Extracto
Antecedentes
in vitro
cultivo celular experimentos con células primarias han informado de que la proliferación celular se retarda en presencia de ambiente en comparación con O
2 niveles fisiológicos. El cáncer es principalmente una enfermedad de proliferación celular aberrante, por lo tanto, el estudio de las células cancerosas cultivadas en O ambiente
2 pueden ser indeseables. Para entender mejor el impacto de O
2 en la propagación de las células cancerosas
in vitro
, se comparó el potencial de crecimiento de un panel de líneas celulares de cáncer de ovario en condiciones ambientales (21%) o fisiológico (3% ) O
2.
principales conclusiones
Nuestras observaciones demuestran que al igual que las células primarias, muchas células cancerosas mantienen una sensibilidad inherente a O
2, pero algunos pantalla de insensibilidad a los cambios en O
2 la concentración. Un análisis más detallado reveló una asociación entre la regulación defectuosa G2 /M del ciclo celular transición y O
2 insensibilidad resultante de la sobreexpresión de 14-3-3 σ. Orientación de la sobreexpresión de 14-3-3 σ con ARNi restaurado O
2 sensibilidad en estas líneas celulares. Además, se encontró que los tumores ováricos metastásicos frecuencia sobreexpresan 14-3-3 σ, que en conjunto con RB fosforilada, da como resultado un mal pronóstico.
Conclusiones
Las células cancerosas diferencial de sensibilidad a los cambios proliferativa en O
2 la concentración. Aunque no se determinó una relación directa entre O
2 insensibilidad y la metástasis, esta investigación mostró que una O
2 fenotipo insensible en las células cancerosas que se correlaciona con la progresión del tumor metastásico
Visto:. Ravi D, Chen Y, Karia B, Brown A, Gu TT, Li J, et al. (2011) 14-3-3 σ Expresión Efectos G2 /M respuesta al oxígeno y se correlaciona con metástasis del cáncer ovárico. PLoS ONE 6 (1): e15864. doi: 10.1371 /journal.pone.0015864
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Agosto, 2010; Aceptado: 25 Noviembre 2010; Publicado: 10 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Ravi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIEHS (K22-ES12264) y un Premio Fondo Voelcker Investigador joven del Fondo Voelcker Max y Minnie Tomerlin a AJR Obispo. Centro de Kleberg de marcadores moleculares en el Centro de Cáncer MD Anderson, El Programa Científico MD Anderson Cancer Center Médico, el Programa de Becas McNair apoyado por la Fundación Robert y Janice McNair y la Sociedad Americana del Premio desarrollo de la carrera clínica fundación contra el cáncer de Oncología (ASCO) (CDA ), Fundación del cáncer y por una Science Foundation Ireland (SFI) /Health Research Board (HRB (Irlanda)) Investigación traslacional Premio (TRA), todos a BT Hennessy. B. Karia se apoya en el seno del Departamento de Defensa Premio CDRMP Investigación del Cáncer del Programa Predoctoral Práctica (BC093931). A. Brown es apoyado por NIA beca de formación T32 (T32AG021890). Y. Chen está apoyado por el NIH /NCI subvención centro de cáncer (P30 CA054174-17) y la subvención del NIH /CNRR CTSA (1UL1RR025767). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer proporcionan un sistema de modelo experimental manipulable que facilita la investigación de la biología del cáncer y su terapia. El potencial de proliferación ilimitada de las células cancerosas es una característica importante de malignidad, sin embargo el uso de protocolos estándar de cultivo de tejidos a menudo restringe la proliferación celular, tal como se observa con las líneas de células primarias [1], [2], [3], [4]. Aunque el uso de las condiciones fisiológicas se conoce para impactar
in vitro
proliferación de células cancerosas [5], [6], [7] y se sabe que las células primarias para propagar mejor en fisiológica O
2, la impacto de fisiológica O
2 en la
in vitro
proliferación de células cancerosas en es relativamente inexplorada. Sin embargo, se ha informado de que las concentraciones alteradas de O
2 resultados en claras diferencias en la proliferación y la respuesta al tratamiento con fármacos de células en las células del cáncer [8], [9], [10].
Oxygen , además de nutrientes y factores de crecimiento, es vital para el crecimiento celular apropiado y su disponibilidad tiene un impacto directo sobre el metabolismo celular, vías de señalización, la proliferación, la diferenciación y la supervivencia [3], [11], [12], [13]. Muchos
in vitro
investigaciones han demostrado las ventajas de O fisiológica
2 para el cultivo de tejidos. Por ejemplo, el comportamiento biológico de los cultivos celulares primarios con una concentración fisiológica de O
2 (2.7 a 5.3%) es muy superior en comparación con la práctica normal de las células que crecen debajo de "ambiente" atmosférica o O
2 concentración ( 21% de O
2) [4]. De hecho, se sabe que estas dos condiciones de crecimiento para dar como resultado metabólica distinta y características moleculares [13].
La importancia de considerar O
2 tensión en la biología del cáncer está bien establecido. Por ejemplo, el hecho de que existen muchos tipos de cáncer en un estado 'hipóxico' ha llevado al desarrollo de la terapia de la hipoxia orientada [14], [15]. En general, la concentración hipóxica de O
2 es & lt; 1% para los tumores más sólidos, sin embargo la concentración hipóxico podría variar en función de los tipos de células y el estado de perfusión normal [16] y, además, la hipoxia tiende a inhibir la proliferación celular [ ,,,0],17]. Fisiológica O
2 tensión varía de 2.7 a 5.3% en el espacio intersticial [18], donde muchos tumores primarios residen, hasta el 14,7% en la circulación arterial y los pulmones, donde la migración y con frecuencia se encuentran células cancerosas potencialmente metastásicas. Por lo tanto, los estudios de cáncer que sólo se llevan a cabo en el ambiente (21%) O
2 pueden faltar observaciones biológicas pertinentes. Esto puede ser particularmente importante cuando se trata de estudiar la progresión del cáncer de la enfermedad metastásica, que es un acontecimiento importante en la etiología del cáncer y se asocia con un mal pronóstico [19]. Teniendo en cuenta las diferencias en O
2 tensión en diferentes compartimentos del cuerpo, una comprensión del efecto de la O
2 la concentración sobre la proliferación de células de cáncer podría proporcionar información útil sobre los mecanismos implicados en la progresión patológica de cáncer.
Las células cancerosas que han adquirido mutaciones en oncogenes o genes supresores de tumores muestran un fenotipo característico proliferación incontrolada [20]. Por ejemplo, los supresores de tumores tales como p53 o RB acto como "guardianes" moleculares que se sabe afectan la progresión del ciclo celular. La mutación de estos factores facilita proliferación ilimitada en células de cáncer [20]. progresión del ciclo celular implica una serie secuencial de eventos catalizada por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDKs) [21], y en las células normales es un proceso estrechamente regulado. El gen supresor tumoral p53 es un regulador maestro de G1 /S y la transición de la fase G2 /M del ciclo celular [22] y se sabe que tiene un papel importante en la respuesta a la concentración de oxígeno, en particular la hipoxia (& lt; 1% de O
2) [23] o la hiperoxia (95% o
2) [24]. Aunque el examen del efecto de las extremas O
2 condiciones es importante y revelador, hay que señalar que estos estudios anteriores no investigaron la respuesta de p53 a nivel fisiológico (3%) O
2 y ambiental (21%) O
2. p21 y 14-3-3 σ son dianas transcripcionales de p53 que están implicados en la regulación de G1 /S y G2 /M transiciones del ciclo celular por la orientación CDK2 y CDC2 (también conocido como CDK1), respectivamente [22], [25] . El CDK, a su vez, regulan la función de proteínas RB, para mediar en la progresión del ciclo celular a través de G1 /S y G2 /M [26]. Por lo tanto, la interrupción de la función RB también podría afectar el control de la progresión del ciclo celular [26]. Teniendo en cuenta que las diferencias en O resultado
2 concentración en la progresión del ciclo celular alterada en células primarias, pero las células cancerosas a menudo mostrar los defectos de control del ciclo celular, es evidente que el potencial que estos defectos pueden afectar a cómo las células cancerosas responden a O alterado
2 los niveles de una manera que podría tener una profunda influencia en la progresión del cáncer.
a continuación examinamos el comportamiento biológico de las células de cáncer de ovario en virtud fisiológica y ambiental O
2. Curiosamente, algunas de las líneas celulares de cáncer de ovario tenían una respuesta normal a O
2 la concentración, (
es decir
reducida proliferación de las células con un aumento de O
2 concentración), mientras que la proliferación de otras líneas celulares de cáncer de ovario no se vio afectada por esta O
2 aumento. Además, nuestras investigaciones revelaron que 14-3-3 σ y su papel en el ciclo celular influyen en la respuesta proliferativa a O niveles alterados
2. Teniendo en cuenta la variación en la presión parcial de oxígeno en todo el cuerpo y la importancia potencial que este contexto puede tener en la progresión del cáncer, es crucial para entender el efecto de la O
2 la concentración sobre la proliferación de células de cáncer y la progresión del cáncer. Proporcionamos evidencia de que la adquisición de O
2 insensibilidad puede ser un componente en la progresión del cáncer y un sello distintivo de la enfermedad metastásica éxito.
Resultados
Resultados de oxígeno fisiológicos en aumento de la proliferación celular en el cáncer de ovario células
En nuestros estudios iniciales se comparó el efecto de la fisiológica (3% O
2) y ambiente (21% O
2) la concentración de oxígeno utilizando células de cáncer de ovario A2780 y observamos que 12 días de cultivo de células en estas condiciones dio lugar a una supresión del crecimiento 2,6 veces menor de 21% O
2 (Figura 1). Por lo tanto, hemos examinado el efecto de la O
2 concentración en el potencial de crecimiento de seis líneas celulares de cáncer de ovario utilizando fisiológica (3% O
2) y ambiente (21% O
2) las concentraciones de oxígeno. Dado que el suero presente en medio de cultivo celular también puede tener una influencia dominante sobre el crecimiento, también a prueba el efecto de diferentes concentraciones de suero. Independientemente de la cantidad de suero presente en el medio de crecimiento, el cultivo en 21% O
2 generalmente como resultado una disminución significativa en la proliferación celular para cuatro de las líneas celulares de cáncer de ovario (A2780, OVCAR5, OVCAR8 y HOC8) en comparación con 3 % O
2 (Figura 2). La única excepción fue observado con las células HOC8 en presencia de la mayor concentración de suero (10% v /v), donde se observó un efecto de crecimiento insignificante O
2-dependiente (Figura 2). Es de suponer que la falta de respuesta en Hoc8 el resultado de una influencia dominante de suero, que no se observó con A2780, OVCAR5 y OVCAR8. Por el contrario, no hubo ningún efecto significativo en el crecimiento de líneas celulares SKOV3 y HeyA8 aumentando el O
2 la concentración a 21%, independientemente de las concentraciones en suero (Figura 2). La excepción fue observada HeyA8 cultivadas en suero al 2%, que mostró disminución de la proliferación celular en el 21% de O
2 en comparación con el 3% de O
2 (
p Hotel & lt; 0,001). En contraste con el efecto de la O
2 niveles, el aumento de la concentración de suero como resultado un incremento proporcional en el crecimiento del cáncer de ovario líneas celulares A2780, OVCAR5 y OVCAR8 (
p
& lt; 10
- 5, la Figura 2). La concentración de suero tuvo una influencia moderada en el crecimiento de SKOV3 y HeyA8 (Figura 2); una concentración en suero entre el 2 y el 6% tuvo un efecto significativo (
p Hotel & lt; 10
-5) en SKOV3, mientras que la concentración sérica HeyA8 entre el 2 y el 10% de suero tuvo el mayor efecto en el 3% O
2 (
p Hotel & lt; 10
-5) (Figura 2). El aumento de la concentración sérica de 6% a 10% tuvo poco efecto sobre el crecimiento de HeyA8, SKOV3 y HOC8 (Figura 2). En conjunto, parece que los dos niveles de oxígeno y la concentración sérica afectan el crecimiento de estas líneas celulares de cáncer de ovario, pero de manera independiente. Como se esperaba de trabajo por otros con células primarias [4], se observó que la mayoría de las células de cáncer de ovario que se muestran disminución de la proliferación celular en el ambiente de O
2 en comparación con la concentración fisiológica O
2 la concentración. Sin embargo, dos líneas celulares no parecen tener inhibe la proliferación celular en el más alto (ambiente) O
2 niveles. Por lo tanto, se categorizaron las líneas celulares de cáncer de ovario en base a estas diferencias, ya sea siendo O
2 sensible (A2780, OVCAR5, OVCAR8 y HOC8) o insensible (SKOV3 y HeyA8) (Figura 2). En general, estas diferencias indican heterogeneidad en el crecimiento de las respuestas de regulación a las señales fisiológicas de O
2 niveles en estas líneas celulares cultivadas.
Se sembraron en una placa de Petri de 10 cm Igual número de células de cáncer de ovario A2780 y fueron rutinariamente mantenido por debajo del 3% o
2 (fisiológica) o el 21% de o
2 (ambiente). El aumento en el número de células se determinó contando manualmente una vez cada tres días, y el número de células totales se estimaron y se representa mediante la escala lineal (en el Gráfico A) y la escala (en el Gráfico B) log.
líneas celulares de cáncer de ovario se cultivaron en 3% o 21% de o
2 y se determinó el grado de proliferación después de 3 días de crecimiento (véase la sección de Materiales y Métodos). Para cada línea celular, el porcentaje de proliferación celular en 3% O
2 (barras de luz sombreada) y a diferentes concentraciones de suero se comparó con la proliferación bajo condiciones de cultivo de tejidos estándar que consta de 21% (ambiente) O
2 (barras sombreadas oscuras) y 10% de FBS. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y estadísticamente significativa (por prueba t de Student) diferencias en la proliferación entre el 3% y el 21% de O
2 para cada concentración de suero se indica con un asterisco [(*)
p Hotel & lt; 0,05, (**)
p Hotel & lt; 0,001 y (***)
p
. & lt; 0,0001]
es posible que la aparente O
2 insensibilidad y diferencias en la proliferación resultado de diferencias en el tiempo de duplicación de cada línea celular. Por ejemplo, si SKOV3 y HeyA8 (O
2 líneas de células insensibles) proliferan más lentamente, O
2 cambios de proliferación dependientes puede ser demasiado trivial para medir. Por lo tanto, se midió el tiempo de duplicación celular para todas las líneas celulares de cáncer de ovario. Nuestros resultados mostraron que, en condiciones de cultivo de tejido estándar (10% de suero y 21% de O
2) el tiempo de duplicación para todas las líneas celulares de cáncer de ovario eran algo similar (& lt; 24 horas) a excepción de HOC8, que tenía un tiempo de duplicación extendido de alrededor de 45,5 ± 4,9 horas (Tabla S1 y S1 ver Métodos). Por lo tanto, la mayoría de las líneas celulares de cáncer de ovario fueron dividiendo a una velocidad aproximadamente iguales, y la diferencia bruta en tiempo de duplicación es poco probable que sea un factor en las diferencias observadas entre la proliferación de líneas celulares en diferentes condiciones.
correlatos sensibilidad al oxígeno con los cambios dinámicos en las fases S y G2 del ciclo celular
Teniendo en cuenta las diferencias en la proliferación observada para las líneas celulares de cáncer de ovario que crecen bajo ya sea del 3% o el 21% de o
2, se examinó si o
2 concentración altera el perfil del ciclo celular de cada línea celular. Independientemente de la concentración de suero, la comparación de 3% O
2 al 21% O
2 resultó en una disminución significativa en el porcentaje de células que estaban en la fase G1 del ciclo celular y un aumento significativo en el porcentaje de células en la fase S (Tabla 1), que se esperaba en base a observaciones anteriores realizadas con células primarias [27]. Además, en tres de los O
2 líneas celulares sensibles (A2780, OVCAR5 y OVCAR8) el porcentaje de la población de células en la fase G2, fue significativamente superior en el 21% de O
2. Sin embargo, un aumento significativo en G2 no se observó en la cuarta O
2 línea celular sensible, HOC8 (Tabla 1). Al igual que en HOC8, el O
2 líneas de células insensibles, SKOV3 y HeyA8, no mostraron una alteración significativa en la proporción de células en la fase G2 del ciclo celular cuando se cultivan bajo 3% O
2 o el 21% O
2 (Tabla 1). Teniendo en cuenta que los O
2 líneas celulares sensibles proliferaron más lentamente en el 21% de O
2 comparado con el 3% de O
2 a pesar de tener menor proporción de su población de células en G1 y un aumento de las proporciones en S y G2, llegamos a la conclusión de que estas células deben estar progresando más lentamente a través del ciclo celular. Sin embargo, para los O
2 líneas de células insensibles y HOC8 (con el tiempo de duplicación ampliado considerablemente), no se observó un aumento significativo en el porcentaje de células en G2 cuando la junta se incrementaron
2 niveles. Estos resultados sugieren que a pesar de las fases G1 y S del ciclo celular están respondiendo de manera similar a los cambios en O
2 la concentración en ambos O
2 líneas celulares sensibles e insensibles, es la fase G2 del ciclo celular que es no responde a O
2 concentración en las O
2 líneas de células insensibles. Por lo tanto, la diferencia en la respuesta del ciclo celular observado con estas líneas celulares de cáncer de ovario puede ser a nivel de la regulación durante la progresión del ciclo celular de G2 a la fase M. También es posible que los cambios observados con G2 y O
2 sensibilidad en estas líneas celulares de cáncer se refleja en el componente mitótica del ciclo celular. Nuestra observación de las células mitóticas presentes en el O
2 líneas celulares sensibles e insensibles cultivadas bajo 3% y 21% O
2 apoya esta conclusión; la O
2 líneas celulares sensibles muestran una disminución proporcional en la población celular mitótico observado en 21% O
2 en comparación con 3% O
2, (Figura 3), correspondiente a una acumulación de células en G2 al 21% de O
2 (Tabla 1). Del mismo modo, en los O
2 líneas de células insensibles (HeyA8 y SKOV3) la proporción de células mitóticas se mantuvo inalterada independientemente de O
2 concentraciones (Figura 3). Esto se espera debido a que, como se señaló anteriormente (Tabla 1), la proporción de células en G2 en el O
2 líneas de células insensibles también se vieron afectados por O
2 la concentración. Llegamos a la conclusión que la mayoría de las células cancerosas conservan la capacidad de regular el ciclo celular en respuesta a los cambios en O
2 concentración comparable a las células de tipo salvaje [27]. Sin embargo, algunas células cancerosas pueden perder O
2 de control dependiente de la concentración del ciclo celular (como en el O
2 líneas celulares de cáncer insensibles), dando como resultado un fenotipo distinto.
Índice mitótico en el ovario líneas celulares de cáncer que se cultivaron bajo 3% o 21% de o
2 durante 3 días se determinaron contando núcleos con cromosomas condensados, entre el mínimo de 1000 células presentes en cada experimento. La significación estadística se determinó por ANOVA y la diferencia significativa en el índice mitótico entre 3% y 21% O
2 se representa por un asterisco [(*)
p
& lt; 0,05, (***)
p Hotel & lt; 0,0001]
insensibilidad oxígeno se correlaciona con los componentes G2 /M alterada
Hasta ahora hemos demostrado que O
2. la respuesta del ciclo celular sensible a la transición G2 /M está ausente en las líneas de células insensibles O
2. Por lo tanto, pasamos a caracterizar esta observación adicionalmente determinando qué componente de G2 /M regulación es deficiente en las células cancerosas O
2-insensibles. La principal efector de transición G2 /M es CDC2 [22], [28]. CDC2 forma un complejo con la ciclina B [29], [30], que fosforila diversas proteínas estructurales resultantes en el colapso de la envoltura nuclear, la condensación y la segregación de los cromosomas [30], [31] y la inactivación de proteínas reguladoras otra del ciclo celular tales como WEE1, RB y Cdc25C [30], [32]. En las células normales, los niveles globales de proteína CDC2 se mantienen constantes durante todo el ciclo celular [33] y son regulados por modificación post-traduccional [33] y la localización celular [30], [31]. Una vez que el residuo Tyr15 en CDC2 se desfosforiló por Cdc25C, CDC2 activada forma un complejo con la ciclina B, se acumula en el núcleo, y promueve el G2 M transición /[30], [33], [34]. Esto ocurre de forma gradual a través de cantidades crecientes de proteína CDC2 nuclear [30]. Nuestro examen de proteína total y proteínas CDC2 CDC2 fosforilada reveló que ambos son considerablemente más bajos en los O
2-líneas de células insensibles (HeyA8 y SKOV3) en comparación con las líneas celulares O
2-sensibles (Figura 4A). A pesar de que los niveles de Cdc2 fueron relativamente altas en el O
2 líneas celulares sensibles (A2780, OVCAR5 y OVCAR8) (Figura 2), se observó una disminución en Tyr15 estado de fosforilación independientemente de O
2 la concentración de A2780, OVCAR5 y OVCAR8 con el aumento de los niveles en suero (Figura 4A). Esto se correlaciona con la observación de que el aumento de causas de concentración en suero aumento de la proliferación celular y resulta en una reducción concomitante en la proporción de células en G2 /M (comparar con la Tabla 1). Sin embargo, no se observó manifiesta O
alteración 2-dependiente, ya sea en la ciclina B o Cdc25C, total o fosforilada en el O
2 líneas celulares sensibles (A2780, OVCAR5, OVCAR8 y HOC8) en comparación con O
2 insensibles líneas celulares (HeyA8 y SKOV3) (Figura 4A). Por lo tanto, parece que la disminución observada en la población de células en G2 en 21% O
2 podría no ser dependiente de la inactivación de la fosforilación mediada de Cdc2. Debe tenerse en cuenta que estos experimentos se realizaron en las células de forma asíncrona en crecimiento, por lo que es posible que las diferencias en el estado de transitorios CDC2 se perdieron. Curiosamente, los niveles de Cdc2, ciclina B y Cdc25C (el regulador negativo de Cdc2) fueron considerablemente más bajos en O
2 líneas de células insensibles (HeyA8 y SKOV3) en comparación con O
2 líneas celulares sensibles (A2780, OVCAR5, OVCAR8 y HOC8) (Figura 4A). Estas observaciones sugieren una deficiencia inherente en los componentes principales implicados en la progresión G2 /M en el O
2 líneas de células insensibles.
Proteína lisados preparados a partir de las líneas celulares de cáncer de ovario mantuvieron en medio de crecimiento que constaba de aumentar concentraciones de suero y 21% o 3% o
2 se analizaron por Western blot. (A) En comparación con O
2 líneas celulares sensibles, disminución de la expresión de los componentes básicos que intervienen en G2 /M del ciclo celular progresión CDC2 /complejo de ciclina B1 y su Cdc25C activador se observa en el O
2 líneas de células insensibles ( indicado por asterisco y en cursiva), mientras que la expresión de 14-3-3 σ, una proteína que inhibe CDC2 es elevada en los O
2 líneas de células insensibles. (B) La fosforilación de RB y Wee1 se controlaron como un indicador para la función CDC2 porque ambos RB y Wee1 son conocidos objetivos para la fosforilación por CDC2. La igualdad de carga de extractos de proteínas se controló mediante el sondeo de las transferencias de Western despojado con el anticuerpo primario para la β-actina.
p53, p21 y 14-3-3 σ son factores que tienen la capacidad negativamente a la influencia actividad CDC2 y G2 /M transición [22]. La comprensión actual es que el ciclo celular p53 y p21 influencia en condiciones hipóxicas y hiperóxicos [23], [24], [35], [36]. Teniendo en cuenta los niveles reducidos de Cdc2 y el G2 aparentemente defectuoso /M puesto de control en el O
2 líneas de células insensibles (HeyA8 y SKOV3), que exploró la posibilidad de que el deterioro se debe a un defecto en cualquiera de estos reguladores moleculares. Western blot encontró p53 y p21 que se sobreexpresa en un átomo de O
2-línea de células insensibles (HeyA8). Sin embargo, ambos estaban ausentes en el otro O
2-insensibles línea celular (SKOV3), y el patrón de expresión de estas proteínas se mantuvo inalterada independientemente de los cambios en O
2 o la concentración en suero (Figura S1), lo que sugiere que ni p53 p21 ni es relevante para la función de CDC2 en O
2 sensibilidad. Curiosamente, se observó una elevación considerable en la expresión de 14-3-3 σ (Figura 4A) en el O
2 líneas de células insensibles (HeyA8 y SKOV3) en comparación con las líneas celulares O
2-sensible. Aunque, el nivel de expresión de 14-3-3 σ era considerablemente más baja en todo O
2 líneas de células sensibles en comparación con HeyA8 y SKOV3, sí se observó un aumento en la expresión de 14-3-3 σ en el 21% O
2 con A2780 (Figura 4A). Aunque en contradicción con el papel inhibidor conocido de 14-3-3 σ de Cdc2 actividad, llegamos a la conclusión de que los altos niveles de 14-3-3 σ combinados con niveles reducidos de Cdc2 en una célula cancerosa proliferación pueden indicar una falta de control de G2 /progresión M en respuesta a los niveles de O
2.
para aclarar la consecuencia de los bajos niveles de proteína CDC2 observados en las líneas celulares O
2-insensibles, se determinó la actividad funcional de los restantes CDC2 mediante el examen de la fosforilación de dos de sus sustratos, RB y WEE1. La fosforilación de RB en el 807 residuo de Ser está mediada por CDC2 [32], y se observó esta fosforilación independientemente de los niveles CDC2 o O
2 niveles con 10% de suero de todas las líneas celulares excepto HOC8 (Figura 4B), indicando CDC2 irreprochable la actividad en estas líneas celulares. Una reducción en RB fosforilada en correlación con la reducción de la concentración de suero (Figura 4B) y se correlacionó con el aumento de acumulación de RB total en el O
2 sensible a las líneas celulares (A2780, OVCAR5 y OVCAR8), pero no en HOC8 (Figura 4B) . RB total fue apenas detectable en las O
2-líneas de células insensibles (HeyA8 y SKOV3) (Figura 4B), con la excepción del 2% al 3% de suero O
2 condición en la línea celular HeyA8. Curiosamente, una comparación entre el patrón de expresión RB (Figura 4B) y la proliferación celular (Figura 2) reveló que las células HOC8, HeyA8 y SKOV3 crecen mejor en medio de cultivo de células con una baja concentración de suero (2%) en comparación con A2780, OVCAR5 y OVCAR8. Por tanto, parece que la respuesta total nivel de proteína RB se mantiene intacta en O
2 líneas celulares sensibles y que esta respuesta es probablemente más relevante para las concentraciones séricas que los niveles de O
2. El otro objetivo de la inactivación CDC2 mediada por la fosforilación es WEE1, que también puede inhibir recíprocamente función CDC2 por fosforilación [37]. Se observó el aumento de la fosforilación de Wee1 en el O
2 líneas celulares sensibles (A2780, OVCAR5 y OVCAR8), apenas niveles detectables en HOC8, (Figura 4B) y una ausencia total en las líneas O
teléfonos 2-insensibles ( HeyA8 y SKOV3, la Figura 4B). Este patrón se recapitula en gran medida por los niveles de proteína WEE1 totales (Figura 4B). Por lo tanto, la ausencia de fosfo-WEE1 en los O
2-líneas de células insensibles no indica una ausencia de Cdc2 actividad, sino más bien una ausencia del sustrato WEE1. A partir de estos resultados se concluye que a pesar de las cantidades reducidas de Cdc2 en la junta líneas celulares
2-insensibles, CDC2 es funcionalmente activa y desinhibida por el aumento de los niveles de 14-3-3 σ. Cabe señalar que RB y CDC2 actúan entre sí para regular cada función otros [38], y el estado de fosforilación de RB [26] o CDC2 [39] podría influir E2F mediada por la expresión de las ciclinas, que son esenciales para la progresión del ciclo celular. Por lo tanto, teniendo en cuenta esta relación compleja entre RB y CDC2, el patrón de fosforilación de RB es insuficiente para predecir G2 /M progresión
.
En resumen, la O
2 sensible a las líneas celulares (A2780, OVCAR5 y HOC8 ) mostraron una mayor expresión de Cdc2 y ciclina B combinada con un bajo nivel de expresión de 14-3-3 σ. Esto sugiere que los componentes del ciclo celular necesarias para una respuesta proliferativa dinámica a las diferencias en la O
2 la concentración está presente en estas líneas celulares. Sin embargo, en la junta líneas celulares
2-insensibles que expresan altos niveles de 14-3-3 σ y los bajos niveles de Cdc2 y Cdc25C una respuesta del ciclo celular tan dinámica a los cambios en O
2 concentración podría resultar comprometida. Por lo tanto, nos hemos propuesto la posibilidad de que esta correlación inversa entre 14-3-3 σ y CDC2 podría ser importante para la regulación de O
2-sensible de la transición G2 /M.
14-3-3 σ y mitótico progresión de la sensibilidad de oxígeno
Nuestras observaciones anteriores sugieren una asociación entre el nivel elevado de 14-3-3 σ y O
2-insensibilidad que necesita ser confirmada. Por lo tanto, hemos querido confirmar que 14-3-3 σ afecta de hecho la proliferación O
2-dependiente. Para esta parte del estudio, se restringió el análisis a dos líneas de células con p53 de tipo salvaje: la A2780 O
2-sensible [40], y O líneas celulares HeyA8
2-insensibles [41]. Hasta ahora hemos utilizado el análisis de Western blot para monitorear los niveles de expresión globales de 14-3-3 σ y CDC2 (Figura 4A). Sin embargo, ya que las respuestas funcionales de estas proteínas dependen de su localización celular, se utilizó inmunofluorescencia para determinar su localización celular bajo 3% O
2 y 21% O
2. En el O
2-sensibles línea celular A2780, la localización de 14-3-3 σ se restringió al citoplasma por debajo del 3% O
2 (Figura 5A), pero se ha encontrado tanto en el núcleo como en el citoplasma en 21% de O
2 (Figura 5A). CDC2 se distribuyó por toda la célula y su localización no fue afectado por O
2 la concentración. Por tanto, parece que la exclusión nuclear de 14-3-3 σ se correlaciona con una disminución de la fracción de células en la fase G2 /M y una progresión del ciclo celular sin inhibición cuando A2780 se cultiva en 3% O
2, como se ha señalado antes (Tabla 1). En contraste, la O
2 insensible-línea celular HeyA8 mostró altos niveles de 14-3-3 σ y bajos niveles de CDC2 (Figura 4A), con una cantidad considerable de 14-3-3 σ en el citoplasma (Figura 5A). Además, 14-3-3 σ permaneció excluido del núcleo, incluso en 21% O
2 en las células HeyA8 (Figura 5A). Estas observaciones fueron verificadas por análisis de transferencia Western de fracciones celulares nucleares y citosólicas obtenidas a partir de estas células (Figura 5B). Por último, para confirmar el efecto sobre la transición G2 /M, se determinó la proporción de esas células en fase M para diferentes O
2 concentraciones utilizando el marcador específico fosfato histonas H3 mitosis. En las células O A2780
2-sensible, menos de 21% de O
2, se observó una disminución en el índice mitótico (P & lt; 0,001), en comparación con el 3% de O
2 (Figura 5C). No se observó tal O
2 cambio dependiente del índice mitótico de las células HeyA8 O 2-insensibles
(Figura 5C). Estos resultados apoyan nuestra conclusión inicial, que los O
2 líneas de células-sensibilidad social tienen una deficiencia en la regulación de la progresión del ciclo celular en G2 /M en respuesta al aumento de O
2 niveles (Figura 2).
(a) localización celular por inmunofluorescencia muestra que 14-3-3 σ (verde) se encuentra en el citoplasma y CDC2 (rojo) está presente en el núcleo (azul). En comparación con O
2 A2780 células sensibles, el nivel de 14-3-3 σ es mayor y CDC2 es baja en los O
2 células HeyA8 insensibles. En el A2780 O
2 sensible, 14-3-3 σ se localiza tanto en el núcleo y el citoplasma en el 21% de O
2. (Una línea amarilla discontinua, se esboza un representante de núcleos para indicar la localización relativa de 14-3-3 σ y CDC2 en estas células). (B) Análisis de transferencia Western de las fracciones nucleares y citoplasmáticas muestran bajos niveles de 14-3-3 σ en el núcleo en comparación con el citoplasma, con mayores cantidades de 14-3-3 σ estar presente en el citoplasma de la O
2 HeyA8 células insensibles. El nivel de Cdc2 es mayor tanto en el núcleo como en el citoplasma de la
2 A2780 sensibles O, pero presente en una cantidad inferior sólo en el núcleo de O
2 HeyA8 células insensibles. La histona H1 y β-actina se utilizaron como controles de carga para las fracciones nucleares y citoplasmáticas, respectivamente. (C) Las células mitóticas se determinaron mediante recuento de las células que se tiñeron positivamente para un marcador específico de la mitosis, fosfo-histona H3 de la población celular total. (DO). Los experimentos se realizaron por triplicado.