Extracto
El cetuximab, un anticuerpo monoclonal que bloquea el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), está aprobado actualmente para el tratamiento de varios tipos de tumores sólidos. Anteriormente puso de manifiesto que cetuximab puede inhibir la hipoxia-inducible factor-1 de alfa (HIF-1α) la síntesis de proteínas mediante la inhibición de la activación de vías de señalización de EGFR aguas abajo incluyendo Erk, Akt y mTOR. 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA) es un compuesto anthrapyrazolone mejor conocido como SP600125 que inhibe específicamente c-jun N-terminal quinasa (JNK). Aquí, se presenta 1, 9 PA puede regular a la baja HIF-1α con independencia de su inhibición de JNK. Este efecto downregulatory fue abolida cuando se ha eliminado experimentalmente el dominio dependiente de oxígeno (ODD) de HIF-1α (HIF-1α-ΔODD, el dominio responsable de la degradación de HIF-1α) o cuando la actividad de HIF-1α prolil hidroxilasa (PHD) o el complejo 26S proteasomal se inhibió, lo que indica que el 1, 9 PA regula a la baja HIF-1α mediante la promoción de la degradación de HIF-1α PHD-dependiente. Hemos encontrado que la combinación de 1, 9 PA y cetuximab trabajó sinérgicamente para inducir la apoptosis en células de cáncer en el que cetuximab o 1, 9 PA solo tenían ninguna o sólo una débil actividad apoptótica. Este efecto sinérgico se redujo sustancialmente en las células cancerosas transfectadas con HIF-1α-ΔODD, lo que indica que la regulación por disminución de HIF-1α fue el mecanismo de este efecto sinérgico. Más importante aún, 1, 9 PA puede regular a la baja HIF-1α en las células cancerosas que no son sensibles a la inhibición cetuximab inducida por la expresión de HIF-1α debido a la sobreexpresión de oncogénico
Ras
(RasG12V). Nuestros hallazgos sugieren que 1, 9 PA es un compuesto de plomo de una nueva clase de fármacos que se pueden utilizar para mejorar la respuesta de las células cancerosas al cetuximab a través de un efecto complementario en la regulación a la baja de HIF-1α.
Visto : Lu y, X Li, Lu H, Ventilador Z (2010) 1, 9-Pyrazoloanthrones regular a la baja HIF-1a y el cáncer de sensibilizar a las células a Cetuximab mediada terapia anti-EGFR. PLoS ONE 5 (12): e15823. doi: 10.1371 /journal.pone.0015823
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 29 Agosto, 2010; Aceptado: 29 Noviembre 2010; Publicado: December 29, 2010
Derechos de Autor © 2010 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud premio 5R01CA129036 (ZF) y una beca del Centro para la terapia dirigida de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center (ZF). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) desempeña varias funciones importantes en el desarrollo y la progresión de muchos tipos de tumores sólidos [1]. Durante las últimas dos décadas, nuevas terapias contra el cáncer dirigidas a EGFR se han desarrollado y estudiado ampliamente [2], [3]. Los estudios clínicos recientes han demostrado una respuesta objetiva en pacientes con varios tipos de cáncer tratados ya sea mediante el bloqueo de EGFR con anticuerpos monoclonales (cetuximab, panitumumab, etc.) o mediante la inhibición de la actividad tirosina quinasa EGFR con inhibidores de molécula pequeña (gefitinib, erlotinib, etc. ) [4] - [9]. Estos estudios llevaron a la aprobación reglamentaria de estos fármacos dirigidos al EGFR para el tratamiento del cáncer colorrectal, de pulmón y cáncer de cabeza y cuello en combinación con la quimioterapia o la radioterapia convencional; Sin embargo, a pesar de las respuestas objetivas, la tasa de respuesta global de los pacientes tratados con la terapia EGFR es baja, sobre todo cuando se utilizan estos fármacos dirigidos al EGFR como monoterapias [10] - [12]. Además, muchos pacientes con tumores que expresan o incluso altamente expresando EGFR puede no tener una respuesta óptima al tratamiento con los agentes [3] dirigidos al EGFR. Por ejemplo, en pacientes con cáncer colorrectal, sólo el 20-30% de los pacientes tenían enfermedad que respondió a anticuerpos de EGFR de bloqueo [4]. Entre el 70-80% de los pacientes con enfermedad no responde, el 30-35% tenían
K-Ras
mutaciones, el 20% tenían
B-Raf Opiniones y
PI3K
mutaciones, y el resto tenía otras aberraciones [13]. Por lo tanto, aunque EGFR juega un papel importante en la tumorigénesis, las células cancerosas son genéticamente inestables y pueden eludir el efecto de la terapia de EGFR a través de varios bien caracterizado y algunos mecanismos de resistencia no-todavía conocidas. Gran parte de investigación en curso se centra en el desarrollo de nuevas terapias combinatorias dirigidas a EGFR y moléculas en EGFR vías de señalización corriente abajo en un intento de superar estos mecanismos de resistencia.
ya se ha informado que el cetuximab puede regular a la baja notablemente los altos niveles basales de la hipoxia inducible factor 1 alfa (HIF-1α) mediante la inhibición de la síntesis de proteínas HIF-1α en líneas celulares de cáncer que son sensibles a la inhibición de EGFR [14], [15]. Hemos demostrado que se requiere la inhibición de HIF-1α, aunque puede no ser suficiente, para mediar la respuesta de las células cancerosas a EGFR-terapia dirigida [14] - [17]. Desmontables de HIF-1α por la interferencia de ARN (ARNi) muy sensibilizado con las células cancerosas oncogénico
Ras
mutaciones o aquellos con
PTEN
inactivación o eliminación al tratamiento con cetuximab [16]. Por el contrario, la sobreexpresión de HIF-1α en células de cáncer que eran originalmente sensibles al tratamiento confiere resistencia sustancial a la terapia anti-EGFR [16]. Estos hallazgos sugieren que la orientación directamente HIF-1α puede omitir varios mecanismos cetuximab de resistencia conocidos, tales como la activación mutacional de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores en las vías aguas abajo de EGFR y /o la activación alternativa de estas vías aguas abajo por otros receptores de factores de crecimiento . combinación Novel se acerca a la orientación EGFR y HIF-1α puede, por tanto, dar lugar a una respuesta terapéutica mejorada en los pacientes.
Varias estrategias para la orientación HIF-1α o sus reguladores aguas arriba o aguas abajo genes diana se han probado en los últimos años [18]. Enfoques para la orientación directamente la función de HIF-1α incluyen la inhibición de la expresión del gen HIF-1α usando antisentido o ARN de interferencia o la inhibición de la actividad transcripcional del heterodímero /β HIF-1α al interferir con su interacción con el ADN o cofactores. Estos enfoques se han probado experimentalmente principalmente, dado que son difíciles de probar clínicamente con la tecnología actualmente disponible. Como alternativa, la proteína HIF-1α puede ser dirigido indirectamente por la regulación de su síntesis de proteínas o la estabilidad usando estrategias farmacológicas que pueden ser probados clínicamente [19].
En nuestro esfuerzo por encontrar nuevos compuestos de plomo pequeñas moléculas que tienen propiedades anti actividad -HIF-1α y que puede ser aún más optimizado para la combinación con cetuximab para mejorar los efectos terapéuticos en las células cancerosas, descubrimos que 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA), que es un anthrapyrazolone mejor conocido como SP600125 que inhibe específicamente c -jun quinasa N-terminal (JNK) [20], [21], se puede regular a la baja fuertemente HIF-1α en múltiples líneas celulares de cáncer. En este estudio, se estudió la relación entre la actividad conocida 1, 9 de PA de la inhibición de JNK y su actividad recientemente descubierto de la regulación negativa de HIF-1α. Además, se estudiaron los mecanismos bioquímicos través de los cuales 1, 9 PA regula a la baja HIF-1α. Por último, hemos realizado experimentos de prueba de evidencia para probar nuestra hipótesis de que el tratamiento de células de cáncer con una combinación de cetuximab y 1, 9 PA puede aumentar la actividad antitumoral de y sensibilizar a las células cancerosas al tratamiento cetuximab. Nuestros hallazgos justifican el desarrollo de nuevos derivados de 1, 9 PA que pueden ser utilizados en combinación con cetuximab para el tratamiento del cáncer a través de regulación a la baja complementaria de HIF-1α sin la inhibición concomitante de JNK.
Resultados
1, 9 PA downregulates HIF-1α independiente de la inhibición de JNK
en este estudio, se encontró que, además de la inhibición de la fosforilación de c-Jun en una forma dependiente de la dosis, 1, 9 PA reduce notablemente el HIF total de nivel de proteína -1α en células de carcinoma escamosas vulvares A431 tan pronto como 15 min después del tratamiento, mientras que 1, no se detectó inhibición inducida 9-PA de JNK en un punto de tiempo más tarde (Figura 1A). Esto sugiere que 1, el efecto downregulatory 9 de PA, el HIF-1α es independiente de su efecto inhibidor de la JNK. El compuesto también indujo un aumento transitorio en los niveles de fosforilación-activación específica de Akt tanto en T308 y S473, así como un aumento sostenido y gradual en el nivel de fosforilados ERK en las células, que están temporalmente correlacionados con la recuperación de HIF nivel -1α a partir de aproximadamente 4 h después del tratamiento (Figura 1A).
(A) orden temporal y la correlación de 1, 9 inducida-PA HIF-1α regulación a la baja y la inhibición de JNK, y la activación inducida por el tratamiento compensatorio de Akt y Erk. las células A431 se trataron con 5 mM 1, 9 PA en medio de cultivo FBS 0,5% para los intervalos de tiempo indicados. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (B) efectos dependientes de la dosis de 1, 9 PA en la regulación negativa de HIF-1α, la inhibición de JNK, y la activación de Erk. células A431 se expusieron a concentraciones crecientes de 1, 9 PA durante 16 h en medio de cultivo FBS 0,5% a 37 ° C. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (C) Independencia de 1, 9 inducida por AP regulación a la baja de HIF-1α de su función inhibidora de JNK. las células A431 se trataron con concentraciones crecientes de 1, 9 PA o 1-metil-1, 9 PA durante 1 h en medio de cultivo FBS 0,5%. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (D) No hay cambios en el nivel de HIF-1α después de la activación o inhibición de JNK. células A431 Wert transfectadas transitoriamente con un vector de control o una de las construcciones que contienen un mutante constitutivamente activa SEK1 S220E /T224D (SEK1-CA), un mutante SEK1 K129R dominante negativo (SEK1-DN), o un dominante negativo mutante MEKK1 K432M (MEKK1-DN) durante la noche. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (E) la activación compensatoria de Erk después de silenciamiento HIF-1α en comparación con el tratamiento por 1, 9 PA o 1-metil-1, 9 PA. células A431 fueron sometidas a desmontables de HIF-1α con específico o ARNsi de control o tratadas con 10 mM 1, 9 PA o 1-metil-1, 9 PA durante 16 h. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (F) regulación a la baja de HIF-1α por 1, 9 PA en varias líneas celulares de cáncer. líneas celulares indicadas se expusieron a 10 o 40 M 1, 9 PA durante 1 h en medio de cultivo FBS 0,5%. Los lisados celulares se prepararon entonces para el Western Blot con los anticuerpos muestran.
La regulación a la baja inducida por el tratamiento de HIF-1α y aumento compensatorio en la señalización celular también fueron 1, 9 PA dependiente de la dosis (Figura 1B) . La dosis mínima de 1, 9 PA necesario para regular a la baja HIF-1α fue entre 1,25 y 2,5 M, que era un poco más alta que la dosis mínima requerida para reducir eficazmente la fosforilación de c-Jun a través de la inhibición de JNK (entre 0,6 y 1,25 M; Figura 1B ), lo que sugiere que el efecto downregulatory recién descubierto de 1, 9 PA, el HIF-1α es independiente de su efecto inhibidor conocido sobre la JNK.
Para confirmar esta observación, se trataron las mismas células con 1-metil -1, 9 PA, un análogo estructural de 1, 9 PA que se ha utilizado como control negativo para 1, 9 PA en la literatura, ya que no inhibe la JNK. Se confirmó que 1-metil-1, 9 PA no redujo la fosforilación de c-Jun en las células A431 en comparación con 1, 9 PA; sin embargo, era igualmente eficaz en la regulación negativa de HIF-1α en estas células (Figura 1C). Por otra parte, la transfección de células A431 con o bien un SEK1 constitutivamente activa, que activa JNK, o con SEK1 dominante negativo o MEKK1 dominante negativo, ambos de los cuales desactivar JNK, no afectó el nivel de HIF-1α en las células (Figura 1D). Estos experimentos de control adicionales proporcionan una fuerte evidencia de que la inhibición de JNK solo no tuvo ningún efecto sobre el nivel de HIF-1α en el modelo de células examinadas.
Figura 1E muestra que el tratamiento de células A431 con o bien 1, 9 PA o 1 metil-1, 9 PA, o desmontables expresión de HIF-1α por RNAi condujeron a un aumento compensatorio en el nivel de fosforilados Erk en estas células, más el apoyo a la conclusión de que el aumento en la señalización celular después de 1, 9 tratamiento PA es una respuesta compensatoria que probablemente está relacionado con la regulación a la baja de HIF-1α, pero no a la inhibición de JNK.
Además de A431 células de carcinoma escamoso de la vulva, se encontró que 1, 9 PA podría regular negativamente HIF-1α en PC3 células de cáncer de próstata, células de cáncer de mama MDA468, las células de cáncer de mama MCF7 transfectadas con un alto nivel de HER2, y H3255 y HCC827 no pequeñas células de cáncer de pulmón de células (Figura 1f). En conjunto, estos hallazgos indican fuertemente que 1, 9 PA puede regular a la baja HIF-1α en células de cáncer humano a través de un mecanismo (s) que es independiente del mecanismo (s) por el cual se inhibe la JNK. Estos resultados también sugieren que las células responden a 1, 9 PA o 1-metil-1, 9 regulación a la baja inducida-PA de HIF-1α o RNAi mediada por silenciamiento de HIF-1α a través de una respuesta compensatoria de la activación de vías de señalización celular que se sabe que aumentar la expresión de HIF-1α [22] - [26].
1, 9 PA disminuye el nivel de HIF-1α mediante la promoción de la ubiquitinación de HIF-1α
a continuación, explorar el mecanismo (s) por el cual 1, 9 PA regula a la baja HIF-1α. HIF-1α es una proteína altamente inestables en condiciones de normoxia, ya que posee el dominio dependiente de oxígeno (ODD), que está sujeta a la regulación postraduccional través de ubiquitinación y degradación de proteínas [27], [28]. Debido a que 1, 9 PA reduce dramáticamente el nivel de HIF-1α en menos de 15 min (0,25 h; Figura 1A), la hipótesis de que 1, 9 PA actúa a través de un mecanismo que mejora la degradación de la proteína HIF-1α. La Figura 2A muestra que, en comparación con el tratamiento de control de vehículo de las células A431 tras el bloqueo de la nueva síntesis de proteínas con cicloheximida, el tratamiento de las células con 1, 9 PA notablemente acelerado la degradación de HIF-1α; el tiempo de degradación se redujo de 60 min en las células de control a menos de 20 min en las células tratadas con 1, 9 PA. Por otra parte, 1, 9 downregulation PA inducida de HIF-1α fue completamente bloqueado por el tratamiento de las células A431 con MG132 (Figura 2B), que inhibe el complejo proteasomal 26S, lo que indica que la reducción de HIF-1α después de 1, 9 tratamiento PA era mediada por la mejora de la degradación de proteínas.
(a) Reducción de estabilidad de la proteína HIF-1α en presencia de 1, 9 PA (1, 9 PA). las células A431 se trataron con 10 mM de cicloheximida (CHX), además de 10 M 1, 9 PA o DMSO control del vehículo en medio de cultivo FBS 0,5% para un máximo de 60 min a 37 ° C. Se prepararon lisados celulares después del tratamiento en cada punto de tiempo y se analizaron por transferencia de Western con los anticuerpos que se muestran. (B) Inhibición de 1, 9 PA inducida por la degradación de HIF-1α por el inhibidor de proteasoma MG132. las células A431 se trataron con 10 mM 1, 9 PA ± 10 M MG132 para los intervalos de tiempo indicados. Los lisados celulares se prepararon después del tratamiento en cada punto temporal y se analizaron mediante transferencia Western con los anticuerpos muestran.
Mientras que 1, 9 PA marcadamente regulado por disminución de HIF-1α en condiciones de normoxia, se encontró que la capacidad de 1 , 9 PA para regular a la baja HIF-1α se redujo notablemente cuando el oxígeno no estaba disponible o cuando las células se trataron con deferoxamina (DFO), un agente quelante de hierro (Figura 3A); ambos O
2 y Fe
2 + son necesarios para HIF-1α prolil hidroxilasa actividad (PHD) hidroxilar HIF-1α para el reconocimiento por la BVS ubiquitina ligasa [29], [30]. El resultado del tratamiento con DFO fue similar a la del tratamiento con MG132: el HIF-1α ubiquitinada se inhibió de la degradación a través de la vía del proteasoma (Figura 3A). Estos hallazgos sugieren que 1, 9 PA puedan afectar directa o indirectamente a la ubiquitinación de HIF-1α [29], [30].
(A) Requisito de O
2 y Fe
2 + en el 1, 9 regulación a la baja de HIF-1α-PA inducida. células A431 se dejaron sin tratar o se trataron con 10 mM 1, 9 PA en medio de cultivo FBS 0,5% en condiciones de normoxia en ausencia o presencia de DFO (100 M) o MG132 (10 M), y en condiciones de hipoxia por 16 h a 37 ° DO. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (B) El papel de la ODD de HIF-1α en la regulación a la baja inducida por PA 1, 9 de HIF-1α. células A431 fueron transfectadas transitoriamente con el HIF-1α-ΔODD construir o un vector de control durante 48 h y fueron entonces o bien no tratados o tratados con las concentraciones indicadas de 1, 9 PA durante 1 hora a 37 ° C. Los lisados celulares se prepararon a continuación para la transferencia Western con los anticuerpos que se muestran. (C) Resistencia de los /las células a la regulación a la baja de 1, 9 inducida por el PA de HIF-1α A431 HIF-1α-ΔODD. células A431 que expresan de forma estable el constructo de HIF-1α-ΔODD fueron tratados como se describe en (A). Los lisados celulares se prepararon entonces para el Western Blot con los anticuerpos muestran.
A fin de probar esta hipótesis, se analizó la capacidad de 1, 9 PA para regular un mutante de HIF-1α en el que el PHD /BVS dominio de interacción de HIF-1α, es decir, ODD, fue suprimido (HIF-1α-ΔODD). Como era de esperar, mientras que 1, 9 PA disminuyó el nivel de tipo salvaje HIF-1α, no afectó el nivel de HIF-1α-ΔODD en las células A431 transfectadas transitoriamente con el HIF-1α-ΔODD construir (Figura 3B). entonces Establecimos células A431 agrupados de forma estable que expresan HIF-1α-ΔODD y confirmaron adicionalmente los resultados obtenidos en las células A431 parentales mediante el tratamiento de las células A431 que expresan HIF-1α-ΔODD de la misma manera (Figura 3C). En conjunto, estos resultados apoyan firmemente la conclusión de que 1, 9 PA downregulates HIF-1α a través de un mecanismo que implica la interacción entre PHD /BVS y la ODD de HIF-1α. Cuando los elementos clave (O
2, Fe
2 +, y 26S del proteasoma) requeridos para la actividad PHD a hidroxilar HIF-1α y para la ubiquitinación VHL mediada posterior y la degradación faltan o inhibido, o cuando el ODD de HIF-1α, que es el dominio de destino por el complejo de ligasa VHL ubiquitina, está ausente, 1, 9 PA pierde su capacidad de regular a la baja HIF-1α.
para obtener evidencia directa de que 1, 9 PA promueve la ubiquitinación de HIF-1α, que somete la HIF-1α inmunoprecipitada a partir de lisados de 1, 9 células A431 tratadas con PA a transferencia Western con un anticuerpo anti-ubiquitina. Se encontró que el nivel de HIF-1α polyubiquitinated se incrementó claramente dentro de los 10 minutos después de 1, 9 tratamiento PA (Figura 4A). La presencia del inhibidor MG132 proteasomal durante el 1, 9 tratamiento PA inhibido HIF-1α ubiquitinada se degrade (Figura 4B)
.
(A). las células A431 se trataron con 10 mM 1, 9 PA para el período de tiempo indicado. Los lisados celulares se prepararon para inmunoprecipitación HIF-1α, seguido de Western Blot de los inmunoprecipitados con anticuerpos dirigidos contra la ubiquitina (arriba), HIF-1α y β-actina. (B) células A431 se dejaron sin tratar o se trataron con 10 mM 1, 9 PA en presencia de 10 mM MG132 durante 1 h en medio FBS 0,5%. HIF-1α se inmunoprecipitó seguida de Western blot con un anticuerpo anti-HIF-1α.
En conjunto, nuestros datos proporcionan una fuerte evidencia de que el 1, 9 PA disminuye HIF-1α a través de un mecanismo que mejora la interacción entre el ODD de HIF-1α y el complejo PHD /VHL /ubiquitinación, y por lo tanto conduce a una degradación mejorada de HIF-1α a través de la vía del proteasoma.
1, 9 PA sinergia con cetuximab para inducir la apoptosis a través de co-regulación negativa de HIF-1α
anteriormente puso de manifiesto que regula a la baja cetuximab HIF-1α en células de cáncer sensibles a la terapia anti-EGFR a través de la inhibición de la síntesis de la proteína HIF-1α, lo que fue impedido por expresión de un Akt myristoylated que es constitutivamente activa [16]. La Figura 5A muestra nuestros resultados actuales, que son similares a las que se informó anteriormente; Curiosamente, a diferencia de nuestros resultados anteriores, la expresión de la Akt constitutivamente activa no afectó a 1, 9 regulación a la baja inducida-PA de HIF-1α (Figura 5B), lo que implica que el papel de 1, aumento 9 inducida-PA en la actividad de Akt (véase la figura 1A) no era para contrarrestar 1, 9 PA inducida por la degradación de la proteína HIF-1α, sino más bien para compensar 1, 9 inducida-PA degradación de la proteína HIF-1α mediante la estimulación de nuevo la síntesis de proteínas HIF-1α.
A431 las células fueron transfectadas transitoriamente con un vector de control o una Akt myristoylated (Myr-Akt) durante 24 h en medio FBS 0,5%. La vectores o células transfectadas con Myr-Akt se trataron a continuación, ya sea con 20 nM cetuximab o PBS durante la noche (A), o con 10 mM 1, 9 PA o DMSO control del vehículo durante 1 h (B). Después del tratamiento, los lisados celulares se prepararon para la transferencia Western con los anticuerpos muestran.
lo tanto la hipótesis de que la combinación de 1, 9 PA y cetuximab, que puede inhibir las vías Akt y ERK y de ese modo bloquear la mecanismos compensatorios, tendrían un aditivo o incluso efecto sinérgico sobre la regulación a la baja de HIF-1α. Pusimos a prueba esta hipótesis en 3 líneas celulares de cáncer que son sensibles al tratamiento con cetuximab: A431, HN5 (cáncer de cabeza y cuello), y DiFi (cáncer colorrectal). Dado que las células DiFi son extremadamente sensibles a cetuximab, que fueron tratadas con 2 nM cetuximab; células A431 y HN5, que no son tan sensibles a cetuximab como células DiFi, se trataron con 10 nM cetuximab. La Figura 6A muestra que, cuando cualquiera de las líneas celulares 3 se trató con o bien 10 o 40 M 1, 9 PA o cetuximab solo, HIF-1α se downregulated. Cuando las células se trataron con ambos 1, 9 PA y cetuximab, HIF-1α se downregulated más. El tratamiento de las células con cetuximab o 1, 9 PA solo indujo únicamente mínima o ninguna escisión de PARP, un marcador de la apoptosis; Sin embargo, la combinación de cetuximab y 1, 9 PA notablemente mayor de la inducción de la escisión de PARP en todas las líneas celulares 3.
(A) Inducción de la escisión de PARP por la combinación de 1, 9 PA y cetuximab. A431, las células HN5, y DiFi eran sin tratar o tratados con cetuximab (10 nM para células A431 y HN5 y 2 nM para células DiFi para 16 h), 1, 9 PA (10 mM o 40 mM añadido la última hora antes de la lisis celular) , o ambos, en medio de cultivo FBS 0,5%. Los lisados celulares se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western con los anticuerpos que se muestran. (B) la inducción de la apoptosis se incrementó en la combinación de 1, 9 PA y cetuximab. Se trataron células A431 como se describe en (A). Los lisados celulares se prepararon y se analizaron por ELISA apoptosis. Los valores de absorbancia relativos se trazan. El
p
valor era & lt; 0,01 al comparar el nivel de apoptosis por 1, 9 PA sola (10 ó 40 mM) o cetuximab solo con el de la apoptosis mediante la combinación de los 2 agentes (nota: sólo el
valores p
la comparación de 10 M 1, 9 PA solo y en combinación con cetuximab se muestran). (C) La dependencia de la inducción de la apoptosis por la combinación de 1, 9 PA y cetuximab en downregulation HIF-1α. A431neo y HIF-1α-ΔODD células A431 /fueron tratados como se indica, y los lisados celulares se prepararon y analizaron como se describe en (A).
Se seleccionaron las células A431 para confirmar aún más este resultado mediante el uso de una apoptosis independiente ELISA que mide cuantitativamente el nivel de fragmentación del ADN histona asociada en el citoplasma después de la apoptosis (Figura 6B). 1, 9 PA solo a concentraciones de 10 y 40 mM no notablemente aumentar el nivel de apoptosis; cetuximab solo sólo moderadamente aumentado el nivel de fragmentación del ADN histona asociada en el citoplasma. Sin embargo, encontramos que el tratamiento de combinación aumentó significativamente el nivel de apoptosis (
p
& lt; 0,01). Para confirmar aún más si la inducción de la apoptosis observada con el tratamiento de combinación fue mediada por los efectos complementarios en la regulación por disminución de HIF-1α por estos 2 agentes, repetimos los experimentos en células A431 que expresan células HIF-1α-ΔODD. La Figura 6C muestra que, en comparación con su efecto en el control transfectadas con vector A431neo células, el tratamiento de combinación tuvo un efecto marcadamente inferior en la escisión de PARP en las células A431 /HIF-1α-ΔODD. El efecto de 1, 9 PA en la regulación a la baja de HIF-1α endógena también se redujo en células /HIF-1α-ΔODD A431 en comparación con las células A431neo. Estos datos indican que la regulación negativa de HIF-1α fue el mecanismo para el efecto sinérgico de la combinación de 1, 9 PA y cetuximab.
1, 9 PA supera Ras oncogénica inducida por la resistencia a cetuximab
mutación oncogénica de
Ras
se ha demostrado que es un importante mecanismo de resistencia a cetuximab en pacientes con cáncer colorrectal [10]. Hemos demostrado anteriormente como una prueba de concepto que desmontables de HIF-1α a través de RNAi restaura sustancialmente la sensibilidad de las células A431 transfectadas con un mutante oncogénico
H-Ras gratis (G12V) al tratamiento con cetuximab [16]. Para demostrar aún más este concepto novedoso, hemos examinado el efecto de 1, 9 PA solo y en combinación con cetuximab en células A431 transfectadas con
-Ras G12V gratis (A431 /RasG12V). La Figura 7A muestra que, en comparación con el control transfectadas con vector A431neo células, las células A431 /RasG12V tenían un nivel basal más alta de la fosforilación de Akt y eran resistentes a la inhibición cetuximab inducida de la fosforilación de Akt, regulación a la baja de HIF-1α, y la escisión de PARP. Además, 1, 9 PA sola inhibió tanto la basal y Ras inducida por la regulación positiva de la fosforilación de Akt y downregulated HIF-1α en tanto A431neo y las células A431 /RasG12V, pero no tenía ningún efecto detectable sobre la inducción de PARP división en cualquiera de las líneas de células . La combinación de 1, 9 PA y cetuximab, sin embargo, aumentó notablemente la escisión de PARP tanto en células A431 y A431neo /RasG12V. La escisión de PARP en las células A431 /RasG12V es particularmente importante, porque cetuximab solo fue incapaz de inducir la escisión de PARP en estas células, debido a la expresión de oncogénico
Ras
; mientras que el tratamiento de combinación en el A431 /células RasG12V dieron como resultado un nivel de la escisión de PARP que era similar al nivel de la escisión de PARP en A431neo células, lo que indica un sinergismo entre 1, 9 PA y cetuximab en la inducción de apoptosis en células de cáncer cetuximab-resistente.
(a) Efecto de 1, 9 PA y cetuximab, ya sea solo o en combinación, en el nivel de HIF-1α y la inducción de apoptosis. A431neo y células /RasG12V A431 eran sin tratar o tratados con cetuximab (10 nM durante 16 h), 10 M 1, 9 PA (añadió la última hora antes de la lisis celular), o ambos, en medio de cultivo FBS 0,5%. Los lisados celulares se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western con los anticuerpos que se muestran. (B) 1, 9 sensibilización mediada por PA a la inhibición del crecimiento inducida por cetuximab. A431neo y las células A431 /RasG12V fueron tratados con concentraciones crecientes de cetuximab ± 5 M 1, 9 PA en medio de cultivo FBS 0,5% durante 5 días. Después del tratamiento, las células se sometieron a un ensayo de MTT. Los valores de densidad óptica de los grupos tratados se normalizaron a los valores de los grupos de control (con o sin 1, 9 de tratamiento PA) y se expresaron como un porcentaje de control respectivo. El porcentaje de células supervivientes se representó como una función de tratamiento con concentraciones crecientes de cetuximab. Las diferencias en la supervivencia celular entre los dos grupos fueron estadísticamente significativas (
p
& lt; 0,01) cuando las concentraciones de cetuximab fueron mayores que 0.625 nM en A431neo células y 1,25 nM en células A431 /RasG12V. (C) 1, 9 sensibilización mediada por PA a la inhibición cetuximab inducida por la producción de VEGF. A431neo y células /RasG12V A431 eran sin tratar o tratadas con 10 nM cetuximab, 10 M 1, 9 PA, o ambos, en medio de cultivo FBS 0,5% durante 16 h. El VEGF secretada en el medio acondicionado por las células se midió por ELISA. El
se mostraron p-valores para las comparaciones
indicados. (D) Comparación de la A431 y las células GEO al tratamiento con 1, 9 PA y cetuximab, ya sea solo o en combinación. células A431 y GEO fueron tratados como se describe en (A). Los lisados celulares se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western con los anticuerpos que se muestran. (MI). 1, 9 PA mediada por células GEO sensibilización a la inhibición del crecimiento inducida por el cetuximab. células GEO fueron tratados con concentraciones crecientes de cetuximab ± 5 M 1, 9 PA en medio de cultivo FBS 0,5% durante 5 días. Después del tratamiento, las células se sometieron a un ensayo de MTT. Los datos se procesaron como se describe en (B). Las diferencias en la supervivencia celular entre los dos grupos fueron estadísticamente significativas (
p Hotel & lt; 0,01). A todas las concentraciones ensayadas de cetuximab
Para obtener más pruebas a nivel celular para apoyar la pro-apoptóticos efecto del tratamiento de combinación, se realizó un ensayo convencional de crecimiento celular y la supervivencia se comparó el efecto dependiente de la dosis de cetuximab con y sin 1, 9 PA en A431neo y células /RasG12V A431. Se encontró que el 1, 9 PA sensibilizado tanto en células A431 y A431neo /RasG12V a cetuximab (Figura 7B). La adición de 1, 9 PA a cetuximab cambió el IC
50 de cetuximab 3-10 nM a menos de 1 nM en células A431neo, y lo más importante, se logra un CI
50 de 3 nM para cetuximab en las células A431 /RasG12V; En contraste, el IC
50 de cetuximab solo no se alcanzó (Figura 7B), incluso a concentraciones mayores de 10 nM (datos no mostrados).
Hemos encontrado que el tratamiento de A431neo células con 1, 9 PA solo no inhibió considerablemente la producción de VEGF en comparación con el tratamiento de estas células con cetuximab solo; la adición de 1, 9 PA no redujo aún más el nivel de la producción de VEGF que fue inhibida por cetuximab (Figura 7C). Curiosamente, sin embargo, cuando las células A431 se convirtió en la resistencia a la inhibición cetuximab inducida por la producción de VEGF debido a la expresión de la oncogénico RasG12V, la adición de 1, 9 PA redujo significativamente el nivel de la producción de VEGF (
p
& lt; 0,01 ).
por último, para determinar si 1, 9 PA también puede sensibilizar a las células de cáncer con origen natural
Ras
mutaciones, hemos examinado el efecto de la combinación de 1, 9 PA y cetuximab en GEO células de cáncer colorrectal, que se sabe que han mutado
Ras
[31]. Sin embargo, a pesar de que lleva una mutado
Ras
en el exón 2, las células GEO respondieron a 1, 9 PA y cetuximab en una manera similar como lo hicieron las células A431. 1, 9 PA dio lugar a un aumento compensatorio en el nivel de Erk fosforilada después del tratamiento durante la noche (16 h) tanto en las células A431 y GEO, que se redujo en presencia de cetuximab. La combinación de estos 2 agentes mejorada de escisión de PARP en ambos tipos de células (Figura 7D) y células GEO sensibilizados a la inhibición inducida por cetuximab del crecimiento celular y la supervivencia (Figura 7E).
En resumen, nuestros resultados indican que 1, 9 PA puede sensibilizar a las células cancerosas a la terapia anti-EGFR cetuximab mediada por la regulación negativa de HIF-1α y puede mejorar la respuesta celular al tratamiento con cetuximab en las células cancerosas que lleva oncogénico
Ras
mutaciones.
Discusión
Aquí, se presenta 2 resultados importantes, que, hasta donde sabemos, no han sido reportados previamente.