Extracto
El AMP cíclico (cAMP) inhibe la proliferación de varias células tumorales. Hemos informado anteriormente de un efecto antiproliferativo de los análogos de la PKA I-selectivos de cAMP (8-PIP-cAMP y 8-HA-cAMP) en dos líneas celulares de cáncer humano de origen diferente. 8-Cl-cAMP, otro análogo de cAMP, con propiedades antiproliferativas conocidas, se ha investigado como un fármaco potencial contra el cáncer. A continuación, se comparó el efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos en tres líneas celulares de cáncer humano (ARO, de mora y WRO). 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivas tuvieron efectos antiproliferativos de manera similar potentes sobre las células ARO y NPA BRAF-positivos, pero no en las células WRO BRAF-negativas, en el que sólo 8-Cl-cAMP consistentemente inhibe el crecimiento celular . Mientras que el tratamiento con los análogos de cAMP I-selectivos PKA se asoció con la detención del crecimiento, la apoptosis inducida por 8-Cl-cAMP. Para investigar más a fondo las acciones de los 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos, se analizaron sus efectos sobre las vías implicadas en la proliferación celular y la apoptosis de señalización. Curiosamente, los análogos de cAMP PKA I-selectivos, pero no 8-Cl-cAMP, la fosforilación de ERK inhibido, mientras que 8-Cl-cAMP inducida por sí solo una fosforilación progresiva de la p38 mitogen-activated proteína quinasa (MAPK), a través de la activación de AMPK por su metabolito 8-Cl-adenosina. Es importante destacar que el efecto pro-apoptótica de 8-Cl-cAMP podrían prevenirse en gran medida por la inhibición farmacológica de la p38 MAPK. En conjunto, estos datos sugieren que la 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos, aunque de potencia antiproliferativa comparable, actúan a través de diferentes mecanismos. análogos de cAMP PKA I-selectivos inducen la detención del crecimiento en células que llevan el oncogén BRAF, mientras que 8-Cl-cAMP inducir apoptosis, aparentemente a través de la activación de la vía de p38 MAPK
Visto:. Lucchi S, Calebiro D, de Filippis T, Grassi ES, MO Borghi, Persani L (2011) 8-cloro-AMP cíclico y la proteína quinasa A I-selectivo AMP cíclico análogos cáncer de inhibición del crecimiento celular a través de diferentes mecanismos. PLoS ONE 6 (6): e20785. doi: 10.1371 /journal.pone.0020785
Editor: Andrew D. Badley, Clínica Mayo, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Enero, 2011; Aceptado: 9 Mayo 2011; Publicado: 10 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Lucchi y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue parcialmente apoyado por fondos de investigación del Instituto Italiano Auxologico. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El AMP cíclico (AMPc) es un antiguo y mensajero químico ubicuo, se encuentra tanto en procariotas y eucariotas. En los vertebrados es un mediador intracelular importante de neurotransmisores y hormonas y regula las funciones celulares esenciales, tales como la contracción, la secreción y la replicación. Mientras campamento tiene un efecto antiproliferativo en la mayoría de tipos de células, que proporciona un opuesto, es decir, pro-mitótico, estímulo para las neuronas y varias células de origen endocrino [1], [2]. No es sorprendente entonces, los genes que codifican los elementos clave del acto vía cAMP como oncogenes o oncosuppressors, más exquisitamente en células endocrinas [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10]. Por otra parte, una regulación al alza del tipo de isoformas I de la cAMP-dependiente de la proteína quinasa A (PKA) se ha documentado en varios tumores malignos [11].
Desde cAMP tiene un efecto antiproliferativo sobre las células tumorales, análogos de cAMP permeables a las células han sido considerados para la terapia de cáncer humano [11]. 8-Cl-cAMP, el mejor estudiado de estos compuestos, tiene propiedades antiproliferativas tanto
in vitro
y
in vivo
y ha sido evaluado en fase I /II de ensayos clínicos [11], [ ,,,0],12], [13]. Sin embargo, a pesar de los efectos bien documentados de 8-Cl-cAMP, no existe un acuerdo común sobre su mecanismo de acción. En los estudios pioneros por el grupo de Yoon Cho-Chung se, de hecho, muestra que 8-Cl-cAMP modifica la relación de las subunidades reguladoras de PKA (R) (tipo I vs. tipo II) por la disminución de los niveles de subunidades de tipo IR [11], [14]. Aunque este fenómeno se consideró responsable del efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP, los resultados de los estudios más recientes sugieren que los efectos de 8-Cl-cAMP en cambio se mediados por su metabolito 8-Cl-adenosina y son independientes de la activación de PKA y /o alteraciones de la relación entre el tipo I y tipo II R subunidades [15], [16], [17], [18].
En un trabajo previo se encontró que un par de sitio-específica análogos de cAMP (8-PIP-cAMP y 8-HA-cAMP), que, cuando se utiliza en combinación, activar selectivamente PKA I, tenía un efecto antiproliferativo potente en dos líneas celulares de carcinoma de BRAF-positivos (ARO y NPA), pero no en las células WRO BRAF-negativas [19]. En este estudio se compararon los efectos de los 8-Cl-cAMP y estos análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre las mismas líneas celulares de carcinoma (ARO, de mora y WRO), examinado parámetros tales como el crecimiento celular, la apoptosis y modificaciones de la señalización clave cascadas que podrían estar implicados en sus efectos antiproliferativos.
resultados
efecto de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre la proliferación celular
en primer lugar, en comparación el efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos. Para este propósito, se trataron ARO (cáncer de colon), NPA (melanoma) y WRO (carcinoma folicular de tiroides) células con diferentes concentraciones de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos para varios períodos de tiempo (24 a 96 h) y la viabilidad celular evaluada utilizando el ensayo MTT. Los resultados indicaron que ambos tratamientos fueron igualmente potentes en la inhibición del crecimiento de células ARO y NPA, mientras que sólo el 8-Cl-cAMP tenía un efecto antiproliferativo sobre las células consistente WRO (Figura 1). El efecto de ambos tratamientos alcanzó un máximo después de 72 a 96 h de incubación (datos no mostrados) y era dependiente de la dosis, con valores de CI50 de 55,3 M en ARO y 84,8 mM en células NPA para los análogos de cAMP PKA I-selectivos y entre 2.3 y 13.6 mM de 8-Cl-cAMP en las tres líneas celulares. En consonancia con la anterior conclusión de que el efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP es independiente de PKA y al menos parcialmente mediado por su metabolito 8-Cl-adenosina [15], [16], [17], [18], el efecto de 8-Cl-cAMP se inhibió significativamente por el tratamiento con el inhibidor de la fosfodiesterasa IBMX, que bloquea la conversión de 8-Cl-cAMP a 8-Cl-adenosina. Por el contrario, IBMX no modificó el efecto antiproliferativo de los análogos de cAMP PKA I-selectivos (Figura S1). Además, no parece estar mediada por PKC, como el tratamiento con un inhibidor de la PKC no modificó la respuesta a la 8-Cl-cAMP (Figura S2) el efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP.
ARO, células NPA y WRO se cultivaron durante 72 h en presencia de las concentraciones indicadas de cualquier tipo de análogo (s) de AMPc y la viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo MTT. PKA I, análogos de la PKA I-selectivos utilizados en concentraciones equimolares.
Efecto de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre la progresión del ciclo celular y la apoptosis
A continuación , se evaluó si el efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP I-selectivos de PKA se asoció con la detención del crecimiento y /o apoptosis. Esta cuestión fue tratada por una combinación de enfoques.
En primer lugar, se analizaron los efectos de la 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre el ciclo celular y la apoptosis por citometría de flujo análisis del contenido de ADN nuclear . Para este fin, las células ARO, de mora y WRO fueron tratados con cualquier tipo de análogo (s) de cAMP para diferentes períodos de tiempo y se analizaron después de la tinción del ADN con yoduro de propidio. tratamiento 8-Cl-cAMP se asoció con una reducción de células en G0 /G1 y una acumulación de células en fase S. Además, se acompaña de un aumento significativo en la fracción de células apoptóticas, es decir, los que tienen un contenido de ADN sub-G0 /G1. Por el contrario, la exposición a los análogos de cAMP I-selectivos de PKA no causó un aumento significativo en la apoptosis. El único efecto apreciable de los análogos de cAMP PKA I-selectivos fue un ligero aumento en el número de células en G0 /G1 (estadísticamente significativa en las células ARO) y una tendencia hacia una reducción de las células en S y G2 fases /M, tanto compatible con la acumulación en G0 /G1 (Tabla 1).
a continuación, se analizó la liberación de fragmentos de ADN histona unida al citosol, como un marcador de la fragmentación del ADN de apoptosis. células ARO, NPA y WRO se expusieron a concentraciones sub-máxima de los análogos de AMPc PKA I-selectivos o 8-Cl-cAMP, y la cantidad de nucleosomas en el citoplasma se evaluó por un ELISA específico. tratamiento de 8-Cl-cAMP causó un aumento significativo de la fragmentación del ADN en las tres líneas celulares que comenzaba detectables a partir de las 48 h de incubación. Por el contrario, no se observó la inducción de la fragmentación del ADN en las células tratadas con los análogos de cAMP PKA I-selectivos (Fig 2A y datos no presentados)
A:. Efecto en la fragmentación del ADN. Las células se expusieron a 8-Cl-cAMP (100 mM) o los análogos de cAMP PKA I-selectivos (100 mM cada uno) durante 48 h y se evaluó la liberación de fragmentos de ADN histona unida en el citosol por un ELISA específico. Los datos proceden de tres experimentos independientes. B: efecto sobre la caspasa 3/7. Las células se expusieron a 8-Cl-cAMP (100 mM) o los análogos de PKA I-selectivos de cAMP (100 mM cada uno) para 72 h y la actividad de la caspasa 3/7 se determinó con un ensayo luminiscente. Los datos proceden de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,001 vs. células de control. Todos los datos se expresan como la variación en comparación con el cultivo de células de control sin drogas.
Finalmente, como la apoptosis está asociada con la activación de caspasa [20], se examinó el efecto de ambos tratamientos sobre la actividad de la caspasa 3 /7, que se midió utilizando un ensayo luminiscente. Un aumento significativo de la actividad de la caspasa 3/7 se detectó en las células ARO, NPA y WRO expuestas a 8-Cl-cAMP a partir de las 24 h de tratamiento, pero no en las mismas células tratadas con los análogos de cAMP PKA I-selectivos (Figura 2B ).
Tomados en conjunto estos datos sugieren que 8-Cl-cAMP pero no los análogos de cAMP PKA I-selectivos indujeron apoptosis en las células ARO, NPA y WRO.
vías apoptóticas activan por 8- Cl-cAMP
Para investigar la vía que participan en la apoptosis inducida por 8-Cl-cAMP, se evaluó la actividad de la caspasa 8 (vía extrínseca) y la caspasa 9 (vía intrínseca) utilizando ensayos luminiscentes específicos. An (10 min-1 h) activación temprana y transitoria de la caspasa 8, pero no de la caspasa 9, se observó (Figura 3), lo que sugiere que 8-Cl-cAMP puede inducir la vía extrínseca. Sin embargo, estos dos caspasas no mostraron ninguna activación en puntos de tiempo posteriores (24-48 h) (datos no mostrados).
células ARO, NPA y WRO se expusieron a 8-Cl-cAMP (200 mM) para diferentes períodos de tiempo y las actividades de la caspasa 8 y 9 se midieron utilizando ensayos luminiscentes específicos. Los datos son de tres a seis experimentos independientes. * P & lt; 0,05 vs. basal. ** P & lt; 0,01 vs. basal. *** P & lt; 0,001 vs. basal. Todos los datos se expresan como la variación respecto al valor basal.
Efecto de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre los niveles de subunidades de PKA
Dado que se ha informó que el 8-Cl-cAMP causa una baja regulación de RIα y una regulación de las subunidades RIIβ [14], [21], se compararon los efectos de los 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre la expresión de las subunidades de PKA R. Para este propósito, las células ARO, NPA y WRO se estimularon con los análogos de cAMP PKA I-selectivos para diferentes períodos de tiempo y los niveles de RIα, RIIα y RIIβ 8-Cl-cAMP o se evaluaron mediante análisis de transferencia Western utilizando-isoforma específica anticuerpos. El tratamiento de células ARO, NPA y WRO, ya sea con 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP I-selectivos de PKA se asoció con una reducción de los niveles de expresión de la subunidad RIα, mientras que los niveles de las subunidades restantes no se vieron afectados (Figura 4 ).
ARO, las células de mora y WRO fueron tratados con 8-Cl-cAMP (100 M) o los análogos de cAMP PKA I-selectivos (100 mM cada uno) para los periodos de tiempo indicados. Los niveles de RIα, RIIα y RIIβ se midieron mediante análisis de transferencia Western. Se muestra son representativos borrones Western (A), así como los resultados del análisis densitométrico de cuatro experimentos independientes (B). * P & lt; 0,01 vs. basal. ** P & lt; 0,001 vs. basal. Estos datos se expresan como la variación respecto al valor basal.
Efecto de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre ERK 1/2 y Akt
En un esfuerzo por entender mejor el mecanismo de acción de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos, que examinó a continuación el efecto de ambos tipos de tratamiento en dos cascadas de señalización clave que están implicadas en el crecimiento celular, es decir, la quinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK) activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) y la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt.
ERK1 /2 MAPKs están bien caracterizados que se activan en respuesta a estímulos de crecimiento y jugar un papel importante en la transformación neoplásica [22]. Además, el AMPc se ha encontrado para inhibir ERK activación media en varios de los tipos de células en las que tiene un efecto antiproliferativo [1], [2]. Este parece ser el caso también en células ARO y NPA, donde, como hemos mostrado anteriormente, el efecto antiproliferativo de los análogos de cAMP PKA I-selectivos se asocia con una inhibición de la ERK 1/2 fosforilación en Thr202 /Tyr204 [19] . Sobre esta base, se evaluó el efecto del tratamiento con 8-Cl-cAMP sobre la fosforilación de ERK en Thr202 /Tyr204 por Western blot con un fosfato de anticuerpos específicos. Análisis de la activación de ERK en puntos de tiempo tempranos reveló aumentos transitorios para ambos tratamientos (Figura S3). En desacuerdo con lo que previamente observado en respuesta a los análogos de cAMP PKA I-selectivos, la exposición crónica a 8-Cl-cAMP no se asoció con una inhibición tarde y persistente de la fosforilación de ERK (Figura 5).
ARO , células de mora y WRO fueron tratados con 8-Cl-cAMP (100 mM) o los análogos de cAMP PKA I-selectivos (100 mM cada uno) para los períodos de tiempo indicados. El nivel de ERK 1/2 fosforilada en Thr202 /Tyr204 y total ERK se midieron mediante análisis de transferencia Western. Se demuestran las transferencias de Western representativas, así como el análisis densitométrico de tres a cuatro experimentos independientes. Las relaciones de P-ERK /Total-ERK se expresan como la variación relativa en comparación con los niveles basales de cada solo experimento. * P & lt; 0,05 vs. basal. ** P & lt;. 0,01 vs. basal
Otra proteína que ha sido implicado en la proliferación celular es la serina /treonina quinasa Akt, que se activa por los productos de PI3K y la fosforilación en Ser473 y Thr308 [23] . por lo tanto, se evaluó el efecto de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre la fosforilación de Akt en Ser473 y Thr308, indicativa de su activación. En consonancia con lo que se informó anteriormente [19], el tratamiento con los análogos de la PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP o no provocó modificaciones pertinentes de la fosforilación de Akt en los primeros puntos de tiempo (Figura S3) y para un máximo de 72 h (datos no se muestra).
Efecto de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre la MAPK p38
8-Cl-cAMP se ha demostrado que induce la fosforilación de p38 MAPK en HL60 y Las células HeLa [24], [25]. Por lo tanto, se evaluó el efecto de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos sobre la fosforilación de p38 MAPK. Se encontró que el tratamiento de ARO, NPA y células WRO con 8-Cl-cAMP se asoció con un aumento progresivo de la fosforilación de p38 MAPK, a partir de las 24 h de incubación (Figura 6). Por el contrario, el tratamiento con los análogos de cAMP I-selectivos de PKA no modificó el estado de fosforilación de la MAPK p38 (Fig 6), a excepción de los aumentos leves y transitorios que no alcanzaron significación estadística. Por otra parte, el tratamiento con los análogos de la PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP o no provocó modificaciones de la fosforilación de p38 MAPK en los puntos de tiempo tempranos (Figura S3).
ARO, las células de mora y WRO fueron tratados con 8- Cl-cAMP (100 mM) o los análogos de cAMP PKA I-selectivos (100 mM cada uno) para los períodos de tiempo indicados. Los niveles de p38 MAPK fosforilada y total fueron medidos por análisis de transferencia de Western. Se demuestran las transferencias de Western representativas, así como el análisis densitométrico de tres experimentos independientes. /Relación total de p38-P-p38 se normaliza a los niveles basales. * P & lt; 0,05 vs. basal. ** P & lt; 0,01 vs. basal. *** P & lt;. 0,001 vs basal
Por último, se evaluó si el efecto pro-apoptótica de 8-Cl-cAMP fue dependiente de la activación de p38 MAPK. Para este objetivo, se trataron durante 48-72 h las tres líneas celulares con 8-Cl-cAMP en presencia o ausencia de inhibidores de p38 MAPK selectivos (SB 202190 o SB203580) y analizó la distribución del ciclo celular por citometría de flujo como se describe anteriormente. Curiosamente, la inhibición de la MAPK p38 impedido en gran medida el efecto pro-apoptótico 8-Cl-cAMP (Figura 7).
Las células se estimularon con 8-Cl-cAMP (100 mM), ya sea en presencia o en el ausencia de inhibidores de MAPK p38 (SB203580 10 M o SB202190) para 72 h y la apoptosis se evaluó mediante análisis de citometría de flujo después de tinción con yoduro de propidio. Los datos son de al menos tres experimentos independientes. Los datos se expresan como la variación en comparación con el cultivo de células de control. * P & lt; 0,05 y ** P & lt;. 0,001 frente a células tratadas con 8-Cl-cAMP solo
En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que el efecto pro-apoptótico de 8-Cl-cAMP en ARO, las células de mora y WRO está mediada por la p38 MAPK.
Participación de la AMPK en la activación de p38 MAPK en un 8-Cl-cAMP
Un estudio reciente [25] ha informado de que los efectos antiproliferativos de 8-Cl-cAMP podría estar mediada por una activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) después de su metabolización a 8-Cl-adenosina. Para comprobar esta hipótesis se evaluaron los efectos tanto de un activador, AICAR, y un inhibidor, el Compuesto C, de AMPK. El tratamiento con AICAR imitaba los efectos de 8-Cl-cAMP sobre la fosforilación de p38 MAPK y de la caspasa 3/7 actividad. Además, el Compuesto C fue capaz de prevenir en gran medida tanto la fosforilación de MAPK p38 y la activación de la apoptosis inducida por 8-Cl-cAMP (Figura 8).
células ARO, NPA y WRO se estimularon con 8- Cl-cAMP (100 mM) o un activador de AMPK (AICAR, 1 mM) durante 72 h, ya sea en la presencia o ausencia de pretratamiento con un inhibidor de la AMPK (Compuesto C, 2,5 M). A: los niveles de p38 MAPK fosforilada y total de se midieron mediante análisis de transferencia Western. Se muestran los resultados de los experimentos de Western blot representativas, así como el análisis densitométrico de tres experimentos independientes. Se normalizaron los datos para controlar los niveles. B: actividad de la caspasa 3/7 se determinó con un ensayo luminiscente. Se muestran los resultados de al menos tres experimentos independientes. Los datos se normalizaron para controlar el cultivo de células. Leyenda: A: Control, B: 8-Cl-cAMP, C: AICAR, D: Compuesto C, E: 8-Cl-cAMP + Compuesto C, F: AICAR + Compuesto C. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001 frente a control.#P & lt; 0,05, ## P & lt; 0,01, ### P & lt; 0,001 vs. 8-Cl-cAMP. § P & lt; 0,05, §§ P & lt; 0,01, §§§ P. & Lt; 0,001 frente a AICAR
Discusión
análogos de cAMP inhiben la proliferación de varias células tumorales. El mejor estudiado de estos compuestos es 8-Cl-cAMP, lo que tiene un efecto antiproliferativo demostrado tanto
in vitro
y
in vivo
y ha sido evaluado en fase I /II de ensayos clínicos [11 ], [12], [13]. En un estudio reciente, se ha descrito el efecto antiproliferativo de un par de cAMP análogos selectivos para PKA I en líneas celulares de carcinoma humanos [19]. El objetivo de este trabajo fue comparar el efecto de estos análogos de cAMP a la de la bien estudiada 8-Cl-cAMP y más investigación de su mecanismo (s) de la acción. Los resultados sugieren que 8-Cl-cAMP y los análogos de AMPc PKA I-selectivos, aunque de potencia similar, se diferencian en células de tipo selectividad y mecanismo (s) de acción. Los análogos de cAMP PKA I-selectivos inducir la detención del crecimiento, pero no apoptosis, y, como hemos mostrado anteriormente, sus efectos parecen estar mediados por una inhibición de PKA dependiente de la activación de ERK. Por el contrario, los efectos de 8-Cl-cAMP más probable es ejercida por su metabolito 8-Cl-adenosina, son independientes de la activación de PKA, y al parecer son mediados por la activación de AMPK y p38 MAPK posterior dependiente de la inducción de la apoptosis.
Nuestros datos indican que 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos tienen un efecto antiproliferativo de manera similar potente, lo que sugiere que ambos pueden retener un potencial para la terapia del cáncer. Los análogos de cAMP PKA I-selectivos parecen requerir la presencia de la activación de ERK constitutivo, según lo sugerido por su ser altamente activa sólo en los BRAF
células ARO y NPA V600E-mutado, en las que inhiben la fosforilación de ERK. Por el contrario, 8-Cl-cAMP inhibe fuertemente el crecimiento celular también en las células WRO BRAF-negativo, lo que sugiere que puede ser eficaz en una gama más amplia de las células cancerosas.
Varios hallazgos indican que la 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos actúan a través de diferentes mecanismos. En primer lugar, el efecto de 8-Cl-cAMP parece estar mediada principalmente, de acuerdo con observaciones anteriores [15], [16], [17], [18], por su metabolito 8-Cl-adenosina, actuando a través de AMPK, y no por estimulación de la PKA, como se sugiere por el efecto de IBMX y de selectiva la activación de AMPK /inhibición; por el contrario, IBMX no modifica la respuesta antiproliferativa de los análogos de cAMP PKA I-selectivos. En segundo lugar, 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos producen modificaciones diferentes de ciclo celular. En particular, 8-Cl-cAMP, pero no los análogos de cAMP PKA I-selectivos, inducir la apoptosis. En tercer lugar, los análogos de cAMP PKA I-selectivos, pero no 8-Cl-cAMP, reducen la fosforilación de ERK en células ARO y NPA. En cuarto lugar, 8cl-cAMP, pero no los análogos de cAMP PKA I-selectivos, aumentan la fosforilación de p38 MAPK.
El mecanismo de acción de 8-Cl-cAMP es muy debatida. Cho-Chung y sus colegas han hecho una cantidad considerable de trabajo sobre este tema, cuyos resultados indican que el 8-Cl-cAMP induce la inhibición del crecimiento por el aumento de la RI de RII ratio [14], [21]. Por otra parte, los estudios más recientes sugieren que esta regulación no es la causa principal de la inhibición del crecimiento observado [17]. En este informe nos encontramos con que el 8-Cl-cAMP reduce la expresión de RIα en células ARO, de mora y WRO. Sin embargo, nos encontramos con que IBMX, que bloquea la conversión de 8-Cl-cAMP a 8-Cl-adenosina, un metabolito incapaz de activar PKA, reduce significativamente el efecto antiproliferativo de 8-Cl-cAMP.
A estudio reciente [25] ha demostrado que 8-Cl-adenosina es capaz de estimular la AMPK, por lo que se investigó la participación de esta vía en la apoptosis inducida por 8-Cl-cAMP. Nuestros datos muestran que la inducción de apoptosis por 8-Cl-cAMP está acompañada por la activación de la caspasa 3/7, y resultados similares se obtuvieron por AICAR, un activador de AMPK. Además, el compuesto C, un inhibidor de la AMPK, previene la inducción de la caspasa 3/7 de ambos AICAR y 8-Cl-cAMP respectivamente. Al final, proponemos que el efecto pro-apoptótica de 8-Cl-cAMP está mediada por la AMPK
.
Además, se muestra que el efecto pro-apoptótica de 8-Cl-cAMP se acompaña de una progresivo aumento de la fosforilación de p38 MAPK. El MAPK p38 es un regulador clave de la supervivencia celular [26], [27], y ha sido implicado en el efecto pro-apoptótico de 8-Cl-cAMP en HL60 y células HeLa [24], [25]. Para investigar si la activación de p38 MAPK es dependiente de la AMPK se empleó una estrategia de activación /inhibición similar a la adoptada para la caspasa 3/7. Desde bloqueo AMPK impedido en gran medida y la activación de AMPK imitaba los efectos de 8-Cl-cAMP en la MAPK p38, nuestros datos sugieren fuertemente que la 8-Cl-cAMP después de la conversión en su metabolito 8-Cl-adenosina activa la MAPK p38 a través de la estimulación de la AMPK.
en un intento por aclarar el camino que conduce a la activación de la caspasa 3/7, que mide la actividad de las caspasas aguas arriba 8 y 9, que están involucrados en el extrínsecos e intrínsecos vías de apoptosis, respectivamente. Considerando que no se observó la activación de la caspasa 9, se ha detectado un transitorio temprano y solamente (5 min-1 h) la activación de la caspasa 8. Estos datos podrían indicar una implicación de la vía extrínseca de los efectos pro-apoptóticos de 8-Cl-cAMP. Sin embargo, dado el retraso largo observado entre la activación de la caspasa 8 y 3/7, y la naturaleza transitoria de la activación de caspasa 8, es posible que otros mecanismos, probablemente independiente de caspasas aguas arriba, podrían estar implicados en la activación de caspasa 3 /7. Curiosamente, aunque los mecanismos por los que la MAPK p38 puede activar caspasas no se aclaran completamente, también se ha informado de una posible activación directa de la caspasa 3 por la MAPK p38 [28].
En conclusión, nuestros datos indican que tanto 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos tienen un efecto antiproliferativo de manera similar potente sobre líneas celulares de cáncer de origen diferente. Por lo tanto, ambos conservan un potencial como medicamentos contra el cáncer. 8-Cl-cAMP parece ser eficaz en una gama más amplia de tipos de células e induce apoptosis. Por otra parte, el mecanismo (s) de acción de 8-Cl-cAMP y los análogos de cAMP PKA I-selectivos son diferentes, lo que sugiere que pueden tener perfiles farmacológicos y toxicológicos no similares, así como las propiedades antitumorales únicas. Futuro
in vivo
experimentos serán necesarios para comparar su eficacia y tolerabilidad en modelos preclínicos de cáncer.
Materiales y Métodos
Química
reactivos de cultivo celular se comprado de Invitrogen (San Giuliano Milanese, Italia). 8-cloroadenosina-3 ', 5'-monofosfato cíclico (8-Cl-cAMP), 8-piperidinoadenosine-3', 5'-monofosfato cíclico (8-PIP-cAMP) y 8-hexylaminoadenosine-3 ', 5'cyclic monofosfato (8-HA-cAMP) fueron adquiridos de BIOLOG Life Science Institute (Bremen, Alemania). Las membranas de nitrocelulosa y kit BCA fueron adquiridos de Pierce Biotechnology (Rockford, IL). PKARIα, PKARIIα, PKARIIβ y anticuerpos beta-actina se compraron de BD Biosciences Pharmingen (Milan, Italia). anticuerpos fosfo-ERK, fosfato Akt, p38 MAPK fosfato, ERK, Akt y MAPK p38 fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). HRP de ratón conjugado y de conejo secundaria de anticuerpos fueron adquiridos de Chemicon International (Temecula, CA). El kit ECL-plus se adquirió de Amersham Biosciences Europe (Freiburg, Alemania). El kit de detección de muerte celular de ELISA Plus se adquirió de Roche Applied Science (Mannheim, Alemania). La viabilidad celular CellTiter-Azul y la caspasa-Glo 3/7, 8 o 9 ensayos se adquirieron de Promega Corporation (Madison, WI, EE.UU.). 4- (4-fluorofenil) -2- (4-metilsulfinilfenil) -5- (4-piridil) 1H-imidazol (SB203580) se adquirió de Biosource (Nivelles, Bélgica). 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 4- (4-fluorofenil) -2- (4-hidroxifenil) -5- (4-piridil) -1H-imidazol (SB202190), bisindolyl-maleimida I (GF109203X), AICAR, 6- [4- (2-piperidin-1-iletoxi) fenil] -3-piridin-4-ilpirazolo [1,5-a] pyriimdine (Compuesto C) y todos los demás reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Milán , Italia).
cultivo de células
células
ARO, de mora y WRO fueron amablemente proporcionados por I. Bongarzone (Milán, Italia). Un reciente análisis de perfiles de ADN ha revelado que las células ARO coinciden con la línea celular de cáncer de colon HT-29 y células NPA coinciden con la línea celular de melanoma M14 /MDA-MB-435S [29]. células WRO derivan de un carcinoma folicular de tiroides [30]. Todas las células se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina y 1% de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2.
activación selectiva de PKA I
Para activar selectivamente PKA I, se utilizó la estrategia usada comúnmente de utilizar simultáneamente dos análogos de cAMP distintas, es decir, 8-piperidinoadenosine-3 ', 5'-monofosfato cíclico (8-PIP-cAMP) y 8-hexylaminoadenosine-3 ', monofosfato 5'cyclic (8-HA-cAMP), cada uno con una alta selectividad por la unión a cualquiera de los sitios a (8-PIP-cAMP) o B (8-HA-cAMP) de tipo I subunidades PKA R [19].
ensayo de proliferación de
la proliferación celular se evaluó utilizando el ensayo de 3- (4,5-dimetylthiazole-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), tal como se describe anteriormente [19 ]. Brevemente, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos, y 24 h después de la siembra se trataron con las concentraciones indicadas de 8-Cl-cAMP o de los análogos de cAMP PKA I-selectivos (8-PIP-cAMP + 8-HA-cAMP). Para la inhibición de la PKC, las células se incubaron durante 30 min con GF109203X antes de la adición de 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos. Se añadió MTT (0,5 mg /ml) a las células tres horas antes de la medición, y cristales de formazán, formadas por la reducción mitocondrial de MTT, se solubilizaron en DMSO /etanol 01:01. Crecimiento relativo se calculó a partir de la absorbancia a 550 nm utilizando la siguiente ecuación: el crecimiento relativo (%) = (OD
550 nm de los pocillos tratados /OD
550 nm de los pocillos de control) x 100
Detección. de apoptosis se evaluó la fragmentación del ADN
fragmentación del ADN utilizando el kit de la célula de la muerte de detección ELISA Plus. Este ensayo proporciona una determinación cuantitativa de los fragmentos de las histonas asociadas de ADN (mono- y oligo-nucleosomas) en la fracción citoplasmática de los lisados celulares. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y 24 horas más tarde tratadas con 8-Cl-cAMP o los análogos de cAMP PKA I-selectivos para 48 h. Las muestras se procesaron a continuación y se analizaron por triplicado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Determinación de las actividades de caspasa
se midió la actividad caspasa utilizando el luminiscente caspasa-Glo 3/7, 8 o 9 ensayos , siguiendo las instrucciones del fabricante. Caspasa 3/7 actividad se normalizó para el número de células contenidas en cada pocillo, determinada utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue fluorométrico. los niveles de activación de las caspasas 8 y 9 se expresan en relación a las muestras no tratadas. Luminiscentes y fluorescentes mediciones se realizaron utilizando el lector Fluoroskan Ascenso FL multidisco (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia).
Análisis del ciclo celular por citometría de flujo
Las células se cosecharon por tripsinización, se lavaron en PBS y luego se fija con helado de etanol al 70%. Las células fijadas se lavaron con PBS y se tiñeron con PBS que contenía 40 mg /ml de yoduro de propidio y 100 mg /ml de ARNasa A en 37 ° C durante 30 min. Las muestras se analizaron con el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Buccinasco, Italia).
Western El análisis de transferencia
Para la detección de subunidades reguladoras de PKA, las células se lisaron en tampón RIPA modificado que contiene inhibidores de la proteasa ( 10 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 500 mM, 0,1% de SDS, 1% de NP40, 1% de Na desoxicolato, EDTA 2 mM, 2 mM de Na
2VO
4, Na 2 mM
4P
2O
7, NaF 2 mM). Para la detección de ERK, Akt y fosforilación de MAPK p38, las células se lisaron con tampón de SDS de muestra (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, DTT 50 mM, 0,01% azul de bromofenol), se calienta inmediatamente 5 min a 95 ° C y se sometió a ultrasonidos. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Apoyo a la Información
Figura S1..