Extracto
esteroides cardiotónicos se utilizan para tratar la insuficiencia cardíaca y arritmia y tienen efectos anticancerígenos prometedores. La ouabaína esteroide cardiotónico prototípico también puede ser una hormona que modula la adhesión celular epitelial. esteroides cardiotónicos consisten en un núcleo esteroide y un anillo de lactona, y sus efectos biológicos dependen de la unión a su receptor, Na, K-ATPasa, a través del cual, inhiben Na
+ y K
+ de transporte de iones y activan de varias vías de señalización intracelular. En este estudio, hemos añadido un grupo de estireno al anillo de lactona de la digoxina esteroide cardiotónico, para obtener la digoxina 21-bencilideno (21-BD), y se investigaron los efectos de este esteroide cardiotónico sintético en diferentes modelos celulares. El modelado molecular indica que 21-BD une a su objetivo Na, K-ATPasa con baja afinidad, la adopción de una conformación farmacofórico diferente cuando se une a su receptor de la digoxina. En consecuencia, 21-DB, en cantidades relativamente altas mu M inhibe la actividad de Na, K-ATPasa alfa
1, pero no a
2 y alfa
3 isoformas. Además, el 21-BD se dirige a otras proteínas fuera de la Na, K-ATPasa, inhibiendo el exportador a múltiples fármacos Pdr5p. Cuando se utiliza en células enteras a bajas concentraciones m, 21-BD produce varios efectos, incluyendo: 1),) de células sobre regulación de Na, la expresión K-ATPasa y la actividad en las células cancerosas HeLa y RKO, que no se encuentra para la digoxina 2 cambios específicos en la viabilidad celular, la reducción en células cancerosas HeLa y RKO, pero cada vez en células MDCK epiteliales normales, lo que es diferente de la respuesta a la digoxina, y 3) cambios en la interacción célula-célula, alteración de la composición molecular de las uniones estrechas y la elevación de la resistencia eléctrica transepitelial de monocapas de MDCK, un efecto encontró previamente para ouabaína. Estos resultados indican que la modificación del anillo de lactona de la digoxina proporciona nuevas propiedades al compuesto, y muestra que el cambio estructural introducido podría utilizarse para el diseño de esteroide cardiotónico con nuevas funciones
Visto:. Rocha SC, Pessoa MTC, Neves LDR, Alves SLG, Silva LM, Santos HL, et al. (2014) 21-bencilideno Digoxina: Un proapoptótico cardenolide de células cancerosas que hasta regula Na, K-ATPasa y epiteliales uniones estrechas. PLoS ONE 9 (10): e108776. doi: 10.1371 /journal.pone.0108776
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 7, 2014; Aceptado: August 25, 2014; Publicado: 7 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Rocha et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por FAPEMIG (Fundación de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais) APQ-01114-12, 02596-12-APQ , CNPq (Tecnológico Consejo Nacional de Desarrollo Científico e) 472394 /2012-6 y los NIH DK081431. Los autores agradecen el apoyo financiero y estructural que ofrece la Universidad de San Pablo a través del NAP-CatSinQ (Core Investigación en Catálisis y Síntesis Química). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
esteroides cardiotónicos son sustancias comunes en el reino de las plantas que confieren una ventaja competitiva frente a la depredación, ya sea para la planta que los sintetiza, o para los animales que los acumula en la dieta [1]. Cierta evidencia experimental muestra que los animales pueden sintetizar endógenamente esteroides cardíacos y que estas sustancias tienen un papel importante en la regulación de la presión arterial, la proliferación celular y la muerte celular [2], [3]. La estructura básica de los esteroides cardiotónicos se compone de una cadena principal de esteroide con un cis /configuración trans /cis y un resto de lactona en la posición 17β, también conocido como la aglicona. Además, estos compuestos tienen a menudo un azúcar unido en la posición 3β del núcleo esteroideo, para los que se conocen comúnmente como glucósidos cardíacos. La naturaleza del anillo de lactona que distingue a los cardenólidos, que tienen un anillo insaturado butirolactona, a partir de los bufadienolides, que presentan un anillo de α-pirona. La única diferencia estructural entre los dos cardenolides principales que se utilizan terapéuticamente, digoxina y digitoxina, es un solo grupo adicional hidroxilo (-OH) en la digoxina, lo que altera considerablemente su farmacocinética. Digitoxina, es más lipófilo, muestra una fuerte unión a las proteínas plasmáticas, se metaboliza casi completamente en el hígado y muestra una muy larga vida media. Por el contrario, digoxina muestra la unión a proteínas plasmáticas débiles, no se metaboliza ampliamente y se excreta en forma inalterada principalmente por los riñones [2], [3].
El principal efecto farmacológico de dosis terapéuticas de digoxina y digitoxina es su efecto inotrópico positivo. Esto es mediado a través de la inhibición de la célula miocárdica Na, K-ATPasa, que se traduce en un aumento en los niveles citosólicos de Na
+ y secundariamente Ca
2 +, debido a la reducción en el transporte de la Na
+ dependiente de Na
+ /Ca
2 + intercambiador. El aumento de Ca
2 + en el citosol de la célula miocárdica conduce a más de llenado del retículo sarcoplásmico con Ca
2 +, que serán fácilmente disponible para su liberación a la estimulación para producir una mayor contracción muscular [3] - [5 ]
en el contexto de la biología celular, hay dos áreas en las que los esteroides cardíacos son de interés potencial:. la adhesión celular y el cáncer. Tanto estos fenómenos están estrechamente relacionados, tal como se muestra por la pérdida de la adhesión celular que tiene lugar durante la proliferación del cáncer y la metástasis. El efecto de los esteroides cardíacas en la adhesión celular no se conoce bien y es el foco de intensa investigación [6] - [8]. Desde la década de 1960, varios efectos antitumorales interesantes se han observado para la digital [9], [10], así como para otros cardenolides [11] - [15] y los glucósidos cardiacos relacionados, los bufadienolides [16] - [19].
cáncer humano afecta predominantemente a los epitelios [20], que son células altamente polarizada y ligados entre sí a través de complejos de unión, incluyendo uniones estrechas (TJS). Esta última estructura confiere epitelios su capacidad de funcionar como barreras eficaces en la separación de los compartimentos biológicos [21]. La pérdida de TJs está implicado en la progresión del cáncer y la metástasis [6], [22], por ejemplo, una disminución en la expresión de la proteína claudin apretado unión (CLDN) -7, está implicada en la diseminación de células de cáncer de mama [23] . Además, la importancia de Na, K-ATPasa para la formación de complejos de unión ha sido bien establecida [24], [25], como es el requisito de los contactos célula-célula para la expresión polarizada de la Na, K-ATPasa en lateral membrana plasmática de las células epiteliales [26]. Curiosamente, la β
1 subunidad de Na, K-ATPasa sí mismo funciona como una molécula de adhesión celular en astrocitos [27] y los epitelios [28] - [31]
Una disminución en la expresión de superficie celular de. la β
1 subunidad se ha asociado con epitelio-mesenquimal transición, un proceso implicado en la invasividad tumoral y la metástasis [25], [32]. El tratamiento con varios tipos de esteroides cardíacos causa varios efectos en uniones celulares. Las altas concentraciones de ouabaína (≥300 nM) y otros esteroides cardíacos interrumpen apretados, adherentes y las uniones comunicantes, así como desmosomas de células epiteliales [24], [33], [34]. Por el contrario, concentraciones bajas de ouabaína (10 nM) aumentan el sellado de TJs [35], acelerar la polaridad celular (como se determina por el desarrollo de los cilios primarios [36]) y aumentar la comunicación celular a través de uniones comunicantes [30].
Aunque los estudios sobre los efectos biológicos de los esteroides cardíacos disponibles en las células tumorales se están desarrollando rápidamente, esto no es el caso de los esteroides cardiotónicos recién sintetizadas. Algunos esteroides cardiotónicos sintéticos han sido probados por su actividad contra el cáncer [17], [37] - [44]. Oleandrina y 9-hidroxi-2 "oxovoruscharin, un cardenolide hemi-sintético, está bajo ensayos clínicos y ha demostrado actividad contra el cáncer tanto
en
in vitro
y
en
vivo, en culturas multirresistencia células del cáncer [15], [43], [44]. Otros estudios demostraron que varias modificaciones del resto de azúcar de digoxina y digitoxina, pueden aumentar el efecto contra el cáncer de estos compuestos [45] - [48].
Varios autores han descrito la síntesis de derivados de digoxina en el que la adición de los grupos de estireno a la fracción de anillo de lactona producido alguna actividad biológica interesante [49], [50]. Sin embargo, existe todavía hay informes relativos a la actividad contra el cáncer o los efectos de estos derivados de digoxina en actividad de la Na, K-ATPasa.
El objetivo de este trabajo fue estudiar los efectos biológicos de la digoxina 21-bencilideno (21 -BD), un derivado de digoxina con un grupo estireno adicional en el carbono C21 del anillo de lactona, en el cáncer y las células normales.
Materiales y Métodos
procedimiento general para la síntesis de 21- bencilideno digoxina
benzaldehído (0,18 ml, 1,8 mmol), digoxina (0,469 g, 0,6 mmol), K anhidro
se añadieron 2CO
3 (0,249 g, 1,8 mmol) y 60 ml de metanol en un matraz de fondo redondo. Después de agitar durante 6 horas a 70 ° C, el disolvente se evaporó en un evaporador rotatorio. El producto en bruto se diluyó con 20 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo caliente (3 x 30 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre anhidro Na
2SO
4 y se concentró a vacío. Después, el producto bruto se purificó por cromatografía en columna de sílice (CH
2Cl
2 /MeOH 11:01). Después de la purificación, el producto puro se diluyó en tetrahidrofurano (THF), se precipitó con hexano y se concentró a presión reducida para dar 21-BD (0,325 g, 0,37 mmol, 62%) como un.
cultura blanca de la célula sólida
HeLa (carcinoma del cuello uterino humano; ATCC CCL2) y RKO-AS45-1 (carcinoma de colon; ATCC CRL-2579), las células se cultivaron en RPMI /o-10 F (01:01) medio HAM DMEM (Sigma , St. Louis, MO, EE.UU.). CHO-K1 (ATCC CCL61) y MDCK-II (células renales caninas; ATCC CCL-34) fueron cultivadas en DMEM. Todos los medios se complementaron con 10% de suero fetal bovino (FBS; Hyclone) (CDMEM), 60 mg /ml de estreptomicina y 100 mg /ml de penicilina. Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 células /cm
2 y se incubaron en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. El medio de cultivo se cambió cada 48 horas para evitar el agotamiento de los nutrientes.
cultivo de células de insectos e infecciones virales
Sf-9 células de insectos se cultivaron en medio de Grace con 3,3 g /l de hidrolizado de lactoalbúmina, 3,3 g /l yeastolate, y suplementado con 10% de suero (v /v) fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 0,25 mg /ml de Fungizone. Las células se cultivaron en cultivos en suspensión y se transfirieron a placas de cultivo de tejidos de 150 mm antes de la infección. Se realizaron infecciones como se describe anteriormente [51]. Después de 72 h a 27 ° C, las células se rasparon de las placas de cultivo, se centrifugaron a 1500 ×
g
durante 10 min y se suspendieron en 10 mM de hidrocloruro de imidazol (pH 7,5) y EGTA 1 mM. Las células se homogeneizaron en hielo usando un homogeneizador Potter-Elvehjem y el lisado se centrifugó durante 10 min a 1.000 ×
g
. Se eliminó el sobrenadante, se centrifugó durante 10 min adicionales a 12.000 ×
g
, y el sedimento final se suspendió en sacarosa 250 mM, EGTA 0,1 mM, y 25 mM imidazol HCl, pH 7,4.
ensayo de citotoxicidad
efecto Compuesto citotoxicidad se evaluó utilizando el MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) sal de tetrazolio método colorimétrico (Sigma, St. Louis , MO, EE.UU.). Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (1 x 10
5 células /pocillo) y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C hasta la confluencia. A continuación, los pocillos se lavaron con medio de cultivo y la digoxina o 21-BD se añadió a diferentes concentraciones (0,05 a 500 mM). Después de la incubación durante 24 o 48 h, las placas se trataron con MTT. Las lecturas se realizaron en un lector de microplacas Spectramax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) a 550 nm. La citotoxicidad se anotó como el porcentaje de reducción de la absorbancia, en relación con los cultivos de control no tratados [52]. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Los resultados se expresaron como la media de LC
50 (la concentración de fármaco que reduce la viabilidad celular en un 50%).
Ensayo de apóptosis
ensayo cometa.
La ensayo de electroforesis en gel de una sola célula (ensayo cometa) se realizó de acuerdo con los protocolos publicados previamente [53], [54]. Para esto, las células CHO-K1 fueron tratados con 20, 35 o 50 digoxina M o 21-DB, que son las concentraciones que no afectan a la viabilidad celular de acuerdo con el ensayo MTT. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos. Las siguientes células día se lavaron dos veces con PBS, y se incubaron 3 h con los compuestos correspondientes en los medios de cultivo sin suero. Los grupos de control negativo y positivo se trataron con PBS, y metanosulfonato de metilo (400 mM), respectivamente. Después de 24 h, las células se lavaron dos veces con PBS y se separan usando una solución de tripsina-EDTA. La tripsina se inactivó con 3,0 ml de medio completo, seguido por centrifugación (5 min, 150 ×
g
). Después, el sedimento se resuspendió en 500 l de PBS, y 30 ml de alícuotas de las suspensiones celulares se mezclaron con 70 l de agarosa de bajo punto de fusión (0,5%). Estas mezclas se colocaron en portaobjetos pre-revestidas con agarosa de punto de fusión normal (1,5%) y cubiertos con cubreobjetos. Los cubreobjetos se retiraron después de cinco minutos, y los portaobjetos se sumergieron durante la noche en solución de lisis (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 10; Triton X-100 1% y DMSO 10%). A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS y se mantuvieron durante 40 min en una caja de electroforesis horizontal lleno de tampón alcalino frío (EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH & gt; 13). La electroforesis se llevó a cabo a 0,86 V /cm y 300 mA (20 minutos) y los portaobjetos se neutraliza posteriormente (0,4 M de Tris, pH 7,5), se fijaron con metanol y se tiñeron con bromuro de etidio. análisis visuales se realizaron bajo de fluorescencia [55], [56].
fosfatidilserina translocación.
Las células HeLa se sembraron en placas de Petri de diámetro de 60 mm a la confluencia y se incubaron durante la noche en CDMEM. Se trataron luego con 2 digoxina M o 50 M 21-BD en CDMEM de 6, 12 o 24 h. Después de la incubación, las células en suspensión fueron recuperados de los medios de comunicación por centrifugación a 150 ×
g
, 20 ° C durante 5 minutos. células unidas se obtuvieron mediante un tratamiento suave de la proteasa 1 ml Accutase más 3 ml de PBS), se centrifugaron como se ha indicado anteriormente y se añadió a las células obtenidas de los medios de comunicación. Anexina-V unida a la cara externa de la membrana plasmática se midió con un kit comercial (kit de Anexina-V-Fluos Stainig, Roche, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, la suspensión celular se incubó con una mezcla de Anexina-F-FITC y yoduro de propidio en tampón de solución salina durante 15 min. La suspensión celular se analizó mediante citometría de flujo (FACSCalibur citómetro de flujo, el software Fow Jo).
resistencia eléctrica transepitelial (TER)
células MDCK se cultivaron en Transwell soportes permeables (3415, Corning Inc., NY, EE.UU.) la resistencia eléctrica transepitelial se midió con un Evom y el sistema EndOhm-6 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE.UU.). Los valores finales se obtuvieron restando la resistencia de la solución de baño y el inserto de vacío. Los resultados se expresan en ohmios · cm
2 (Ω · cm
2) como un porcentaje del control.
inmunofluorescencia
Después de las mediciones TER, monocapas de MDCK se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo /Ca
2 +, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 30 min a 4 ° C, se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 durante 5 min, se bloquearon durante 30 minutos con 3% de BSA y se trató para 1 hora a 37 ° C con un anticuerpo primario específico. Las monocapas se aclararon 3 veces con PBS /Ca
2 +, se incubaron con un apropiados anticuerpos FITC o distrito marcado para 30 min a temperatura ambiente y se lavaron como se indicó anteriormente. Los filtros con las células se escindieron con un escalpelo y se montaron en Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA, EE.UU.). Las preparaciones se examinaron con un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las imágenes capturadas se importaron en FIJI, versión 2.8 (Institutos Nacionales de Salud, Baltimore, EE.UU.), para obtener el máximo proyecciones y en el programa de manipulación de imágenes de GNU (GIMP) para normalizar el brillo y el contraste en todas las imágenes y construir figuras.
inmunotransferencia
se realizó un análisis de Western blot de extractos de proteínas de células enteras como se describe anteriormente [57]. Brevemente, las células MDCK y HeLa se lavaron con PBS y se solubilizaron con el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) buffer [mM piperazin
N
,
bis (ácido 2-etanosulfónico) 10 N ', pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido 2 mM etilendiaminotetraacético (EDTA), 1% de Triton X-100, 0,5% deoxicholate de sodio, y 10% de glicerol], que contiene inhibidores de la proteasa (Complete Mini; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). El contenido de proteína del lisado celular se midió (reactivo de ensayo de proteína BCA; Pierce Chemical, Rockford, IL) y se preparó para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) por ebullición en tampón de muestra. Las proteínas resueltas se electrotransfered a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Hybond-P; GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). Las proteínas de interés se detectan a continuación con el policlonal específico o anticuerpos monoclonales indicados en cada caso, seguido de anticuerpos en especies apropiadas y conjugado con peroxidasa (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) y la detección de quimioluminiscencia (ECL plus; GE Healthcare).
Detección de Na, K-ATPasa y la expresión a través de la claudina-cuantitativa en tiempo real RT-PCR
En tiempo real RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR), el ARN total fue extraído de la célula muestras usando TRIzol (Life Technologies, EE.UU.). La concentración se estimó mediante espectrofotometría con una Nanodrop ND2000 (Thermo Scientific, EE.UU.). Todas las reacciones de la transcriptasa inversa se realizaron con 5 g de ARN con el kit Superíndice III (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras de ARN fueron transcritas inversa simultáneamente para reducir al mínimo la variación inter ensayo asociado con la reacción de transcripción inversa. PCR en tiempo real cuantitativa se realizó en una secuencia rápida sistema de detección ABI Prism 7500 (Applied Biosystems) utilizando Go Taq qPCR mezcla maestra (Promega, EE.UU.). Los siguientes cebadores y las concentraciones fueron empleados (Murphy et al, 2004): Na, K-ATPasa α
1 subunidad (número de acceso GenBank NM_000701): Fw (300 nM): 5'-3-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG, Rv (300 nM ): 5'-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3 '; Na, K-ATPasa β
1 subunidad (número de acceso GenBank NM_001677): Fw (300 nM): 5'-ACC AAT CTT ACC ATG GAC ACT GAA-3 ', Rv (300 nM): 5'-CGG TCT TTC TCA CTG TAC CCA AT-3 '; CLDN-2 Fw GGTGGGCATGAGATGCACT, Rv CACCACCGCCAGTCTGTCTT; CLDN-4 Fw TGCACCAACTGCGTGGAGGATGAG, Rv ACCACCAGCGGGTTGTAGAAGTCC. Las condiciones de PCR aplicados fueron las siguientes: 50 ° C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 1 min. Cada uno de estos conjuntos de cebadores generaron un producto único PCR, según lo confirmado por las curvas de fusión obtenidas. Los ensayos de PCR se realizaron por triplicado, y se combinaron los datos. medición cuantitativa relativa de los niveles de genes diana se realizó mediante el método de ΔΔCt Livak et al. [58]. Como genes de control endógeno de limpieza, se empleó la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, número de acceso GenBank NM_002046) y ribosomal 18S subunidad genes (GenBank número de acceso NR_003286) [59]. Se utilizaron los siguientes cebadores y concentraciones: GAPDH Fw (300 nM): 5'-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3 ', GAPDH Rv (300 nM): 5'-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3', 18S Fw (300 nM): 5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA- 3 ', 18S Rv (300 nM): 5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'.
análisis de modelado molecular
Inicialmente, la digoxina, la ouabaína, y el 21-BD (Figura 1A) y se generaron refinado a través del método semi-empírico PM6 [60] implementado en el software Gaussian 09 W [61]. La estructura cristalográfica de Na, K-ATPasa (proteína diana) complejado con ouabaína se obtuvo de la Protein Data Bank (PDB ID: 4HYT [62] con una resolución de 3,40 Å, mediante el α
1 subunidad de Na, K- ATPasa). El ion de magnesio y tres moléculas de agua intersticiales se mantuvieron en el sitio de unión. A continuación, una rígida re-muelle de ouabaína se llevó a cabo para validar nuestro sistema. Posteriormente, digoxina y 21-BD se acoplan contra la ATPasa. Los análisis se realizaron utilizando conexión para AutoDock Viña 1.0.2 [63]. El algoritmo de búsqueda aplicada se repitan ciertos local de Búsqueda global Optimizer para la optimización global. En este proceso, una sucesión de pasos con la mutación y la optimización local (el método de Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno [BFGS]) se llevó a cabo, y cada paso siguió el criterio Metropolis [64]. En este estudio, una celda de la malla se construyó explorar todos los sitios activos, que se definió como un cubo con el centro geométrico de la ouabaína, con unas dimensiones de 20 x 20 x 24 A, puntos espaciados de 1 A y X, Y y Z del -27.065, 20.469 y -69.469, respectivamente. Todas las cifras de modelado molecular se construyeron utilizando DS Visualizer 3.1 [65].
Estructura química
(A) de la ouabaína, digoxina, y el 21-BD. (B) A la izquierda: la estructura entera de Na, K-ATPasa (PDB: 4HYT) mostró en la representación de la cinta sólida, donde los hélice alfa, beta-hojas y las vueltas están en rojo, azul y gris, respectivamente; derecha: punto culminante del sitio de unión con ouabaína se muestra en la representación tubo. líneas rojas discontinuas indican los enlaces de hidrógeno. Solamente átomos de hidrógeno polares se mostraron para una mejor visualización. conformación farmacofóricos de, (C) y digoxina (D) 21-BD; las interacciones polares y no polares se representan por magenta y colores verdes, respectivamente. Las líneas discontinuas indican enlaces de hidrógeno. interacciones de residuos están codificados por colores como se indica en la escala insertado.
Preparación de membranas plasmáticas Pdr5p
Se prepararon membranas plasmáticas que contienen la proteína sobreexpresada Pdr5p de la
Saccharomyces cerevisiae
mutante AD124567 cepa como se informó anteriormente [66].
El fraccionamiento de los lisados de células y preparación de fracciones de membrana
Un total de 2,5 × 10
5 células fueron cultivadas en 75 cm
2 frascos de cultivo y tratado con digoxina y 21-BD. Después de 48 horas de tratamiento, las células se lavaron tres veces con PBS frío y desechados de la botella de cultivo con un policía de goma en un tampón de preparación de membrana (6 mM Tris [pH 6,8], imidazol 20 mM, 0,25 M de sacarosa, 0,01% de SDS, EDTA 3 mM y PMSF 2 mM). Las células se homogeneizaron en un homogeneizador Potter-Elvehjem, usando diez Stokes en hielo. A continuación, se sometieron a ultrasonidos en un disruptor de células por ultrasonidos en hielo durante 10 s a una potencia del 45%. La muestra se sometió a centrifugación a 20.000 xg durante 90 min a 4 ° C. El sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspendió en 250 l de tampón de preparación de membrana. Por último, esta muestra se sometió a ultrasonidos durante 10 s a una potencia del 25% hasta homogeneización completa.
Preparación de Na, K-ATPasa de hemisferios cerebrales de ratas
hemisferios cerebrales de ratas Wistar macho adultas se recogieron rápidamente después anestesia éter dietílico y decapitación. Los protocolos utilizados para el uso de las ratas fueron aprobados por la Comisión Institucional de Ética en el uso de animales, DFBCICB011 código de proceso y se ajustaban a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicado por el Instituto Nacional de Salud (NIH publicación n . 85-23, revisada en 1996). Los tejidos del cerebro, que se utiliza como fuente de ouabaína sensible (α
2 /α
3) Na, isoformas K-ATPasa, se homogeneizaron en 250 mM tamponada con sacarosa, ditiotreitol 2 mM, PMSF 0,1 mM y 5 mM Tris /HCl (pH 7,4) con un homogeneizador de teflón Potter-Elvehjem accionado por motor. Posteriormente, se realizó tratamiento caotrópico con 2 M KI durante 1 h bajo agitación constante, seguido de centrifugación tres veces en 100.000 ×
g
de 1 h. El sedimento final se resuspendió en sacarosa 250 mM, desoxicolato de sodio 0,1% y maleato 20 mM /Tris (pH 7,4), después se almacenó durante la noche a -20 ° C y se somete a centrifugación diferencial después de la descongelación [67]. Los sedimentos se resuspendieron en el mismo tampón sin PMSF y se almacenaron en N líquido
2.
preparación Na, K-ATPasa de riñón de ratón
tejido renal se aisló de ratones adultos y fue homogeneizaron en sacarosa 250 mM, EGTA 0,1 mM, e imidazol 25 mM HCl, pH 7,4, utilizando un motor de teflón Potter
-
Elvehjem homogeneizador. La muestra se sometió a centrifugación a 4.500 ×
g
de 10 min. El sobrenadante resultante se centrifugó a 70.000 ×
g
durante 1 h. El sedimento final se volvió a suspender en la solución de homogenización y se utiliza para ensayos de actividad de Na, K-ATPasa. Todos los protocolos experimentales con ratones fueron aprobados por la Universidad de Kansas Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
NTPase Ensayos
Las actividades enzimáticas se analizaron utilizando ATP como sustrato en un medio estándar (50 l volumen final) que contiene 100 mM Tris-HCl pH 7,5, MgCl 4 mM
2, mM KNO 75
3, NaN 7,5 mM de molibdato de amonio
3, y 0,3 mM en presencia de ATP 3 mM. La reacción se inició por la adición de 13 g /ml de las preparaciones de membrana de plasma, después se mantuvo a 37 ° C durante 60 min y se detuvo por la adición de 1% de SDS, como se describe anteriormente [68]. El fosfato inorgánico liberado (Pi) se midió como se describe en otra parte [69]. El uso de soluciones madre en DMSO, 21-BD y digoxina se añadieron hasta un 5% v /v de concentración final. La diferencia en la actividad ATPasa en la presencia o ausencia de 3 M oligomicina correspondía a una actividad de la ATPasa mediada por Pdr5p.
Medición del efecto de la 21-BD en Na, K-ATPasa actividad
las preparaciones del hemisferio del cerebro se incubaron a 37 ° C durante 2 h en medio que contiene NaCl mM 87,6, KCl 3 mM, MgCl 3 mM
2, ATPNa 3 mM
2, mM EGTA 1, azida de sodio 10 mM y 20 ácido maleico mM /Tris (pH 7,4), y las preparaciones de membrana de células se incubaron a 37 ° C durante 1 h en NaCl 120 mM, KCl 20 mM, MgCl 2 mM
2, ATPNa 3 mM
2 y 50 HEPES mM, (pH 7,5), tanto en la ausencia y presencia de 1 mM concentraciones crecientes de 21-BD y digoxina ouabaína o. Na, K-ATPasa actividad se determinó midiendo el Pi liberado de acuerdo con un método colorimétrico descrito anteriormente [69], y la actividad específica se consideró como la diferencia entre las actividades totales y ouabaína resistente ATPasa [70].
ouabaına unión
Las células HeLa se cultivaron en placas de 24 pocillos a múltiples confluencia y cultivadas durante la noche. Las monocapas fueron entonces rápidamente se lavaron tres veces con tampón de potasio libre de solución salina (NaCl 140 mM, CaCl 1,8 mM
2, sacarosa 5 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 a temperatura ambiente) y se incubaron 30 min con una solución de unión total (0,1 x 10
-6
3 H-ouabaína más 0,9 × 10
-6 ouabaına frío en tampón de solución salina libre de potasio) con agitación suave ya temperatura ambiente. A continuación, las monocapas se lavaron cuatro veces, 1 min cada uno, con hielo frío 0,1 M MgCl
2 y se disolvieron con 400 l de SDS 1%.
actividad 3H se midió en muestras de 350 l por recuento de centelleo. Total
3H-ouabaína unión fue competido por adición a la solución de unión total la cantidad necesaria de 21-BD para llegar a las concentraciones indicadas en los resultados. Un subconjunto de las monocapas se expuso a una solución vinculante competido (solución de unión total, más de 0,5 × 10
-4 M ouabaına frío) para medir la unión no específica y restar a los valores de unión total.
Los análisis estadísticos
los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism, versión 5. los resultados se expresaron como media ± error estándar de la media. La significación estadística en un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido por prueba de comparación pares seleccionados de un Bonferroni, se fijó en
P
& lt; 0,05 (*),
P
& lt; 0,01 (**), o
P
. & lt; 0,001 (***) frente a la condición de control, y "n" representa el número de experimentos independientes
resultados
Hemos sintetizado 21-BD a través de una sencilla reacción aldólica viníloga estereoselectiva, según Xu et al. [50], y se caracterizó el producto final a través de RMN, HRMS convencionales y análisis de IR (Figura 1A; Figura S1 y S1) de datos.
Para realizar el modelado molecular analiza empezamos con la optimización geométrica de ligandos, a través un enfoque semi-empírica, para corregir los parámetros geométricos tales como longitudes de enlace y perfeccionar la estructura. La estructura de re-dock obtenido con el software Autodock Vina, muestra que el refinado y la proporción ligando cristalográfica la misma conformación en el sitio activo, con un valor eficaz desviación del cuadrado de 2,24 Å para la mejor solución, lo que indica la exactitud de la metodología utilizada (véase la Figura S2A). La Figura 1B muestra una simulación del acoplamiento de ouabaína a su sitio de unión en los α Na, K-ATPasa
1 isoforma. Como se muestra, la enzima conserva los elementos secundarios estructurales de la familia de la ATPasa (Figura 1B, izquierda) y que el sitio activo se compone de Gln111, Glu117, Pro118, Asn122, Leu125, Glu312, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Phe783, Phe786, Leu793, Ile800, Arg880 (Figura 1B, derecha), de acuerdo con las estructuras conocidas [71].
a raíz de estos modelos moleculares nos atracado analiza ouabaína, digoxina y 21-BD de Na, K-ATPasa ( Figura S2B y la figura 1C y D). Las simulaciones dieron lugar a las energías de unión de ouabaína, digoxina, y el 21-BD de -9.8, -1.9 y -10.0 kcal /mol, respectivamente. Estos datos sugieren que 21-BD puede tener una afinidad de unión similar a la Na, K-ATPasa de ouabaína y digoxina. Sin embargo, estos dos últimos compuestos presentan diferentes conformaciones farmacofóricos en el sitio de unión, principalmente a nivel del anillo de lactona. Las figuras 1C y D ponen de relieve las más importantes las interacciones intermoleculares entre los ligandos y la proteína diana. La digoxina se une a la enzima a través de enlaces de hidrógeno con Thr797, Asp884 y Lys905 aminoácidos. La electrostática y de interacción hidrófoba se producen con Glu117, Asn120, Asp121, Asn122, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Arg880, Asp884, Tyr901, Glu908 y Gln111, Leu125, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, Arg886, Phe909, Arg972, respectivamente (Figura 1C). En contraste con glucósidos cardíacos naturales, complejos de 21-BD a la Na, K-ATPasa través Gln111, Glu312, Thr797 y enlaces de hidrógeno. Además, el anillo aromático alcanza un bolsillo hidrofóbico formado principalmente por Cys104, Val322, Ala323, Glu327, Ile800 (Figura 1D). Por otra parte, la conformación farmacofórico es completamente diferente de la de los glicósidos naturales, cuyo resto aromático se une a las moléculas de agua y de iones de magnesio.
Para determinar directamente la unión de 21-BD al sitio de la ouabaína Na, K- ATPasa, hemos probado primero si el esteroide sintético podría competir con
3H-ouabaína de unión en células HeLa, que expresan la α
1 isoforma de la Na, K-ATPasa [72]. Como se muestra en la Fig.