser correcta que nos pueden llevar a reconsiderar nuestro enfoque para encontrar terapias dirigidas para el cáncer de próstata. redes biológicas son robustos en un sentido que hay muchas formas alternativas para transmitir una señal molecular de un punto a otro. Teniendo en cuenta las altas tasas de mutación de genes en células de cáncer, es probable que, incluso si bloqueamos un cierto cascada con un fármaco dirigido, habrá al menos una sub-población de células en un tumor que podría eludir tal bloque mediante el uso de una ruta de señalización alternativo. Si toda la red está implicado, se requerirá una terapia de combinación precisamente formulado para luchar contra el crecimiento tumoral eficaz. Por otra parte, este tipo de terapias de combinación podrían tener que ser específico para un pequeño subpoblación de pacientes o incluso pacientes individuales dada propiedades específicas para cada paciente de redes oncogénicos.
naturaleza dinámica de las respuestas celulares y la integración de los datos generados por diferentes tecnologías
En este estudio, se realizaron mediciones simultáneas de la expresión génica y los niveles de proteína después del tratamiento con andrógenos sintéticos, y cientos de genes y de las proteínas cuyos niveles se incrementó tras el estímulo identificadas fueron decenas. Sin embargo, sólo hay solapamiento modesto (aproximadamente 17%) observada entre los conjuntos de hasta reguladas genes y proteínas. Aunque en un principio esto suena sorprendente, este resultado se debe esperar. Las células son sistemas dinámicos complejos en los que los procesos se producen en múltiples escalas de tiempo. Cuando ensayar una muestra biológica que estamos tomando una instantánea estática de este comportamiento dinámico. Por ejemplo, los niveles de ARNm pueden aumentar después de 20-60 minutos después del tratamiento, pero la síntesis de proteínas podría retrasarse aún más, y el cambio estadísticamente significativo en las concentraciones de proteínas tomará mucho más tiempo en desarrollarse y tienen proporciones más pequeñas. En el momento en proteínas se sintetizan algunos ARNm podrían ser degradados, sin dejar rastro de genes sobre-expresión. Por lo tanto, en el estudio de microarrays o datos proteómicos, que se trata de restos fragmentados de la actividad que se quedan atrás por procesos dinámicos transitorios en diferentes niveles de la maquinaria celular. Incluso en los experimentos en los que las muestras son analizadas en varios diferentes puntos de tiempo que todavía está buscando en una pequeña colección de instantáneas individuales en lugar de una visión completa de la dinámica celular.
Aquí hemos utilizado el concepto de significado topológico para reconstruir vías ascendentes que podría haber dado lugar a estos rastros de la actividad dinámica que hemos detectado perfiles moleculares que pueden observarse. Los resultados indican que este enfoque ha tenido éxito en la predicción de proteínas reguladoras clave y vías, tales como la señalización de andrógenos, la señalización del factor de crecimiento y regulación del ciclo celular que median las respuestas de las células LNCaP a tratamiento con andrógeno sintético (R1881). Lo más importante, se ha descubierto que el grado de solapamiento entre las series de proteínas reguladoras predichos a partir de la expresión génica y los datos proteómicos es mucho mayor que la superposición entre el experimental establece sí mismos (52% vs. 17%). Por otra parte, para la regulación del factor de crecimiento del ciclo celular que parece ser un proceso clave en este sistema, la superposición llega a 76%.