Extracto
Antecedentes
El retinoide 4-oxo-N- (4-hidroxifenil) retinamida (4-oxo-4-HPR) es un metabolito polar de fenretinida (4-HPR ) muy eficaz para matar las células de cáncer de diferentes histotypes, capaces de inhibir el crecimiento celular 4-HPR-resistente y de actuar de forma sinérgica en combinación con el fármaco original. A diferencia de 4-HPR y otros retinoides, 4-oxo-4-HPR inhibe la polimerización de tubulina, lo que lleva a la formación del huso multipolar y detención de la mitosis. Aquí se investigó si 4-oxo-4-HPR, como 4-HPR, desencadena la muerte celular también a través de especies reactivas de oxígeno generación (ROS) y si su actividad antimicrotubular estaba relacionado con un mecanismo de ROS-dependiente en ovario (A2780), mama ( T47D), cuello uterino (HeLa) y el neuroblastoma (SK-N-BE) líneas celulares de cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
Nos proporcionaron pruebas de que 4-oxo-4-HPR, además de actuar como un agente antimicrotubular, la apoptosis inducida a través de una cascada de señalización a partir de la generación de ROS y participa en la respuesta de estrés retículo endoplasmático (ER), la activación de Jun N-terminal quinasa (JNK), y la regulación positiva de la proteína morfogenética ósea placentaria proapoptótico (PLAB). A través del análisis del curso del tiempo y la inhibición de la vía de señalización relacionados con ROS (aguas arriba por la vitamina C y aguas abajo por el silenciamiento de PLAB), hemos demostrado que la actividad antimitótica de 4-oxo-4-HPR era independiente del estrés oxidativo inducido por el retinoide . De hecho, la generación de ROS se produjo antes de lo detención mitótica (dentro de 30 minutos y 2 horas, respectivamente) y la supresión de la vía de señalización relacionados con el ROS no impedir la detención mitótica inducida por 4-oxo-4-HPR.
Conclusiones /Importancia
Estos datos indican que 4-oxo-4-HPR actividad contra el cáncer se debe a al menos dos mecanismos independientes y proporcionan una explicación de la capacidad de 4-oxo-4-HPR ser más potente que el fármaco original y para ser eficaz también en líneas celulares de 4-HPR-resistentes. Además, el doble mecanismo de acción podría permitir la 4-oxo-4-HPR para orientar de manera eficiente tumor y, finalmente, para contrarrestar el desarrollo de resistencia a los medicamentos
Visto:. Tiberio P, E Cavadini, Abolafio G, F Formelli , Appierto V (2010) 4-oxo-N- (4-hidroxifenil) retinamida: Dos maneras independientes para matar células cancerosas. PLoS ONE 5 (10): e13362. doi: 10.1371 /journal.pone.0013362
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: July 9, 2010; Aceptado: September 20, 2010; Publicado: 14 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Tiberio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por becas de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (http://www.airc.it), Milán, Italia, a través de subvenciones y una beca (P. Tiberio). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los retinoides son una clase de compuestos químicos estructuralmente relacionados con la vitamina a que modulan los procesos celulares fundamentales, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [1]. La fenretinida sintética o retinoides de N- (4-hidroxifenil) retinamida (4-HPR) es un análogo no tóxica de ácido trans-retinoico [2] que ya ha mostrado resultados prometedores en [3] - preneoplásicas [5] y las condiciones neoplásicas [6], [7]. En las células cultivadas, 4-HPR se ha demostrado que induce la inhibición del crecimiento y la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer y diferentes mecanismos de acción se han propuesto, incluyendo la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consiguiente estrés oxidativo [8], [9 ]. Recientemente hemos informado de que en las células de cáncer de ovario, la apoptosis inducida por 4-HPR está mediada por la proapoptótico proteína morfogenética placentaria Bone (PLAB) y que su regulación positiva por 4-HPR se produce a través de la activación de una cascada de señalización a partir de aumento de la generación de ROS , lo que lleva a la inducción de retículo endoplásmico (ER) de respuesta al estrés y la activación de Jun N-terminal quinasa (JNK) [9], [10]. A partir del análisis de muestras de plasma de pacientes 4-tratadas con HPR, hemos identificado un nuevo metabolito polar 4-HPR, 4-oxo-N- (4-hidroxifenil) retinamida (4-oxo-4-HPR) [11], el cual está dotado de propiedades biológicas prometedores [12]. 4-oxo-4-HPR provoca efectos antiproliferativos y apoptóticos en diversas líneas celulares de cáncer de ovario (es decir, líneas, y de células tumorales de mama neuroblastoma) y es de dos a cuatro veces más eficaz que el 4-HPR en la inhibición del crecimiento celular [12]. Curiosamente, 4-oxo-4-HPR también es eficaz en las células 4-HPR-resistentes y, en combinación con 4-HPR, tiene un efecto sinérgico [12]. De manera similar a 4-HPR, los efectos inhibidores del crecimiento de tumores de 4-oxo-4-HPR son independientes de los receptores de retinoides nucleares (RARs). Además, 4-HPR y 4-oxo-4-HPR comparten varios productos intermedios de señalización, tales como la generación de ROS, aumento de los niveles de ceramida intracelular, y la activación de la caspasa-3 y caspasa-9 [12]. Despites de estas similitudes, 4-oxo-4-HPR parece tener mecanismos adicionales de acción en comparación con el fármaco original, también sugerido por su capacidad para ser eficaz en la 4-HPR células resistentes [12]. De hecho, a diferencia de 4-HPR, 4-oxo-4-HPR causa una marcada acumulación de células en fase mitótica, específicamente en pre-anafase, junto con la activación del eje de control [13]. El 4-oxo-4-HPR-indujo la detención en mitosis se asocia con la formación de huso aberrante (es decir, la organización multipolar sin pérdida de la integridad del centrosoma), debido a la capacidad de 4-oxo-4-HPR para apuntar los microtúbulos y para inhibir la polimerización de tubulina a través de una interacción molecular directa con la tubulina [13] .El presente estudio fue planeado para diseccionar los mecanismos de 4-oxo-4-HPR de acción que subyace a su efecto antiproliferativo, en investigar si la actividad anticancerígena del retinoide puede surgir también de su capacidad para aumentar la generación de ROS y si la actividad antimitótica del retinoide está relacionado con el estrés oxidativo. en el presente documento hemos demostrado que, como 4-HPR, 4-oxo-4-HPR provoca un aumento de la generación de ROS, seguido por la inducción de la respuesta de estrés ER, la activación de JNK y PLAB upregulation y que esta cascada de señalización está parcialmente implicado en el efecto antiproliferativo del retinoide. Además, el efecto antimitótico 4-oxo-4-HPR es funcionalmente independiente de la cascada apoptótica antes mencionado, lo que indica que 4-oxo-4-HPR efecto antitumoral se debe a al menos dos mecanismos independientes de la acción.
resultados
generación de ROS participa en la apoptosis 4-oxo-4-HPR-inducida en células A2780
recientemente hemos reportado que la 4-HPR desencadena la apoptosis mediante la activación de una cascada de señalización que se inicia desde ROS generación y que implica respuestas de estrés ER, la activación de JNK y la sobrerregulación PLAB [9]. Para investigar si la cascada de señalización responsables de la apoptosis inducida por 4-HPR también estuvo implicado en la apoptosis inducida por 4-oxo-4-HPR, se analizó por primera vez la participación de la generación de ROS en la apoptosis inducida por 4-oxo-4-HPR en A2780, una línea celular de carcinoma de ovario humano, elegido debido a que ya se sabe que es sensible a la retinoide (IC
50 = 0,6 M en un ensayo de 72 horas) y para generar ROS en respuesta a 4-oxo-4- tratamiento HPR [12]. La participación de la producción de ROS se ensayó mediante la evaluación del efecto de la vitamina antioxidante C en 4-oxo-4-inducida por HPR apoptosis. Cinco tratamiento mu M 4-oxo-4-HPR durante 4 horas provocó un aumento de la producción de ROS, que fue impedido por la adición de 100 M de vitamina C (Figura 1A). La abrogación de la generación de ROS por la vitamina C causó una reducción (1,7 veces) sobre la apoptosis 4-oxo-4-HPR-inducida, evaluada como la fragmentación del ADN mediante un ensayo ELISA (Figura 1B). Una reducción apoptosis similar se ha observado a través de la determinación de sub-G
1 población mediante tinción con yoduro de propidio seguido de citometría de flujo análisis (véase la Figura 5 y en el párrafo resultado relativa). Estos datos sugirieron que la generación de ROS inducida por 4-oxo-4-HPR estuvo involucrado en la apoptosis inducida por-4-HPR 4-oxo
.
(A) Análisis de la producción de ROS en células A2780 tratada durante 4 horas con 5 M 4-oxo-4-HPR, con o sin 100 mM de vitamina C. el análisis se realizó por citometría de flujo después de la adición de la redox sensible tinte CM-H
2DCFDA. El gráfico muestra un resultado representativo citometría de perfiles de fluorescencia en diferentes condiciones de tratamiento (un experimento representativo de tres). Un giro a la derecha del control indica un mayor niveles de ROS. (B) células A2780 fueron tratados durante 24 horas con 5 mM 4-oxo-4-HPR, con o sin 100 mM de vitamina C y la apoptosis, evaluada como la fragmentación del ADN, se midió mediante un ensayo ELISA. Los datos son medias de tres experimentos independientes; barras verticales son las desviaciones estándar. El asterisco indica diferencia significativa (P & lt; 0,05).
4-oxo-4-HPR induce la respuesta de estrés ER en las células A2780
Se analizó si 4-oxo-4-HPR, como 4-HPR [9], que se activa, aguas abajo de la generación de ROS, una respuesta de estrés ER, mediante la evaluación de las señales específicas ER-estrés: el empalme post-transcripcional de la proteína-1 (XBP-1) de unión X-box factor de transcripción, la expresión de las proteínas chaperon proteína regulada por glucosa 78 KD (GRP-78) /proteína inmunoglobulina de unión (Bip) y la proteína de choque térmico 70 (HSP70), y el estado de fosforilación de la subunidad alfa de eucariótica factor de iniciación 2 ( eIF2α) [14]. En las células A2780, 5 tratamiento mu M 4-oxo-4-HPR durante 24 horas indujo el empalme de un intrón de 25 pb a partir del ARNm precursor XBP-1, causado upregulation de GRP78 /Bip y HSP70 y la fosforilación de eIF2α (Figura 2A). fue abrogada La activación de estos eventos con el estrés asociado ER (XBP-1, GRP78 /Bip y HSP70) o se reduce fuertemente (eIF2α) mediante la adición de vitamina C (Figura 2A). Las células A2780 Los resultados indicaron que el 4-oxo-4-HPR causó la inducción de la respuesta de estrés ER, como el evento aguas abajo de la generación de ROS
.
(A) tratados durante 24 horas con 5 M 4-oxo-4-HPR , con o sin 100 mM de vitamina C, se sometieron a ensayo de RT-PCR para analizar el corte y empalme del intrón 25 bp de XBP-1 transcripción y análisis de transferencia western para la expresión de GRP-78 /Bip, peIF2α, eIF2α. Para la transcripción inversa-PCR, β-actina se amplificó como un control interno. Para el análisis de transferencia Western, como un control para la carga, la transferencia se incubó con un anticuerpo actina. (B) Las células tratadas como en (A) fueron sometidos a análisis de Western blot para la expresión de pJNK y JNK.
4-oxo-4-HPR induce la activación de JNK en células A2780
Se analizó si 4-oxo-4-HPR, como 4-HPR [9], inducida por la activación de JNK. El análisis de transferencia Western, en las células A2780, mostró que 5 tratamiento mu M 4-oxo-4-HPR durante 24 horas provocó la fosforilación de JNK y que la adición de vitamina C redujo fuertemente la activación de la quinasa (Figura 2B). Los datos indicaron que 4-oxo-4-HPR inducida por la activación de JNK y de que este evento se produjo a través de un mecanismo de ROS-dependiente.
upregulation PLAB está implicado funcionalmente en la apoptosis inducida por 4-oxo-4-HPR
Hemos informado anteriormente de que PLAB está regulada positivamente por 4-HPR en una forma dependiente de ROS [9], y que desempeña un papel funcional en la apoptosis inducida por el retinoide en las células A2780 [10]. por tanto, se evaluó si la expresión de PLAB también 4-oxo-4-HPR modulada. El análisis de transferencia Western mostró que el tratamiento 5 M 4-oxo-4-HPR durante 24 horas inducidas PLAB upregulation y que este efecto se redujo fuertemente por la adición de vitamina C (Figura 3A). Para investigar si la regulación positiva PLAB jugó un papel funcional en la apoptosis inducida por 4-oxo-4-HPR, nos aprovechamos de silenciamiento PLAB en las células A2780, previamente generada por transfección estable [10]. Como era de esperar, PLAB upmodulation inducida por 4-oxo-4-HPR se redujo fuertemente en las células transfectadas con el plásmido PLAB siRNA en comparación con las células transfectadas con un plásmido revueltos utilizado como control (Figura 3B). Como se muestra en la Figura 3C, la apoptosis inducida por 4-oxo-4-HPR en células transfectadas con siRNA PLAB fue aproximadamente 2 veces reducido en comparación con las células transfectadas con el plásmido revueltos. La reducción de la apoptosis inducida por 4-oxo-4-HPR en células PLAB silenciado también ha sido confirmada por la evaluación de sub-G
1 población después de tinción con yoduro de propidio (datos no presentados). Los resultados demostraron que 4-oxo-4-HPR inducida upregulation PLAB como un evento aguas abajo de la generación de ROS y que PLAB contribuyeron a 4-oxo-4-inducida por HPR apoptosis. Todos los datos mencionados anteriormente sugieren que el 4-oxo-4-HPR provocó la activación de la cascada de señalización relacionados con el ROS que se muestran para ser activado por 4-HPR (ROS → ER estrés → JNK → PLAB) [9].
(a) análisis de transferencia Western para la expresión en las células A2780 PLAB tratados durante 24 horas con 5 mM 4-oxo-4-HPR, con o sin 100 mM de vitamina C. Como control de carga, la transferencia se incubó con un anticuerpo actina . (B) Análisis de transferencia Western para la expresión en células de PLAB A2780 transfectadas de forma estable con un plásmido que contiene un siRNA PLAB o una revueltos nonsilencing siRNA después de la adición de 5 M 4-oxo-4-HPR durante 24 horas. Como control de carga, la transferencia se incubó con un anticuerpo actina. apoptosis inducida por HPR-4-oxo-4 (C) Detección de en A2780 transfectadas de forma estable con un plásmido que contiene un PLAB siRNA (columnas negras) o una revueltos siRNA nonsilencing (columnas grises). Las células transfectadas fueron tratadas durante 24 horas con 5 mM 4-oxo-4-HPR y la apoptosis, evaluada como la fragmentación del ADN, se midió mediante un ensayo ELISA. Los datos son la media de cuatro experimentos independientes; barras verticales son las desviaciones estándar. El asterisco indica diferencia significativa (P & lt; 0,01).
4-oxo-4-HPR induce Bcl-2 y MCL-1 regulación a la baja de manera independiente
ROS-
Ya que tiene ha informado de que 4-HPR puede inducir la apoptosis mediante la regulación de los miembros de la familia Bcl-2, como el evento aguas abajo de la generación de ROS [15] - [17], se analizó el efecto de la 4-oxo-4-HPR en las proteínas antiapoptóticas linfoma de células B gene-2 (Bcl-2) y células de la leucemia mieloide-1 (MCL-1) y la proteína X en la proteína asociada proapoptótico-Bcl-2 (Bax). En las células A2780, 5 tratamiento mu M 4-oxo-4-HPR durante 24 horas causó una disminución del nivel de expresión de Bcl-2 y MCL-1 de proteína, mientras que no había efecto sobre la expresión de Bax (Figura S1). La regulación a la baja tanto de Bcl-2 y MCL-1 no fue impedida por la adición de vitamina C (Figura S1), lo que sugiere que el 4-oxo-4-HPR causó una disminución tal de una manera ROS-independiente.
detención mitótica y la formación de husos multipolares son independientes de ROS relacionados con la cascada de señalización en las células A2780
Contrariamente a 4-HPR, que afecta sólo ligeramente el G
1 fase del ciclo celular, 4- oxo-4-HPR causa una marcada acumulación de células en G
2-M fases [12]. Hemos informado recientemente que inducida por HPR-4-oxo-4 perturbación del ciclo celular se debe a la capacidad del retinoide para inhibir la polimerización de tubulina, detención de las células en la mitosis [13]. Por otra parte, se demostró que el efecto antimitótico de la retinoide para acoplarse con la formación de husos en forma aberrante (es decir multipolars) debido a sus efectos sobre la polimerización de tubulina [13]. Para investigar si la detención de la mitosis inducida-4-oxo-4-HPR y la formación de husos multipolares estaban relacionados con la cascada de señalización inducida por ROS primero realizó un análisis del curso temporal de la generación y la perturbación del ciclo celular ROS inducida por 4- oxo-4-HPR. se observó la generación de ROS tan pronto como 30 minutos después del tratamiento con retinoides (Figura 4A) y se mantuvo durante todo el transcurso de tiempo de 24 horas. Por el contrario, una ligera G
acumulación de células 2-M sólo se observó a las 2 horas y el aumento del porcentaje de G
2-M detenido las células era dependiente del tiempo hasta 16-24 horas (Figura 4B) . Así, el análisis del curso del tiempo reveló que el estrés oxidativo inducido por 4-oxo-4-HPR se produjo antes de la detención del ciclo celular y que los dos eventos presenta diferentes cinéticas. Para investigar si la generación de ROS inducida-4-HPR 4-oxo jugó un papel en la detención de la mitosis, se analizaron los efectos de la vitamina C sobre la perturbación del ciclo celular y la formación de husos aberrantes inducidos por el retinoide. En las células A2780 expuestas durante 24 horas a 5 M 4-oxo-4-HPR, la adición de 100 mM de vitamina C no impedir la acumulación de G
2-M población de células (Figura 5 y S2) o la formación de multipolar ejes (Figura 5). resultados consistentes en la distribución del ciclo celular y la formación de husos multipolares se obtuvieron mediante la inhibición de la cascada de señalización relacionados con el ROS en un nivel aguas abajo a través de silenciamiento PLAB: transfección con PLAB siRNA no impidió detención mitótica inducida por 4-oxo-4-HPR y la formación de husos multipolares (datos no mostrados). Los resultados indicaron que en las células A2780, la detención de la mitosis inducida por 4-oxo-4-HPR no era ni un evento aguas abajo de la generación de ROS, ni una etapa de la cascada de señalización relacionados con el ROS.
(A) Análisis de la producción de ROS en células A2780 tratados con 5 M 4-oxo-4-HPR durante 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 16 horas, y 24 horas. El análisis se realizó por citometría de flujo después de la adición del colorante redox sensible CM-H
2DCFDA. Los gráficos muestran un resultado representativo citometría de perfiles de fluorescencia en diferentes condiciones de tratamiento (un experimento representativo de tres). Un giro a la derecha del control indica un mayor niveles de ROS. (B) Análisis de citometría de flujo de células A2780 de yoduro de propidio manchados tratados con vehículo o 5 M 4-oxo-4-HPR durante 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 16 horas, y 24 horas. Los números de la figura indican el porcentaje de células en la fase de ciclo celular, de acuerdo con el análisis realizado con el software ModFit LT. Se muestra un experimento representativo de tres.
análisis de citometría de flujo de células A2780 de yoduro de propidio manchadas tratadas durante 24 horas con 5 M 4-oxo-4-HPR con o sin 100 mM vitamina C. Los Números en la figura indican el porcentaje de células en la fase de ciclo celular, de acuerdo con el análisis realizado con el software ModFit LT. Se muestra un experimento representativo de tres. A la derecha se representa la imagen celular mitótico un representante para cada tratamiento, que se obtiene mediante inmunotinción con anticuerpo α-tubulina (
verde
) y la tinción nuclear con Hoechst 33342 (
azul
). Barra de escala = 5 micras.
4-oxo-4-HPR actúa a través de un doble mecanismo de acción también en líneas celulares de cáncer de diferente histotypes
Para determinar si la intervención de la dos mecanismos independientes de la actividad-4-HPR 4-oxo se restringió a las células A2780 o representados el modo distintivo de la acción del retinoide, extendemos el análisis de 4-oxo-4-HPR efectos a otros tres líneas celulares de cáncer humano sensibles a el retinoide: células SK-N-BE (neuroblastoma) (Figura 6A) T47D (adenocarcinoma mamario), HeLa (adenocarcinoma cervical epitelial) y. Se evaluó primero la generación intracelular de ROS inducida por 4-oxo-4-HPR que muestra que, en las tres líneas celulares de cáncer, 5 M 4-oxo-4-HPR durante 4 horas aumentó la producción de ROS sobre los controles y que la adición de 100 M vitamina C inhibió la generación de ROS inducida por el retinoide (Figura 6B). En las tres líneas celulares ensayadas, 4-oxo-4-HPR tratamiento inducida upregulation PLAB y este efecto se redujo por la adición de vitamina C (Figura 6C). a continuación, se realizó el análisis del ciclo celular que muestra que el tratamiento con 4-oxo-4-HPR indujo una G
detención del ciclo celular 2-M marcado en todas las líneas celulares de cáncer analizadas (Figura 7 y S2). De manera similar a lo observado en las células A2780, en estas líneas celulares de la inhibición de la generación de ROS con la vitamina C causó una reducción marcada de la sub-G
1 población, pero no disminuyó el porcentaje de células detenidas en G
2- fase M (Figura 7 y S2). la formación de otra parte, 4-oxo-4-HPR tratamiento provocó de husos multipolares en T47D, HeLa y SK-N-BE células (Figura 7), y en todos ellos la adición de vitamina C no impidió la formación de husillos aberrantes inducidos por el retinoide (Figura 7). Los resultados sugieren que, también en T47D, HeLa y SK-N-BE células, la cascada de señalización dependiente de ROS estaba involucrado en la apoptosis-4-inducida por HPR 4-oxo. Por otra parte, inducida por 4-HPR-4-oxo detención del ciclo celular y la formación de husos multipolares fueron independientes de la cascada de señalización asociada a ROS, no sólo en sino también en cáncer de mama, líneas celulares de cáncer cervical y neuroblastoma, revelando la característica distintiva de ovario de 4-oxo-4-HPR tener un doble mecanismo de acción
.
(a) el efecto citotóxico de 4-oxo-4-HPR en T47D (□), HeLa (▵) y SK-N- el crecimiento de células BE (○) se estimó usando el ensayo de sulforrodamina B. La actividad antiproliferativa de 4-oxo-4-HPR en cada línea celular se puso a prueba en tres experimentos independientes con cuatro pocillos replicados para cada análisis; barras verticales son las desviaciones estándar. (B) Análisis de la producción de ROS en T47D, HeLa y SK-N-BE células tratadas durante 4 horas con 5 mM 4-oxo-4-HPR, con o sin 100 mM de vitamina C. El análisis se realizó por citometría de flujo después de la adición del colorante sensible a redox CM-H
2DCFDA. Los gráficos muestran un resultado representativo citometría de perfiles de fluorescencia en diferentes condiciones de tratamiento (un experimento representativo de tres). Un giro a la derecha del control indica un mayor niveles de ROS. (C) análisis de transferencia Western para la expresión PLAB en T47D, HeLa y SK-N-BE células tratadas con 5 M 4-oxo-4-HPR durante 24 horas, con o sin 100 mM de vitamina C. Como control de carga, la transferencia se incubó con el anticuerpo actina.
análisis de citometría de flujo de T47D teñido con yoduro de propidio (a), HeLa (B) y SK-N-BE células (C) tratados durante 24 horas con 5 M 4-oxo-4-HPR con o sin 100 mM de vitamina C. los números de la figura indican el porcentaje de células en la fase de ciclo celular, de acuerdo con el análisis realizado con el software ModFit LT. Se muestra un experimento representativo de tres. En la parte inferior de cada histograma, análisis de inmunofluorescencia con anticuerpo α-tubulina (
verde
) de las células tratadas de la misma manera. La morfología nuclear se visualizó mediante tinción con Hoechst 33342 (
azul
). Barra de escala = 10 m.
Discusión
4-oxo-4-HPR es un metabolito polar del retinoide sintético 4-HPR que se detectó en muestras de plasma de las mujeres tratadas con 4-HPR participar en un ensayo de fase III de mama prevención del cáncer de ensayo [11]. Nuestros
in vitro
estudios anteriores llevados a cabo con 4-oxo-4-HPR han demostrado que el retinoide está dotado de propiedades contra el cáncer muy prometedores, tales como un mayor crecimiento del tumor efectos inhibitorios de 4-HPR (siendo su IC
50 valores de dos a cuatro veces más bajo que el fármaco original en la mayoría de las líneas celulares sometidas a prueba), la falta de resistencia cruzada y la interacción sinérgica con el fármaco original [12], lo que sugiere que podría ser propuesta como un nuevo agente para la terapia del cáncer. A diferencia de 4-HPR y otros retinoides, 4-oxo-4-HPR se dirige a los microtúbulos e inhibe la polimerización de tubulina que causa detención mitótica y la formación de husos multipolares sin pérdida de la integridad del centrosoma [13]. Por otra parte, al igual que el fármaco original, 4-oxo-4-HPR induce aumento de la generación de ROS [12].
Dado que la generación de ROS inducida por 4-HPR se ha demostrado para activar una cascada apoptótica participa en la respuesta ER estrés, la activación de JNK y la regulación positiva de la proteína proapoptótico PLAB [9], se decidió investigar si 4-oxo-4-HPR desencadena la apoptosis también a través de la generación de ROS y si su actividad antimicótica estaba relacionado con esta vía ROS-dependiente. la producción de ROS inducida por HPR-4-oxo-4 contribuyó a la actividad apoptótica del retinoide, debido a que el tratamiento con el antioxidante vitamina C causó una reducción de la apoptosis inducida por HPR-4-oxo-4. En nuestro estudio anterior, el 4-oxo-4-HPR caracterización [12], no hemos podido demostrar una relación causal clara entre la generación de ROS y la actividad inhibidora del crecimiento celular del retinoide. Una posible explicación podría ser que el antioxidante utilizado en el análisis anterior (es decir,
N
-acetil-L-cisteína) no impidió totalmente el estrés oxidativo inducido por 4-oxo-4-HPR, pero sólo provocó una reducción parcial de la producción de ROS [12].
Aguas abajo de la generación de ROS, 4-oxo-4-HPR activa otros intermedios de señalización de la cascada apoptótica 4-HPR, como respuesta al estrés ER (detectado por XBP-1 empalme, GRP78 /Bip y upregulation HSP70, y eIF2α fosforilación) y la fosforilación de JNK, tanto impedido por la adición de vitamina C. La expresión de la proteína PLAB proapoptótico se aumentó dramáticamente por 4-oxo-4-HPR y su regulación positiva se redujo mediante la adición de vitamina C, lo que sugiere que la modulación de la expresión de proteínas fue un evento aguas abajo del estrés oxidativo inducido por el retinoide. Por otra parte, hemos demostrado que PLAB jugó un papel funcional en la actividad apoptótica-HPR 4-oxo-4, ya que su silenciamiento disminuyó la apoptosis inducida por el retinoide. Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que 4-oxo-4-HPR, además de actuar como un agente antimicrotubular, la apoptosis inducida a través de la cascada de señalización que ya hemos demostrado ser activado por 4-HPR (ROS → ER estrés → JNK → PLAB) [ ,,,0],9]
PLAB apoptosis que induce la actividad se ha observado y reportado por otros autores de distintos contextos celulares y después del tratamiento con diferentes agentes contra el cáncer [9], [18] -. [21]. Sin embargo, los eventos aguas abajo específicos por los que PLAB medie tal efecto no se habían determinado. A partir de nuestros resultados, una implicación de las proteínas Bcl-2 y Mcl-1, un miembro de la familia Bcl-2, en la actividad apoptótica PLAB podría ser posiblemente excluida. De hecho, a pesar de tratamiento 4-oxo-4-HPR causó una regulación a la baja del nivel de expresión de las dos proteínas antiapoptóticas, tal disminución no fue impedida por la inhibición de la cascada de la apoptosis mediada por ROS que implica PLAB.
es interesante observar que 4-oxo-4-HPR es una forma oxidada de 4-HPR y que la modificación en la posición 4 del anillo de ciclohexeno es probablemente responsable de la actividad antimicrotubular-4-HPR 4-oxo, pero no afectar a la capacidad del retinoide para inducir la generación de ROS y para activar la cascada de señalización relacionados con el ROS. Tal modificación química podría ser también responsable del metabolismo de los esfingolípidos diferente observada entre los dos retinoides. Ambos 4-HPR y 4-oxo-4-HPR se han demostrado inducir un aumento espectacular de la producción dihidroceramida; sin embargo, se informó que la contribución de las especies moleculares distintas al incremento total a ser marcadamente diferente, en términos de la esfingosina /esfinganina y contenido de ácidos grasos. Además, 4-oxo-4-HPR, en contra de la droga madre, se ha demostrado que aumentar un poco también la producción de ceramida [22].
Hemos informado anteriormente de que el 4-oxo-4-HPR actúa atípica en comparación con 4-HPR y otros retinoides, debido a su capacidad para inhibir la polimerización de tubulina, lo que lleva a la formación de husos multipolares y detención de la mitosis [13]. En este estudio hemos encontrado que la detención mitótica y la formación de husos multipolares acoplado inducidos por 4-oxo-4-HPR fueron independientes de la cascada de señalización relacionados con el ROS. De hecho, hemos demostrado que la generación de ROS inducida-4-HPR 4-oxo se produjo antes de la detención de la mitosis, lo que indica que la actividad antimitótica del retinoide no era un evento aguas arriba del estrés oxidativo. Por otro lado, la inhibición de la vía relacionada con ROS por la vitamina C o por silenciamiento PLAB no impidió que la capacidad de 4-oxo-4-HPR para ejercer su actividad antimicrotubular, lo que sugiere que la detención mitótica no era un ROS mecanismo dependiente. La ocurrencia de un doble mecanismo de acción podría plausiblemente ser una característica distintiva de la modo de acción de 4-oxo-4-HPR, ya que estas dos vías no relacionados se encuentran en líneas celulares de cáncer de diferentes histotypes (de ovario, de mama, carcinoma cervical y neuroblastoma).
a pesar de que el mecanismo exacto por el cual 4-oxo-4-HPR actividad antimicrotubular desencadena la muerte celular aún no se ha determinado, sobre la base de los datos antes mencionados, podemos especular que tanto el ROS cascada de señalización relacionada y las actividades antimicrotubule contribuyen de forma independiente a la 4-oxo-4-HPR efecto antiproliferativo y proponemos que los actos retinoides tal como se presenta esquemáticamente en la figura 8. Sin embargo, el análisis de los mecanismos de 4-oxo-4-HPR de acción necesitarán más estudios para investigar cómo las dos vías de plomo molecularmente a la muerte celular. Es tentador especular que la regulación a la baja ROS-independiente de Bcl-2 y MCL-1, observado después del tratamiento 4-oxo-4-HPR, podría desempeñar un papel en la apoptosis inducida por la actividad antimicrotubular del retinoide, aunque en la actualidad ninguna evidencia apoya esta hipótesis. Según nuestras observaciones, se ha informado de que el tratamiento con otros agentes de microtúbulos interferentes puede conducir a una disminución de Bcl-2 y MCL-1 cantidades intracelulares que contribuyen a la apoptosis [23] - [25].
4 oxo-4-HPR induce la muerte celular a través de dos mecanismos independientes de acción: 1) una cascada de señalización relacionados con el ROS participa en la respuesta de estrés ER, la activación de JNK y la regulación positiva de la proteína PLAB proapoptótico; y 2) las actividades antimicrotúbulos que consisten en la inhibición de la polimerización de tubulina, detención de la mitosis y la formación de husos multipolares.
Es de destacar que otros agentes de microtúbulos dirigidos se han demostrado para promover la generación de ROS en las células cancerosas, pero la relación entre la dinámica de la tubulina y el estrés oxidativo siguen sin estar claros [26] - [33]. Recientemente, la actividad anticancerígena de paclitaxel se ha relacionado con la generación de intracelular y extracelular ROS y se ha sugerido que la perturbación del estado de la polimerización de microtúbulos inducida por este agente, así como por taxotere o vincristina, podría aumentar la producción de ROS mediante la estabilización de activo NADPH oxidasa [31], [32]. la generación de ROS contribuyó también al efecto antiproliferativo de patupilone, un miembro de los agentes estabilizadores de microtúbulos epotilonas, y una relación causal entre el estrés oxidativo y las modificaciones de la dinámica de los microtúbulos se ha sugerido [30]. Por el contrario, la generación de ROS inducida por 5c estilbeno, un inhibidor de microtúbulos en el sitio de la colchicina, se ha demostrado no estar relacionado con la perturbación del ciclo celular inducida por fármacos [29], de manera similar a lo que hemos encontrado de 4-oxo-4- HPR.
la capacidad de 4-oxo-4-HPR actuar a través de al menos dos mecanismos no relacionados probablemente podría permitir a contrarrestar el desarrollo de resistencia a los medicamentos. De hecho, hemos demostrado que si se inhibe una vía (relacionado ROS-es decir, vía de señalización), el retinoide es capaz de actuar a través del otro mecanismo (es decir, detención de la mitosis) para matar las células cancerosas.