Extracto
Un aumento del riesgo de cáncer colorrectal se relaciona con el desarrollo de síndromes metabólicos, incluyendo la hiperglucemia e hiperinsulinemia. Los altos niveles circulatorios de glucosa y /o insulina o la aplicación de insulina exógena pueden promover la carcinogénesis, la progresión del cáncer y la metástasis, que se puede atribuir al efecto Warburg o glucólisis aeróbica. Hemos tratado de resolver estas cuestiones existentes mediante la aplicación de análogos de la glucosa 2-desoxiglucosa (2DG). De acuerdo con los
in vitro
estudios que hemos realizado, la glucólisis de células de cáncer colorrectal podría ser interrumpido por 2DG, ya que disminuye las producciones celulares de ATP y lactato. Además, 2DG indujo apoptosis y detención del ciclo celular, y inhibió la proliferación, la migración y la invasión de estas células. Dado que la insulina puede estimular la captación celular de hexosa, incluyendo 2DG, la combinación de 2DG y la insulina mejorado la citotoxicidad de 2DG y mientras tanto se sobrepuso a los efectos promotores del cáncer de insulina. Este
in vitro
estudio proporcionó un punto de vista de 2DG como un potencial agente terapéutico contra el cáncer colorrectal, especialmente para pacientes con hiperinsulinemia concomitante o tratada con insulina exógena
Visto:. Zhang D, Q Fei, Li J, Zhang C, Sun Y, Zhu C, et al. (2016) 2-desoxiglucosa revierte el efecto promotor de la insulina en células de cáncer colorrectal
in vitro
. PLoS ONE 11 (3): e0151115. doi: 10.1371 /journal.pone.0151115
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos |
Recibido: 30 de septiembre de 2015; Aceptado 22 de febrero de 2016; Publicado: 3 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Programa de Desarrollo Académico prioridad de instituciones de educación superior de Jiangsu (TPPA). No se revelaron los posibles conflictos de interés en
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es conocido por ser fuertemente. asociado a un estilo de vida occidental. La incidencia aumenta rápidamente durante el último siglo en paralelo con el desarrollo económico en auge [1] .given el aumento de la morbilidad de los síndromes metabólicos, se han llevado a cabo muchos estudios para investigar su conexión con el CRC. Las evidencias sugieren que la diabetes mellitus tipo 2 (DM), resistencia a la insulina, hiperinsulinemia son factores de riesgo independientes para el cáncer colorrectal [2,3].
DM tipo 2 se caracteriza por hiperglucemia resultante de la combinación de la resistencia a la insulina y una falta relativa de insulina. que circula alto nivel de glucosa es probable que favorezcan el desarrollo del cáncer. La razón principal es que la mayoría de células cancerosas dependen predominantemente de la glucólisis aerobia para generar la energía necesaria para los procesos celulares, un fenómeno conocido como el efecto Warburg [4]. Aparte de ser la fuente de energía principal, la glucosa se utiliza como una fuente de carbono principal para reacciones anabólicas [5] .Este característica se ha aprovechado para el cáncer de imagen en clínicas mediante la aplicación de 2- (18F) fluoro-2-desoxi-D -glucosa (FDG) en la tomografía por emisión de positrones (PET). La orientación del metabolismo de la glucosa se ha convertido en una estrategia potencial contra el cáncer. Uno de los inhibidores más prometedores es glicolíticas 2-desoxiglucosa (2DG) [6-8]. 2DG es un análogo de la glucosa sintético que tiene el grupo hidroxilo C-2 sustituido por hidrógeno (Fig 1A). Después de entrar en la célula a través de los transportadores de glucosa (GLUT), 2DG se convierte por la hexoquinasa para formar 2DG fosforilado que se acumula en la célula, lo que lleva a la inhibición no competitiva de la hexoquinasa, la disminución de la producción de ATP y lactato, y, finalmente, célula de inhibición del crecimiento y de células la muerte (figura 1B) [6-8].
(A) estructura molecular de la glucosa y la 2-desoxiglucosa. (B) debido a la semejanza estructural con glucosa, 2-desoxiglucosa entra en la célula a través de glúteos, que conduce a la interrupción de la glucólisis con producciones disminuidos de ATP y lactato [6-8]. G: glucosa. 2DG:. 2-desoxiglucosa
Además de los efectos de la hiperglucemia, resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia compensatoria también son importantes contribuyentes al desarrollo y la progresión de varias neoplasias [9]. La insulina se ha confirmado que se capaz de estimular la captación de glucosa en muchas células del cáncer [10], que pueden promover el efecto Warburg. La insulina también puede ejercer efectos mitogénica y anti-apoptóticas [11-13]. Además, la insulina puede amplificar la biodisponibilidad de la insulina como factor de crecimiento 1 (IGF-1) [14-16]. Los pacientes con cáncer colorrectal concomitante y la DM tipo 2 que puedan tener acceso a la insulina se enfrentan a la amenaza potencial que la insulina puede promover la progresión del cáncer. Los estudios con modelos animales han confirmado la hipótesis de [17]. Aunque en la actualidad la relación entre la insulina o resistencia a la insulina y el cáncer colorrectal no es explícita, nadie puede ignorar los efectos potenciales de la insulina en las distintas etapas de la carcinogénesis.
La comprensión del metabolismo de la glucosa y la función de la insulina en células de cáncer colorrectal promoverá el desarrollo de algunos enfoques novedosos para su prevención y tratamiento. Este
in vitro
estudio tiene como objetivo determinar los efectos anticancerígenos de 2DG y los efectos de la insulina en las líneas celulares de cáncer colorrectal. Además, este estudio investigó la posibilidad de la insulina en la mejora de la eficacia contra el cáncer de 2DG.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Dos líneas celulares de cáncer colorrectal (HCT116, LoVo ) se obtuvieron del Banco de células de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se cultivaron en alta glucosa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (4,5 g /l de glucosa) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS ), 1% de penicilina-estreptomicina, en un 5% de CO
2 humidificado incubadora a 37 ° C.
Productos químicos
2DG y la insulina del páncreas de bovinos fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). Los fármacos se disolvieron en medio de cultivo completo. Las soluciones se esteriliza por filtración usando unidades de 0,22 micras jeringa-filtro (Beyotime Biotecnología, Shanghai, China).
Se realizó ensayo de proliferación celular
Recuento celular Kit-8 (CCK8) ensayo de proliferación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Beyotime Biotecnología, Shanghai, china). Las células se trataron con 2DG y /o insulina para 24, 48 o 72 h. A continuación, medios de cultivo se reemplazó con medio fresco suplementado con el reactivo de proliferación celular. Después de la incubación 2 h, las mediciones se realizaron usando un lector de placas espectrofotométrico de 96 pocillos (Sunrise-Basic Tecan, Austria) con la longitud de onda de absorbancia a 450 nm. Se evaluó efecto de la insulina sobre la proliferación celular y se determinó una concentración de insulina apropiada para tener éxito estudios.
citometría de flujo en el análisis de ciclo de la apoptosis y de células
La citometría de flujo en el análisis de la apoptosis se realizó utilizando una método de tinción doble con anexina-V-FITC y yoduro de propidio (PI). El ensayo se llevó a cabo utilizando Apoptosis Kit (KeyGen Biotech. Co. Ltd., Nanjing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron cultivadas con 2DG y /o insulina durante 24 h y luego se trataron con tripsina y sin EDTA, se lavaron con PBS, se tiñeron con Anexina V-FITC y PI y se analizaron por citometría de flujo (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Los datos se procesaron por el flujo de Kaluza citometría de software de análisis de 1,2 (Beckman Coulter).
Para el análisis del ciclo celular, se utilizó Cell Cycle Kit de Análisis de Beyotime Biotecnología (Shanghai, China) en base a las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron, se lavaron con PBS, se fijaron en 75% de etanol frío y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Luego, las células se lavaron y se re-suspendieron en solución de tinción que contiene PI y ARNasa y se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C antes de citometría de flujo análisis. fracciones del ciclo celular se cuantificó con el software WinCycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA).
La migración celular y la invasión de ensayo
La migración y la invasión de células de cáncer colorrectal se evaluaron utilizando Transwell permeable apoya (Corning Incorporated, Corning, NY, MA) con filtros de 8,0 micras de tamaño de poro, 6,5 mm de diámetro. suspensiones de células del cáncer en DMEM (5 x 10E5 células /ml, 100 pl) suplementado con o sin fármaco se añadieron al compartimento superior de la cámara y 600μL DMEM que contiene 10% de FBS se añadió al compartimento inferior. Después de la incubación 24 horas, los filtros se recogieron y se sumergieron en cristal violeta. Las células en la superficie superior del filtro fueron borrados con hisopos de algodón. El número de células que pasa a través del filtro se contó en cinco campos bajo un microscopio. Para los
in vitro
ensayo de invasión, se agregó Matrigel (BD Biosciences) a la superficie superior (50 l /cm
2) para formar una barrera matriz y la concentración celular inoculado fue de 1 x 10E6 células /ml .
analiza el contenido de ATP
El contenido de ATP intracelular se determinó utilizando un método basado en luciferina-luciferasa. Las células se incubaron con 2DG y /o insulina durante 24 h. A continuación, las células se tripsinizaron, se contaron y se procesan utilizando ATP Assay Kit (Beyotime Biotecnología, Shanghai, China) y las mediciones se realizaron utilizando un luminómetro (GloMaxTM 20/20, Promega Corporation, Madison, WI). La producción de ATP se normalizó al número de células y se expresa como porcentaje de valores normalizados de ATP que se encuentran en las células de control.
La producción de lactato
analiza
análisis la producción de lactato se realizaron utilizando el kit de ensayo de lactato (Beyotime Biotechnology, Shanghai , China). Después del tratamiento con 24h 2DG y /o insulina, las células se rasparon con un rascador de células y se contaron el número de células. A continuación, las suspensiones se sometieron a ultrasonidos en hielo durante 3 ciclos. Cada ciclo consistió en sonicación 5s con una potencia de salida de 100 W de un disruptor de células ultrasónico Qsonica (Newtown, CT), seguido de 30 años de incubación. Las muestras sonicadas se ensayaron para determinar el conjunto de los niveles de lactato siguientes instrucciones del fabricante. los niveles de lactato extracelulares también se determinaron como se recogieron y se ensayaron los medios de cultivo. Las mediciones se realizaron usando un lector de placas espectrofotométrico Tecan con la longitud de onda de absorbancia a 540 nm. Las producciones de lactato se normalizaron al número de células y se expresaron como porcentaje del control.
extracción de proteínas y Western blotting
Las células se trataron con 20uU insulina y /o 5 mM 2DG durante 24 h y luego se lisaron con tampón de radioinmunoensayo ensayo de precipitación (RIPA) (biotecnología Beyotime, Shanghai, china) suplementado con 1% de fluoruro de phenylmethanesulphonyl (PMSF) (Beyotime biotecnología). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime biotecnología). Las muestras se mezclaron con tampón de carga de muestra 5 × SDS-PAGE. Cantidades iguales de extractos de proteínas enteras se sometieron a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA) por transferencia electroforética Wet. Las membranas se bloquearon en 5% de leche desnatada en tampón Tris-solución salina más un 0,1% de Tween 20 (TBS-T) y después se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios se indica frente a fosfo-AMPKα (Thr172) (Cell Signaling Technology), AMPKα (Cell Signaling Technology) , SLC16A3 /MCT4 (Abcam), LC3A /B (Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), MCL-1 (Cell Signaling Technology), survivina (Cell Signaling Technology), la MMP-2 (Cell Signaling Technology), p62 (Cell Tecnología de señalización). Las transferencias se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) y se visualizaron con Immobilon ™ occidental quimioluminiscente de HRP Sustrato (Millipore Corp, EE.UU.) utilizando el sistema FluorChem E (ProteinSimple, Santa Clara, CA ).
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó sobre la base de la prueba t de Student. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Las operaciones estadísticas se realizaron utilizando el paquete estadístico para Ciencias Sociales software de la versión 19 (SPSS, Chicago, IL).
Resultados
La insulina aumentaron la antiproliferación y la apoptosis inducción de 2DG
in vitro
en la primera serie de experimentos, se examinó si 2DG poseía ningún efecto antiproliferativo en líneas celulares de cáncer colorrectal. ensayo de proliferación celular se realizó cada 24 horas durante 72 horas. Los datos mostraron que 2DG ejerció un efecto inhibidor significativo sobre la proliferación tanto de las células en comparación con el control (Fig 2B1 y 2C1). El efecto inhibidor era la dosis y dependiente del tiempo. En contraste, la insulina generalmente exhibe una modesta promoción sobre la proliferación celular (figura 2A), que no aumentó en paralelo con el aumento de la concentración de insulina. 20μU insulina /ml cerca del límite superior del nivel fisiológico normal en el estado de ayuno fue seleccionado para tener éxito estudios. La combinación de 2DG y la insulina (20μU /ml) dio como resultado una significativamente mayor supresión de la proliferación celular en comparación con el tratamiento 2DG solo (Fig 2B y 2C).
Los porcentajes de células viables en diferentes puntos temporales (24,48 , 72 h) se muestra. Los datos se presentan como la media ± SD de los resultados obtenidos a partir de tres experimentos independientes. (A) La proliferación celular en respuesta a concentraciones de ingrediente insulina. (B y C) HCT116 y células de cáncer colorrectal LoVo se trataron con 2DG a las concentraciones indicadas, con o sin la presencia de insulina (20μU /ml). (D) Las células fueron tratadas durante 72 h con 5 mM 2DG y /o 20μU insulina /ml. Se construyeron curvas de crecimiento celular. *, diferencias significativas en comparación con los controles (P & lt; 0,05). #, Diferencias significativas frente al control, al mismo tiempo (P & lt; 0,05).
Análisis de la apoptosis celular por citometría de flujo mostraron un leve aumento de la apoptosis de las células del cáncer después del tratamiento 2DG
in vitro
(Fig 3). Las proporciones de células de la anexina V-positivo /PI-negativo, lo que indica células temprana de apoptosis, y las células con anexina V-positivo /PI-positivos, indicando apoptosis tardía o células necróticas, el aumento de una manera dependiente de la dosis (datos no mostrados) bajo el efecto de 2DG. El análisis de transferencia Western mostró que 2DG inhibió la expresión de proteínas de supervivencia Mcl-1 y survivina (Fig 4). Aunque no es estadísticamente significativo, la insulina tiende a suprimir la apoptosis de células de cáncer. Cuando la insulina se administra simultáneamente, las células apoptóticas se incrementaron aún más en comparación con la monoterapia con 2DG (Figura 3). Los resultados de los ensayos de proliferación y apoptosis celular sugieren que la insulina promueve los efectos contra el cáncer de 2DG y que 2DG invirtió el promotor del cáncer, efectos de la insulina.
La citometría de flujo análisis de apoptosis de las células se detectó por tinción PI y Anexina V-FITC (A: HCT116, B: LoVo). Las células se trataron con 5 mM de 2DG y /o 20μU /m insulina. El experimento se realizó por triplicado. Se muestran imágenes representativas. *, P & lt; 0.05. #, Diferencias significativas en comparación con los controles (P & lt; 0,05) guía empresas
Western blot de MCL-1 y survivina.. GAPDH se utilizó como control de carga.
2DG G1 del ciclo celular inducida por
in vitro
proliferan rápidamente las células cancerosas son adictos al aumento de las cantidades de glucosa no sólo para la producción de energía, sino también para la biosíntesis de ácidos nucleicos, proteínas, y lípidos [18]. La interferencia con el metabolismo de la glucosa podría detener o retrasar la progresión del ciclo celular. Citometría de flujo análisis de la distribución del ciclo celular mostró que la incubación de células con 2DG resultó en un aumento del porcentaje de células en fase G1 (Fig 5). Por el contrario, la insulina inducida por un fuerte aumento de las células en S y G2 fases. Sin embargo, la detención del ciclo celular G1 por 2DG se atenuó pero no promovido por la insulina
distribución del ciclo celular de las células cancerosas tratadas en condiciones variables. (A: HCT116, B: LoVo). El experimento se realizó por triplicado. Se muestran imágenes representativas. *, P & lt; 0.05. #, Diferencias significativas en comparación con los controles (P & lt; 0,05).
combinación con insulina 2DG la migración de células de cáncer notablemente reprimida y la invasión
in vitro
Para determinar si 2DG podría atenuar el potencial metastásico, Transwell permeable apoya fueron utilizados con y sin recubrimiento de Matrigel para evaluar la invasión y la migración, respectivamente. En comparación con el grupo control, la invasión y la migración fueron significativamente inhibida en ambas células tratadas con 2DG (Fig 6). Por el contrario, la insulina aumentó significativamente la migración de células de cáncer y la invasión. El número de células que migraron y invadidas fueron, respectivamente, 1,28 y 1,32 pliegues pliegues de los controles en HCT 116, 1,25 y 1,42 pliegues pliegues en LoVo. En comparación con la monoterapia 2DG, la migración y la invasión en las células estaban deprimidos aún más por la combinación de insulina y 2DG. El número de células que migraron e invadió redujo en más del 50% de las personas en los grupos de control. El análisis de transferencia Western mostró que la insulina promueve la expresión de la proteína-un miembro clave MMP2 entre las metaloproteinasas de la matriz, que podría, en cierta medida explican la invasión efecto promotor de la insulina. Por el contrario, 2DG inhibió la expresión de MMP2 (Fig 7B).
En la migración y analiza la invasión de las células cancerosas, se analizaron cinco campos seleccionados al azar. se muestran imágenes representativas. se presentó el número de células que migraron y invadidas. Los datos se representan como media ± desviación estándar. #, diferencias significativas en comparación con los controles (P & lt; 0,05). * P & lt; 0.05.
(A) los niveles totales y extracelulares de lactato se muestran para las células tratadas con 2DG y /o insulina durante 24 h. El lactato intracelular se determinó como la diferencia entre los de la total y extracelular. #, diferencias significativas en comparación con los controles (P & lt; 0,05). * P & lt; 0.05. (B) Análisis de transferencia Western de SLC16A3 /MCT4, la MMP-2. GAPDH se utilizó como control de carga.
Combinar 2DG con insulina dio lugar a una marcada disminución en la producción de ATP y lactato
in vitro
Sobre la base de la contra el cáncer efectos, que a continuación, investigaron el efecto de 2DG en la glucólisis
in vitro
. Proliferan rápidamente las células cancerosas se caracterizan por la glucólisis elevada, por lo tanto, la hipótesis de que 2DG daría lugar a la supresión de la glucólisis debido a su carácter no metabolizable y la inhibición de algunas enzimas glucólisis. Se analizaron ATP y los niveles de lactato en respuesta a 2DG. Se observaron disminuciones significativas en los niveles de ATP intracelulares totales después de la administración de 2DG (Figura 8A). La incubación de las células HCT116 y LoVo con 2DG en 5 mM durante 24 h dio lugar a niveles de ATP en 53% y 42% de los niveles en las células no tratadas, respectivamente. La presencia de la insulina no afectó a la producción de ATP. Cuando los dos fármacos fueron aplicadas en forma conjunta, el contenido de ATP se redujeron aún más. Como consecuencia de la privación ATP, 2DG indujo la regulación positiva y la activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) como se demuestra por análisis de transferencia Western (Fig 8B). 2DG también indujo la regulación al alza de LC3I y la conversión de LC3I a LC3II (figura 8B), lo que sugiere la regulación al alza de la autofagia. Otro marcador de la autofagia - p62- disminuye con la elevación de la autofagia, ya que puede ser degradado en este proceso [19]. Como se muestra en la figura 8B, 2DG bajó el nivel de p62. 2DG se asemeja estructuralmente glucosa pero no puede ser metabolizado para generar energía imitando así el efecto de la privación de glucosa y la activación de la autofagia
.
(A) Los niveles de ATP después del tratamiento de 2DG y /o insulina (20μU /ml) durante 24h en las células de cáncer colorrectal. los niveles de ATP se normalizaron a la muestra de control sin tratar. Los datos son la media ± SD de 3 experimentos independientes. #, diferencias significativas en comparación con los controles (P & lt; 0,05). * P & lt; 0.05. (B) Análisis de transferencia Western de fosfo-AMPKα (Thr172) que representa la AMPK activa, que representa AMPKα total de AMPK, p62, LC3A /B. GAPDH se utilizó como control de carga.
En cuanto a la determinación de la producción de lactato
in vitro
, suspensiones de células se sometieron a ultrasonidos y se analizaron para los niveles de lactato total (figura 7A). La diferencia entre los niveles totales y extracelulares de lactato podría indirectamente indicar el nivel de lactato intracelular. Los resultados mostraron que tanto los niveles totales y extracelulares de lactato se incrementaron por la insulina en comparación con el control, mientras que sorprendentemente los niveles de lactato intracelulares se redujeron ligeramente en ambas células. La hipótesis de que el lactato podría ser consumido por estas células de normoxia para el anabolismo o exportado mucho más en gran medida bajo la influencia de la insulina. Como era de esperar, 2DG disminuyó significativamente la producción de lactato. La combinación de los dos agentes dio lugar a una disminución de más nivel de lactato, mientras que el lactato intracelular parecía ser aumentado ligeramente. Monocarboxilato transportador 4 (MCT4), que participan en la extrusión de lactato, se downregulated significativamente por la combinación como se muestra por transferencia de western (Fig 7B), lo que podría explicar el aumento de lactato intracelular en cierta medida.
Discusión
para la DM tipo 2 pacientes, la hiperglucemia puede aumentar el riesgo de cáncer, que en cierta medida se puede atribuir al efecto-a Warburg fenómeno que la mayoría de las células cancerosas producen predominantemente de energía en la glucólisis en lugar de la fosforilación oxidativa seguida de una secreción elevada de ácido láctico, incluso en la condición de suficiente tensión de oxígeno [5]. La hiperinsulinemia también puede ser un contribuyente potencial al cáncer como el efecto metabólico de la insulina puede promover el efecto Warburg. Una dosis alta (supraphysiological) de la insulina exógena se requiere a menudo en el tratamiento de diabetes para lograr la normoglucemia. Al tiempo que mejora el control metabólico, el nivel elevado de insulina puede aumentar el riesgo de cáncer por los efectos dependientes de la dosis en la diferenciación celular, el crecimiento, la proliferación, la migración y la invasión [20]. Para los pacientes con cáncer de la diabetes, se informa que el desarrollo de resistencia a la insulina para ser combinado con frecuente sobreexpresión del receptor de insulina y el aumento de actividad de la insulina en las células del cáncer [12]. La insulina también puede obstaculizar la eficacia de muchos fármacos quimioterapéuticos [21-23]. A pesar de que sigue siendo una cuestión de si, o en qué medida, la terapia con insulina exógena provoca la progresión del cáncer en los pacientes, nadie puede pasar por alto la amenaza potencial de la insulina que ha sido confirmado por
in vivo
estudios en animales [11 ].
en cuanto al cáncer colorrectal, la diabetes ha sido sugerido como un factor clave para su desarrollo [11]. Los estudios epidemiológicos observó una correlación positiva entre la hiperglucemia en ayunas (≥ 6,1 mmol /l) y la incidencia de cáncer colorrectal. A pesar de los avances significativos en el tratamiento quirúrgico y médico, el cáncer colorrectal sigue siendo una enfermedad maligna altamente prevalentes y letales en los países desarrollados. Sobre la base de los puntos de vista anteriores, se sugiere que la orientación del metabolismo de la glucosa en el tratamiento del cáncer colorrectal es prometedor. Aunque, muchas células cancerosas son sensibles y vulnerable a la glucosa privación [24]. Esta estrategia es impracticable en los mamíferos debido a que el proceso de la gluconeogénesis, teniendo lugar principalmente en el hígado, proporcionando una fuente de glucosa a partir de sustratos de carbono no carbohidratos, tales como lactato, glicerol. Por lo tanto, es alcanzable y sostenible para imitar la privación de glucosa
in vivo
través de la inhibición del metabolismo de la glucosa por la aplicación de agentes farmacológicos tales como 2DG. Una vez transportado en las células a través de Gluts, 2DG se fosforila por la hexoquinasa para formar 2DG-6-fosfato que no puede ser metabolizado a través de la glicólisis, sino más bien se acumula y no competitiva inhibe la hexoquinasa y inhibe fosfoglucosa isomerasa [18,25,26]. Por lo tanto, el metabolismo normal de la glucosa es perturbado, lo que conduce a la privación de energía y, finalmente, la muerte celular. Aquí, nos propusimos 2DG como un candidato potencial contra el cáncer colorrectal. Especialmente, cuando se administra insulina exógena o hiperglucemia circulatorio se combina, la eficiencia de 2DG se puede mejorar aún más ya que la insulina puede promover la captación celular de hexosa.
Nuestro
estudio in vitro
a cabo ensayos funcionales de células de cáncer colorrectal tales como la proliferación celular, apoptosis, migración, e invasión. La glucólisis se analizó por las producciones de ATP y lactato. 2DG y la insulina se aplicaron para el tratamiento de estas células ya sea solo o en combinación. Los resultados mostraron que 2DG tenía efectos inhibidores sobre las células del cáncer, mientras que la insulina tenía efectos promotores directos. Cuando se combinó la insulina, los efectos anticancerígenos de 2DG se mejoraron y el promotor del cáncer, efectos de la insulina se invirtieron. La inhibición de la glucólisis de 2DG también fue promovido por la insulina.
Western blot de las proteínas de supervivencia, incluyendo MCL-1 y survivin, se analizó también. El resultado mostró que 2DG inhibió la expresión de ambas proteínas (Fig 4). La survivina es un miembro de la familia inhibidor de la apoptosis (IAP). Es altamente expresada en la mayoría de las células cancerosas humanas. Survivina puede inhibir la activación de la caspasa y suprimir la apoptosis. [27,28]. MCL-1 es un miembro anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Se localiza en las mitocondrias, antagoniza miembros de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos, e inhibe la apoptosis inducida por estímulos citotóxicos. MCL-1 Se ha informado de estar involucrado en la muerte celular inducida por la inhibición del metabolismo de la célula. MCL-1 downregulation desempeña un papel fundamental en la apoptosis inducida por 2DG [7,29].
administración de 2DG en una dosis baja no era bastante eficaz para inducir la muerte celular y la apoptosis. Mientras, la migración y la invasión fueron notablemente reprimida por 2DG, que fue poco probable atribuye a la modesta citotoxicidad de 2DG a esa dosis. Sottnik et al. informó que 2DG era muy eficaz para inhibir el fenotipo metastásico de una gran variedad de tipos de tumores, tanto
in vitro
y
in vivo
, que se asoció con la reorganización del citoesqueleto y la inhibición de la expresión de la catepsina L [ ,,,0],30]. En este estudio, hemos detectado el nivel de expresión de MMP-2. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son una familia de enzimas proteolíticas en zinc y calcio dependientes que están involucrados en la degradación de la matriz extracelular y el fenotipo metastásico de los cánceres. Como miembro clave de MMPs, MMP2 se ha demostrado que es capaz de degradar el colágeno IV, el componente estructural principal de la membrana basal [31-33] análisis de transferencia .Western mostró que la insulina promueve la expresión de la proteína MMP2, que puede, en cierta medida explicar su promoción de la invasión. Por el contrario, 2DG inhibió la expresión de MMP2. La glucólisis fue marcadamente inhibida por 2DG como se demuestra por las producciones restringidas de ATP y lactato. Debido a la depleción de ATP y aumento de la proporción intracelular AMP /ATP, AMPK, un sensor de energía celular clave, se activa. la activación de AMPK intenta recuperar la generación de ATP a través de encender y apagar el catabolismo anabolismo. procesos que consume ATP como la biosíntesis, el crecimiento celular y la proliferación son restringidos [34,35]. la progresión del ciclo celular puede ser detenido en la transición de fase G1-S [36]. resultados glucólisis elevada en la generación de grandes cantidades de lactato que deben ser transportados fuera de las células con el fin de prevenir el envenenamiento por sí mismos. El ácido láctico transporte a través de la membrana plasmática está mediada por una familia de transportadores de protones ligada monocarboxilato (MCT) [37]. El aumento de expresión de MCT4 en las células tumorales se ha informado anteriormente [38]. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento 2DG condujo a la disminución de la producción y la regulación a la baja de MCT4 lactato. Las inhibiciones de producción y extrusión de lactato son aspectos importantes en los efectos contra el cáncer de 2DG desde elevada de lactato durante el metabolismo de la glucosa en general ha demostrado ser beneficioso para las células cancerosas. Por un lado, los resultados de exportación de lactato en la acidificación del microambiente que facilita la angiogénesis tumoral y proporciona una condición favorable para la activación de las catepsinas y metaloproteinasas que conduce a degradación de la matriz extracelular y la metástasis de células tumorales [38,39]. Por otro lado, la acidificación extracelular contribuye indirectamente la resistencia de las células cancerosas a la radiación y algunos fármacos citotóxicos, tales como doxorrubicina [40]. Además, el lactato es capaz de inhibir la diferenciación de monocitos a células dendríticas y la inactivación de la liberación de citoquinas, contribuyendo así a escape inmune de las células del cáncer [40]. El lactato también puede favorecer el crecimiento de células tumorales aeróbico adyacente, ya que puede ser consumido para tomar el lugar de la glucosa para la fosforilación oxidativa [38]
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Sobre la base de muchas investigaciones recientes, la toxicidad después del tratamiento 2DG podría explicarse por más de un mecanismo según el perfil metabólico de un tipo de célula cancerosa específica. Imitando la privación de glucosa, 2DG es capaz de inducir la autofagia [41-43]. La conversión de LC3-I a LC3-II es un proceso representativo para el flujo de la autofagia [19]. Una expresión significativamente upregulated de proteína LC3 II se detectó en 2DG tratada células de cáncer colorrectal. Además LC3, p62 es otro fabricante de la autofagia. p62 es una proteína de unión a ubiquitina y es necesario para la formación de agregados de la proteína ubiquitina. p62can incorporarse selectivamente en autofagosoma mediante la unión a LC3, llevando a los agregados de proteína a la degradación. degradación lisosomal de autofagosomas conduce a la disminución de la p62 [19,44]. Western blot mostró niveles de p62 se redujo después de la administración de 2DG. Aunque la autofagia se conoce comúnmente como un mecanismo de supervivencia celular bajo estrés, una vez ampliamente se activa, la autoconservación puede convertirse en una destrucción masiva [45]. A pesar de la inhibición de la glicólisis y la inducción de la autofagia, 2DG puede causar la alteración de la glicosilación ligada a N y la intensificación del estrés oxidativo [25,26,46].
Teniendo en cuenta los efectos secundarios de 2DG, otros altamente glucosa a pesar de tejidos dependientes de las células cancerosas, tales como el cerebro, el corazón, la retina y los testículos, son todas las posibles víctimas [38]. Ensayos clínicos previos han confirmado que la administración de 2DG en general era segura y bien tolerada por los pacientes. Curiosamente, aunque la administración intravenosa de 2DG podría causar hiperglucemia, los efectos secundarios observados fueron bastante similares a los de la hipoglucemia [47-49]
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En cuanto a la asociación entre la CRC y la diabetes, meformin También se ha encontrado para ser una potencial de las drogas contra el cáncer colorrectal a través de la regulación de la AMPK y mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) para señalización vía [50]. Similar a 2DG, meformin puede inhibir la generación de energía de célula de cáncer y afectar el metabolismo celular. La combinación de metformina y 2DG se ha investigado a ser mucho más eficaz en la supresión de las células cancerosas a través de la inducción de la apoptosis. [51,52].
La estrategia de combinar 2DG y la insulina demostraron ser prometedora contra el cáncer colorrectal y podrían ser útiles en el tratamiento de otros tumores malignos. 0.05.