Extracto
Antecedentes
La multirresistencia (MDR) es un problema importante en el éxito del tratamiento de los cánceres. ABCG2 humano, un miembro de la superfamilia de unión a ATP transportador de casete, desempeña un papel clave en la MDR y un papel importante en la protección de células madre de cáncer. Knockout de ABCG2 no tuvo ningún efecto adverso aparente sobre los ratones. Por lo tanto, ABCG2 es un objetivo ideal para el desarrollo de agentes quimio-sensibilizar para un mejor tratamiento de los cánceres resistentes a los medicamentos y ayudar a erradicar las células madre del cáncer.
Métodos /Resultados Preliminares
Usando la selección de racional de los representantes de una biblioteca de compuestos químicos, hemos encontrado un nuevo inhibidor de ABCG2, PZ-39 (N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide), que tiene dos modos de acción mediante la inhibición de la actividad ABCG2 y mediante la aceleración de su degradación lisosoma-dependiente. PZ-39 no tiene efecto en ABCB1 y eflujo de fármaco ABCC1 mediada, resistencia, y su expresión, lo que indica que puede ser específica para ABCG2. Los análisis de sus compuestos análogos mostraron que el farmacóforo de PZ-39 se benzotiazol vinculado a un esqueleto anillo de triazina.
Conclusión /Importancia
A diferencia de los inhibidores del transportador ABCG2 previamente conocidos, PZ-39 tiene una novela de acción de dos modos mediante la inhibición de la actividad ABCG2, un efecto agudo, y mediante la aceleración de la degradación del lisosoma-dependiente, un efecto crónico. PZ-39 es potencialmente una sonda valiosa para los estudios de estructura-función de ABCG2 y un compuesto de plomo para el desarrollo de terapias dirigidas a MDR ABCG2 mediada en la quimioterapia del cáncer combinacional
Visto:. Peng H, Dong Z, Qi J, Yang Y, Liu Y, Li Z, et al. (2009) A Novel Dos Inhibidor Modo de acción prolongada de ABCG2 mediada por múltiples fármacos Transporte y resistencia en la quimioterapia del cáncer. PLoS ONE 4 (5): e5676. doi: 10.1371 /journal.pone.0005676
Editor: Pablo Cobine, Universidad de Auburn, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Marzo, 2009; Aceptado: 1 de mayo de 2009; Publicado: 24 de mayo de 2009
Derechos de Autor © 2009 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01 CA120221 y R01 CA113384. ZD e YY fueron apoyados, en parte, por el NRSA T32 y T32 DK07519 HL07910 de los Institutos Nacionales de Salud, respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la multirresistencia (MDR) es un problema importante en el éxito del tratamiento de los cánceres. se ha sugerido la sobreexpresión de algunos miembros de la superfamilia de transportadores (ATP-binding cassette) ABC para causar MDR. P-glicoproteína (MDR1 /ABCB1), proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1 /ABCC1), y la proteína de resistencia del cáncer de mama (BCRP /ABCG2) son los tres principales transportadores ABC que son actores principales en el desarrollo clínico de la MDR [1]. Uno de estos miembros, ABCG2 que se cree que existen y trabajar como homo-oligómeros de 8-12 subunidades [2], [3], [4], también se ha implicado a desempeñar papeles en la protección de células madre de cáncer, lo que resulta en drogas resistencia y fracaso de la quimioterapia del cáncer [5]. sustratos medicamento contra el cáncer de ABCG2 incluyen, pero no se limitan a los medicamentos contra el cáncer comúnmente usados, tales como adriamicina, mitoxantrona, y topotecan. De hecho, estudios clínicos recientes han demostrado que la sobre-expresión de ABCG2 en ambos adultos y la leucemia infantil se correlaciona muy bien con un mal pronóstico (para una revisión ver [6]). Knockout de ABCG2 no tuvo ningún efecto aparente adverso sobre el desarrollo, la bioquímica y la vida de los ratones [7]. Todas estas observaciones anteriores hacen ABCG2 un objetivo ideal para el desarrollo de agentes de quimioterapia sensibilizadores para un mejor tratamiento de los cánceres resistentes a los fármacos, y sugieren que la inhibición de ABCG2 poco probable causa ningún efecto secundario si el inhibidor es específico para ABCG2.
En comparación con los de resistencia causantes de transportadores ABC medicamento conocido como ABCB1 y ABCC1, ABCG2 fue descubierto hace relativamente poco tiempo y, por lo tanto, se han reportado pocos inhibidores específicos de ABCG2. Uno de los inhibidores específicos ABCG2 conocidos es el potente micotoxinas Fumitremorgina C (FTC) secretada por
Aspergillus fumigatus
[8], [9]. Sin embargo, la neurotoxicidad de FTC limita su potencial terapéutico. Los análogos de FTC, como Ko132 y Ko143, se han desarrollado con baja toxicidad [10], pero no se conoce todavía si es eficaz en ensayos clínicos. Además, se han descrito otros inhibidores de la ABCG2 [11], [12]. Sin embargo, estos agentes, tales como GF120918, parecen carecer de especificidad debido a su efecto sobre ABCB1 y /o ABCC1 [13], [14]. Claramente, se necesitan inhibidores ABCG2 más específicos para el desarrollo futuro de potenciales quimio-sensibilizadores a mejores cánceres resistentes a los fármacos delicia.
En este trabajo, nos informe descubrimiento de un nuevo inhibidor específico ABCG2, PZ-39 (N- ( 4-clorofenil) -2 - [(6 - {[(4-morfolinilo 4,6-di) -1,3,5-triazin-2-il] amino} -1,3-benzotiazol-2-il) sulfanil ] acetamida), que es mucho más eficaz en la reversión de resistencia a los fármacos mediada por ABCG2 y menos citotóxico para las células cultivadas en comparación con FTC. PZ-39 parece tener dos modos de acción, causando la degradación ABCG2 (crónica), además de la inhibición de su actividad (aguda). El efecto similar de tres compuestos PZ-39 relacionados reveló base estructural para el diseño de inhibidores específicos ABCG2 más potentes en el futuro.
Resultados
Efecto del compuesto PZ-39 sobre la acumulación de mitoxantrona
el uso de una proyección racional de los representantes de las diferentes clases de una pequeña biblioteca de compuestos de molécula de Especificaciones (www.specs.net) para los inhibidores potenciales de la salida del fármaco mediada ABCG2, hemos identificado un compuesto, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide) con benzotiazol vinculado a la columna vertebral anillo de triazina, (llamado PZ-39 a partir de entonces, ver Fig. 1) que revirtió drásticamente la acumulación de mitoxantrona en las células MCF7 /AdVp3000 que ABCG2 sobre-expresa. Como se muestra en la Fig. 2A, PZ-39 mejorado acumulación mitoxantrona en MCF7 /AdVp3000 pero no se ha inhibido las células MCF7 sensibles parentales que no producen ABCG2, lo que sugiere que el eflujo de fármaco ABCG2 mediada. Dado que las células MCF7 /AdVp3000 también sobre-expresan otros transportadores ABC como ABCC3 además de ABCG2 [15], PZ-39 puede inhibir los transportadores ABC de otros ABCG2, lo que lleva a un aumento de la acumulación de mitoxantrona. Para probar directamente si PZ-39 inhibe ABCG2, hemos realizado estudios similares usando células HEK293 transfectadas ABCG2 estable (HEK293 /ABCG2) [3]. Como se muestra en la Fig. 2B, pre-incubación de las células con PZ-39 mejorado acumulación mitoxantrona intracelular en células HEK293 /ABCG2, pero no en el control transfectadas con vector (HEK293 /Vec) células. Por lo tanto, PZ-39 inhibe probable ABCG2 mediada por flujo de salida de la mitoxantrona. Figs. 2A y 2B muestran también que PZ-39 en 3,3 M alcanzó nivel equivalente de efectivo el conocido inhibidor específico ABCG2 FTC en 10 M, lo que sugiere que PZ-39 puede ser ~ 3 veces más potente que la FTC.
PZ -39, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide, y sus análogos C6, C8 y E2 todos contienen un benzotiazol vinculado a un esqueleto de anillo de triazina. Los tres anillos intactos están etiquetados como A, B y C.
A y B, la acumulación de mitoxantrona en MCF7 o sus células MCF7 /AdVp3000 (A) y HEK293 sublínea resistente a los medicamentos transfectadas con el vector o ABCG2 (B) después de una incubación de 30 minutos en ausencia o presencia de PZ-39 (3,3 M) o FTC (10 M). Los datos son medias ± SD de tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 en comparación con vehículo DMSO). C y D, respuesta a la dosis de PZ-39 y FTC en la restauración de la acumulación de mitoxantrona en células HEK293 transfectadas ABCG2. La línea gruesa muestra el nivel de acumulación de mitoxantrona en células HEK293 transfectadas con el vector, que sirve como control.
Para investigar más la potencia de PZ-39 para ABCG2, el efecto dosis-respuesta de PZ-39 en la acumulación de mitoxantrona en HEK293 /células ABCG2 se determinaron usando citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 2C, el nivel mitoxantrona intracelular se incrementó en PZ-39 de una manera dependiente de la dosis. En 3,3 M, PZ-39 completamente restaurada de nivel de mitoxantrona intracelular en las células /ABCG2 HEK293. FTC, por su parte, alcanzó un nivel similar de efecto a 10 M (Fig. 2D), el fundamento de que PZ-39 es más potente que la Comisión Federal de Comercio (véase más arriba).
La sensibilización de la farmacorresistencia por PZ-39
Para investigar el posible uso de PZ-39 como quimio-sensibilizador de la resistencia a los medicamentos ABCG2 mediada, el efecto de PZ-39 en respuesta a los fármacos de las células /ABCG2 HEK293 se determinó en ausencia o presencia de 0,1 M mitoxantrona que por sí sola produce la muerte celular ~ 10%. Como se muestra en la Fig. 3A y 3B, PZ-39 no es citotóxico para las células HEK293 ABCG2 /y su IC
50 no es medible dentro del intervalo de concentración utilizado, mientras que la IC
50 de FTC es ~ 24 M. El IC
50 de PZ-39 y la FTC requerida para sensibilizar a la resistencia a la mitoxantrona es ~ 15 nM y ~387 nM, respectivamente. El índice de potencia de PZ-39 se estima que es & gt; 1600 mientras que la de FTC es solamente ~62 (Tabla 1)
A y B, el índice de potencia de PZ-39 en comparación con FTC en la reversión de la resistencia a mitoxantrona. . células HEK293 /ABCG2 fueron tratadas sin o con 0,1 M (IC
10) mitoxantrona en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de PZ-39 (A) o FTC (B), seguido por el ensayo de SRB. Los datos son una representativos de cuatro experimentos independientes. C y D, índice de sensibilización de PZ-39 (C) en comparación con FTC (D) en células /ABCG2 HEK293. células HEK293 /ABCG2 se trataron con varias concentraciones de mitoxantrona en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de PZ-39, seguido por el ensayo de SRB. Los datos son una representativos de cuatro experimentos independientes. E, a múltiples fármacos índice de sensibilización de PZ-39 en las células MCF7 /AdVp3000 drogas seleccionado. células MCF7 /AdVp3000 se trataron con varias concentraciones de adriamicina (ADR), camptotecina (CPT), o mitoxantrona (MX) en presencia de DMSO (vehículo), 200 nM PZ-39, o FTC seguido por el ensayo de SRB. índice de Sensibilización se calculó utilizando IC
50 de mitoxantrona en ausencia o presencia de PZ-39 o FTC. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Para investigar más a fondo la actividad inhibidora de PZ-39 en ABCG2, los efectos de PZ-39 sobre la citotoxicidad en células HEK293 mitoxantrona /ABCG2 se evaluaron las células en presencia de tres concentraciones diferentes de PZ-39 (50, 200, y 500 nM) o el control de vehículo (0,1% DMSO). Como se muestra en la Fig. 3C, PZ-39 en 50 nM redujo significativamente el IC
50 de mitoxantrona con un índice de sensibilización de 0,4 (Tabla 2). A 500 nM, el índice de sensibilización de PZ-39 es 0,04, mientras que la de FTC a la misma concentración es 0,26 (Fig. 3D y Tabla 2). Estos resultados muestran que PZ-39 es un nuevo inhibidor de ABCG2 muy potente.
Para investigar si PZ-39 puede revertir la resistencia a múltiples fármacos ABCG2 mediada en una línea celular de cáncer resistente a fármacos, se utilizó la droga seleccionado células MCF7 /AdVp3000 y probado dos sustratos de drogas anticáncer adicionales de ABCG2, adriamicina y camptotecina. Como se muestra en la Fig. 3E, PZ-39 a 200 nM redujo drásticamente la resistencia de MCF7 /AdVp3000 a adriamicina y camptotecina similar a la mitoxantrona, mientras que el control FTC mostró un efecto mucho menor de sensibilización para los tres fármacos en comparación con PZ-39 a la misma concentración.
Dos modos de acción
Para entender el mecanismo de acción PZ-39 en la inhibición del transporte de drogas ABCG2 mediada, se determinó primero la cinética de inhibición PZ-39 Uso aislado dentro a fuera vesículas de membrana [16] . Se determinó el cambio en la absorción de mitoxantrona en presencia de diferentes concentraciones de PZ-39. Como se muestra en la gráfica de Lineweaver-Burk (Fig. 4A), la Vmax y Km del transporte mitoxantrona en ausencia de PZ-39 se estimaba que había 2,3 M y 455 pmol /mg de proteína, respectivamente. Parece que tanto la Km y Vmax de transporte mitoxantrona se han reducido en presencia de PZ-39 con una Ki estimada de ~0.52 mu M, lo que sugiere que PZ-39 se comporta como un inhibidor de tipo mixto de transporte mitoxantrona [17]. Ya que también fue originalmente especularon que algunos inhibidores competirían con el sitio de unión del ATP de transportador ABCG2, se realizó otro experimento usando ATP como sustrato variable. Como se muestra en la Fig. 4B, tanto en el Km y Vmax de transporte mitoxantrona también fueron alterados por PZ-39. Por lo tanto, nuestro estudio mostró que el proceso de transporte mitoxantrona y de unión de ATP puede ser inhibida por PZ-39 con un tipo mixto de mecanismo. Probablemente, PZ-39 se une a un sitio diferente en ABCG2 tanto de mitoxantrona y ATP, no inhibidor competitivo de cualquiera de ellos.
Dentro de salida vesículas de membrana plasmática de células HEK293 /ABCG2 células se incubaron con 0,6, 1,2 , y 1,8 mM [
3H] mitoxantrona (A) o con 0,1, 0,2, 0,5, 1, y 5 mM ATP junto con 0,6 M [
3H] mitoxantrona (B) en la ausencia o presencia de diferentes concentraciones de PZ-39 a 37 ° C durante 5 min seguido de la determinación de la absorción de mitoxantrona. Los datos mostrados son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes.
A continuación se probó si PZ-39 posiblemente inhibe oligomerización ABCG2 desde ABCG2 se ha sugerido para funcionar como un homodímero o formas superiores de oligómeros y oligomerización puede ser utilizado como diana para fármacos terapéuticos desarrollo [2], [3]. Para este propósito, co-inmunoprecipitación de dos ABCG2 diferencialmente etiquetados se realizó tal como se describe anteriormente [2] después de un tratamiento de 6 horas con PZ-39 a 3,3 mM. Sin embargo, ningún efecto de PZ-39 en ABCG2 co-inmunoprecipitación se encontró (Supplemental Fig. S1), lo que sugiere que PZ-39 no afecta oligomerización ABCG2.
Para examinar más a fondo el mecanismo de PZ-39 efecto sobre la ABCG2, se realizó un análisis de transferencia de Western de la expresión ABCG2 después del tratamiento PZ-39. Como se muestra en la Fig. 5A, el nivel de estado estacionario de la proteína ABCG2 disminuyó drásticamente en 1 día después del tratamiento PZ-39. Sin embargo, sólo tenía disminución marginal a las 2 horas después del tratamiento PZ-39. Como se describió anteriormente, PZ-39 fue capaz de inhibir ABCG2 mediada por flujo de salida de mitoxantrona de las células resistentes a los medicamentos con 1 h de incubación. Estos hallazgos sugieren que PZ-39 puede tener dos modos de acción mediante la inhibición de la actividad (efecto agudo) y la expresión (efecto crónico) de ABCG2 y coherente con nuestra observación de que PZ-39 es de aproximadamente 3 veces mejor que FTC en el ensayo de acumulación del fármaco ( efecto agudo), pero ~ 7 veces más potente en el ensayo de sensibilización fármaco (efecto crónico).
a, efecto de PZ-39 en el nivel de estado estacionario ABCG2. Las células HEK293 /ABCG2 fueron tratados con DMSO vehículo o 3,3 M PZ-39 durante varias veces y se recogieron para su análisis western blot de la expresión ABCG2. B, efecto de PZ-39 en la estabilidad ABCG2. células HEK293 /ABCG2 fueron tratados primero con cicloheximida (5 g /ml) seguido de la adición de 3,3 M PZ-39 o DMSO durante diversos tiempos y se recogieron para análisis de transferencia Western. C, la vida media de ABCG2. niveles ABCG2 en transferencia de Western como se muestra en B se determinaron utilizando Scion Image y se representaron frente al tiempo de tratamiento. Los datos mostrados son la media ± S.D. de cuatro experimentos. D, efecto de PZ-39 en 5D3 tinción de ABCG2. HEK293 /ABCG2 células fueron tratadas y sin (línea fina) o con (línea gruesa) del vehículo DMSO, 10 mM PZ-39 o FTC seguido por tinción con el anticuerpo monoclonal 5D3 y citometría de flujo análisis. E, efecto de FTC sobre la expresión ABCG2. Las células HEK293 /ABCG2 fueron tratados con 10 mM FTC durante varios tiempos y se recogieron para su análisis western blot de la expresión ABCG2. F, efecto de bafilomycin A
1 y MG-132 sobre la degradación inducida ABCG2-PZ-39. células HEK293 /ABCG2 se trataron con 3 M PZ-39 en ausencia o presencia de 10 nM bafilomicina A
1 o 2 M MG-132 durante diversos tiempos y se recogieron para análisis de transferencia Western de la expresión ABCG2. GAPDH se utilizó como control de carga en todo el análisis de Western blot.
Para determinar si el efecto crónico de PZ-39 en la expresión ABCG2 está en el nivel de ARNm, se realizó un análisis en tiempo real de RT-PCR de MCF7 /AdVp3000 y HEK293 /ABCG2 células tratadas con PZ-39 para las varias horas hasta 3 días. Ningún cambio significativo se observó en el nivel de ARNm ABCG2 después del tratamiento PZ-39 en cualquiera de las líneas de células (véase suplementaria Fig. S2). Por lo tanto, PZ-39 afecta poco probable ABCG2 expresión en su nivel de mRNA. Seguidamente, la hipótesis de que el mecanismo de inhibición PZ-39 mediada sería un proceso posttranscriptional y examinamos la posibilidad de que PZ-39 puede acelerar la degradación de ABCG2. Para probar esta posibilidad, las células HEK293 /ABCG2 fueron pre-tratados con cicloheximida, que actúa mediante la inhibición de la elongación durante la síntesis de proteínas, seguido de tratamiento con PZ-39 para las varias veces para determinar la tasa de degradación ABCG2. Como se muestra en la Fig. 5B, la pérdida de ABCG2 en las células tratadas con una combinación de PZ-39 y cicloheximida era mucho más rápido que el del tratamiento de control sin PZ-39. La vida media de ABCG2 en presencia de PZ-39 se estima en ~ 5 horas mientras que es estable con una vida media estimada de ~54 horas en el control (Fig. 5C). Por lo tanto, PZ-39 probablemente acelera la degradación de la proteína ABCG2.
Efecto de PZ-39 en conformación ABCG2 y estabilidad
La degradación acelerada de ABCG2 por PZ-39 puede ser debido a que PZ -39 induce un cambio conformacional y se dirigen a ABCG2 para la degradación. Para determinar si PZ-39 potencialmente provoca cambios conformacionales de ABCG2, se utilizó el anticuerpo monoclonal 5D3 que se ha informado anteriormente para unirse a ABCG2 en la superficie celular más fácilmente en presencia de inhibidores de ABCG2 presumiblemente debido a la inducida por inhibidores de cambios conformacionales [12] , [18]. Como se muestra en la Fig. 5D, PZ-39 provocó un aumento de la tinción 5D3, lo que sugiere un posible cambio conformacional de ABCG2 a PZ-39 de unión. FTC también aumentó la tinción 5D3 como se esperaba. Sin embargo, no afectó el nivel de ABCG2 (Fig. 5E), lo que sugiere que el cambio conformacional inducido por la FTC y PZ-39 puede ser diferente. Se ha informado recientemente de que existen dos vías distintas para la degradación de tipo salvaje y las proteínas mutantes ABCG2 [19]. Si bien la naturaleza y tipo de proteína plegada correctamente se degrada en los lisosomas, la proteína mal plegada mutante y está implicado en la degradación de proteínas mediada por ubiquitina en proteasomas. A fin de determinar el mecanismo de la degradación inducida por ABCG2 PZ-39, se empleó bafilomicina A
1, un inhibidor de la degradación de proteínas en los lisosomas, y MG-132, un inhibidor de proteosoma. Como se muestra en la Fig. 5F, co-tratamiento de las células con bafilomicina A
1 y PZ-39 inhibió-39 inducida por PZ degradación ABCG2 mientras que co-tratamiento con MG-132 y PZ-39 no lo hizo, lo que indica la degradación ABCG2 la inducida-PZ-39 es probable lisosoma-dependiente. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que PZ-39 provoca un cambio conformacional de ABCG2 y objetivos para la degradación normal en los lisosomas.
Efecto de PZ-39 en ABCB1- o transporte de fármacos Abcc1 mediada
Para determinar la especificidad de PZ-39, hemos probado el efecto de PZ-39 en los otros dos transportadores ABC importantes bien conocidos en la MDR, ABCB1 y ABCC1. El efecto de PZ-39 en ABCB1 y disminución ABCC1 mediada en la acumulación de adriamicina intracelular se ensayó usando MCF7 células transfectadas con ABCB1 (FC19) [20] y las células transfectadas HEK293 con ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [16], [21 ]. No se encontraron efectos de PZ-39 sobre la actividad de ABCB1 y ABCC1 en la disminución de la acumulación de adriamicina (ver suplementario. Figura S3 A). También se encontró ningún efecto de PZ-39 en el nivel de proteína en estado estacionario de ABCB1 y ABCC1 después de 3 días de tratamiento (Fig. S3B). Por lo tanto, es probable PZ-39 es específico para ABCG2 entre estos tres bien conocidos los transportadores ABC MDR-causando que se cree que desempeñan un papel importante en la resistencia a fármacos clínicos.
Efecto de PZ-39 análogos en ABCG2
para entender mejor el farmacóforo de PZ-39, que aprehendidas 3 análogos de PZ-39 para la acumulación de fármacos y ensayos de resistencia utilizando HEK293 /ABCG2 células en comparación con PZ-39. Estos análogos (C6, C8, y E2), todos tienen los mismos anillos intactos A, B y C como PZ-39 pero con diferentes grupos laterales (Fig. 1). Los tres análogos tenían actividad similar como PZ-39 en el aumento de la acumulación de mitoxantrona (Fig. 6A) y la sensibilización de la resistencia a mitoxantrona en HEK293 /ABCG2 (Fig. 6B). Para determinar el efecto crónico de estos análogos sobre la expresión ABCG2, se realizó un análisis de transferencia Western después del tratamiento con C6, C8 y E2 para las varias horas hasta 3 días. Como se muestra en la Fig. 6C, los tres análogos causó la disminución de expresión de ABCG2. Además, todos estos análogos también causaron cambios conformacionales en ABCG2 similares a PZ-39 (Fig. 6D). Por lo tanto, probable que el benzotiazol vinculado a un esqueleto de anillo de triazina puede ser la estructura de núcleo para la unión a y la inhibición de la función y la estabilidad ABCG2
.
A, los efectos de sus compuestos análogos PZ-39 y (3 M) sobre la acumulación de mitoxantrona en células /ABCG2 HEK293. Los datos mostrados son la media ± S.D.. de triplicados experimentos. B, el índice de sensibilización de PZ-39 y compuestos relacionados en células HEK293 /ABCG2. células HEK293 /ABCG2 se trataron con varias concentraciones de mitoxantrona en ausencia o presencia de 50 nM PZ-39, C6, C8, y E2 siguieron mediante el ensayo de SRB. índice de Sensibilización se calculó utilizando IC
50 de mitoxantrona en ausencia o en presencia de compuestos inhibidores. Los datos son la media ± S.D.. de cuatro experimentos independientes. C, efecto de los compuestos PZ-39 y afines seleccionados en el nivel de estado estacionario ABCG2. células HEK293 /ABCG2 se trataron con vehículo DMSO o 3 M PZ-39, C6, C8, o E2 durante diversos tiempos y se recogieron para análisis de transferencia Western de la expresión ABCG2. D, efecto de PZ-39 y compuestos relacionados en 5D3 tinción de ABCG2. HEK293 /ABCG2 células fueron tratadas y sin (línea fina) o con (línea gruesa) del vehículo DMSO, 10 micras PZ-39 o sus compuestos relacionados C6, C8 y E2 seguido de tinción con el anticuerpo monoclonal 5D3 y citometría de flujo análisis.
Discusión
en este estudio, se investigó un nuevo inhibidor específico potente de ABCG2 humano, PZ-39, como agente terapéutico potencial para sensibilizar a la resistencia a fármacos en la quimioterapia del cáncer. PZ-39 contiene benzotiazol ligado a un esqueleto anillo de triazina. Su mecanismo de acción parece ser en dos modos; la inhibición de tipo mixto en función de transporte de drogas y acelerada degradación del lisosoma que dependen de ABCG2. PZ-39 no es citotóxico en sí con una CI
50 de & gt;. 24 mM mientras que es muy potente en la sensibilización de MDR de células cancerosas que sobreexpresan ABCG2
Muchos previamente reportado inhibidores ABCG2 tienen un amplio espectro de los objetivos de ABC transportador. ABCG2 inhibidor de GF120918, por ejemplo, de hecho, inhibe la función de ABCB1 más potentemente que ABCG2. Hasta ahora, muy pocos compuestos han sido identificados como inhibidores específicos de ABCG2. Un ejemplo de ello es el derivado de FTC no tóxico, Ko143. Es más potente que otros análogos de la FTC, y no tiene ninguna toxicidad en ratones a 10 a 50 mg /kg dosis oral [10]. Recientemente, dos de los compuestos de flavona, 6-prenylchrysin y tectochrysin, se ha demostrado que es específica para ABCG2 y no se detectó interacción con cualquiera de ABCB1 o ABCC1 [22]. El uso de selección de alto rendimiento, Henrich et al. varios compuestos que se encuentran que tienen actividad inhibidora similar o menor en comparación con la Comisión Federal de Comercio [11], [12]. Sin embargo, ninguno de estos inhibidores ABCG2 específicos reportados ha sido probado clínicamente.
En comparación con algunos de los inhibidores pasado conocido ABCG2 específicos, tales como FTC, el nuevo compuesto PZ-39 tiene tres ventajas distintivas. En primer lugar, PZ-39 es mucho más potente que el FTC en la inhibición de la función ABCG2. En el ensayo de acumulación del fármaco, PZ-39 logra claramente el mismo nivel de inhibición a 3,3 M en comparación con FTC en 10 mM. En ensayo de supervivencia celular, PZ-39 en 500 nM fue capaz de sensibilizar resistencia mitoxantrona ABCG2 mediada con un índice de 0,04, mientras que FTC a la misma concentración tiene un índice de sensibilización de 0,26, ~ 7 veces diferencia. En segundo lugar, PZ-39 tiene muy baja citotoxicidad intrínseca in vitro (& gt; 24 M), pero su índice de potencia es mucho mejor que FTC (1.600 frente a 62). Por lo tanto, la ventana de índice terapéutico de PZ-39 puede ser grande. Un quimio-sensibilizador ideal es que no debe ser tóxico en sí. Claramente, PZ-39 satisface este requisito en estudios in vitro en. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar la toxicidad de PZ-39 en modelos animales. En tercer lugar, PZ-39 parece tener dos modos de acción. Además de su capacidad para inhibir la actividad de ABCG2, PZ-39 también acelera su degradación lisosoma-dependiente. Este segundo modo de acción es un carácter distintivo y claramente aumenta la potencia de PZ-39 en ABCG2 posiblemente por el uso de reciclado PZ-39. Esta naturaleza no se ha informado de ningún inhibidores del transportador ABC conocidos anteriores.
Los dos modos de acción hacen PZ-39 un muy interesante, novedoso, y el inhibidor de ABCG2 prometedora para su posterior explotación. En el primer modo de efecto agudo sobre la función ABCG2, PZ-39 parece ejercer un tipo mixto de la inhibición en el ensayo de absorción del fármaco. PZ-39 puede interactuar con ABCG2 directamente, pero no parecen competir directamente con mitoxantrona o la unión de ATP. Se necesitan más estudios para identificar los sitios de unión PZ-39 en ABCG2. En el segundo modo, PZ-39 parece acelerar la degradación ABCG2 en los lisosomas, un efecto crónico. Es posible que la unión de PZ-39 causa el cambio conformacional en ABCG2 que se dirige para la degradación en los lisosomas. Es, sin embargo, cabe destacar que la unión de la FTC también causa ABCG2 cambio conformacional pero no llega a acelerar la degradación ABCG2. Este hallazgo sugiere que el cambio conformacional inducido por PZ-39 y la FTC puede ser diferente. Anteriormente, se ha encontrado que la cisteína degradación ABCG2 mutante es a través de proteosoma mientras que la degradación normal de ABCG2 tipo salvaje es a través de lisosoma [19] con una vida media de ~37 horas [23]. También se ha encontrado que la degradación inducida por el agonista de receptor β
2-adrenérgico es a través de lisosoma posiblemente por endocitosis mejorada [24]. Es tentador proponer que la unión de PZ-39 a ABCG2 es capaz de acelerar la endocitosis y el tráfico de la superficie celular ABCG2 en los lisosomas para la degradación. Extensos esfuerzos para evaluar esta hipótesis están actualmente en curso en nuestro laboratorio.
Los análogos de PZ-39, C6, C8 y E2 con la misma estructura de la base de todo parece que funciona mediante el mismo mecanismo que PZ-39. Claramente, se necesitan más estudios para probar más análogos de PZ-39 con más alteraciones en el núcleo de benzotiazol ligado a un esqueleto anillo de triazina y para dilucidar la relación estructura-actividad de PZ-39 en la inhibición ABCG2. Sin embargo, las observaciones de este estudio indican claramente que PZ-39 puede servir como un compuesto de plomo para su posterior diseño y optimización de inhibidores ABCG2 más específicos para un mejor tratamiento de los cánceres humanos resistentes a los fármacos en la terapia combinatoria.
Materiales y Métodos
Materiales
El anticuerpo monoclonal BXP-21 contra ABCG2, anti-Myc y los anticuerpos anti-HA fueron de ID Labs, la señalización celular, y Roche, respectivamente. antigody monoclonal contra Pgp, C219, fue una especie de regalo del Dr. Victor Ling (El Centro de Cáncer de Columbia Británica, Vancouver, Canadá). El anticuerpo monoclonal contra MRP, MRPr1, se adquirieron de Kamiya Biomedical Company. anticuerpo 5D3 conjugado con biotina y conjugados de ficoeritrina-estreptavidina fueron de eBiosciences. Todas las membranas de difluoruro de reactivos de electroforesis, kit de ensayo de concentración de proteína, geles de gradiente de poliacrilamida prefabricados y de polivinilideno se adquirieron de Bio-Rad. FTC, adriamicina, mitoxantrona, camptotecina, DTT, Sulforodamina B (SRB), y Triton X-100 fueron de Sigma. La proteína G-PLUS-agarosa y SYBR Green PCR Master Mix eran de Santa Cruz Biotechnology y Applied Biosystems, respectivamente. LipofectAMINE Plus y G418 eran de Invitrogen. medio de cultivo celular IMEM, DMEM, y [
3H] mitoxantrona eran de Biosource Internacional, Medios Tech., y Moravek bioquímicos, respectivamente. PZ-39 y tres compuestos relacionados fueron adquiridos de SPECS. Todos los demás productos químicos fueron de grado biología molecular de Sigma o Fisher Scientific.
Cultivo de células, preparaciones lisado, y de membrana
línea celular de cáncer de mama humano MCF7 (ATCC) y sus derivados líneas FC19 (una regalo de Julie Horton en el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental) y MCF7 /AdVp3000 (un regalo de Susan Bates en el Instituto Nacional del cáncer), HEK293 /ABCC1, HEK293 /vector, HEK293 /ABCG2 se cultivaron como se ha descrito anteriormente [2], [16 ], [20], [25]. preparación del lisado se realizó como se describe anteriormente [25]. Las membranas celulares se prepararon exactamente de la misma manera como se describe anteriormente [16] y las membranas finales se resuspendieron en STBS (sacarosa 250 mM, NaCl 150 mM, Tris 10 mM /HCl, pH 7,5).
Western blot , inmunoprecipitación, citometría de flujo y
Western blot, inmunoprecipitación, citometría de flujo y se llevaron a cabo exactamente análisis de la acumulación del fármaco como hemos descrito anteriormente [2], [3]. Para determinar el mecanismo de la degradación ABCG2, las células HEK293 /ABCG2 fueron tratados primero con 10 nM bafilomicina A
1 o 2 M MG132 durante 24 horas seguido por tratamiento adicional con 3 M PZ-39 durante diversos tiempos. Los lisados celulares se recogieron para el análisis de transferencia Western de ABCG2. Para determinar la vida media de ABCG2, las células HEK293 /ABCG2 fueron tratados con 5 mg /ml de cicloheximida, 3 M PZ-39, o ambos para diversas veces seguido por la recolección de los lisados celulares para análisis de transferencia Western de la expresión ABCG2. Para determinar el cambio en el anticuerpo 5D3 tinción después del tratamiento con inhibidores, las células /ABCG2 HEK293 fueron incubadas con 10 mM PZ-39, C6, C8, E2, o FTC a 37 ° C durante 30 min antes de anticuerpo 5D3 conjugado con biotina (1: se añadió una dilución 100) y se incubó durante 2 horas. Entonces, las células se lavaron 3 veces y se incubaron con estreptavidina-ficoeritrina durante 30 minutos seguido de un lavado de 3 veces y se analizaron por citometría de flujo.
tiempo real RT-PCR y ensayo de citotoxicidad
ARN extracción y en tiempo real de RT-PCR se realizaron como ya hemos descrito anteriormente [25]. Las secuencias de los cebadores 5'-ABCG2 son GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 '(hacia delante) y 5'-ATGGCGTTGAGACCAG-3' (hacia atrás). Las secuencias de los cebadores GAPDH son 5'-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 '(hacia delante) y 5'-CCATCACGCCACAGTTTCC-3' (hacia atrás). El nivel de ARN ABCG2 relativa (2
Ct) tratados con inhibidores se expresó como porcentaje del control (en presencia de 0,1% de DMSO) en la que? Ct (ciclo umbral) = (CT
ABCG2-CT
GAPDH ).
La citotoxicidad se determinó usando un ensayo colorimétrico SRB como se describe anteriormente [25]. El efecto de los inhibidores de compuestos sobre la resistencia a fármaco se determinó mediante la exposición de las células a un intervalo de concentraciones de fármacos contra el cáncer tales como mitoxantrona en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de inhibidor. El índice de potencia y la sensibilización de los inhibidores se calcularon como sigue:
acumulación del fármaco y el transporte de análisis cinético
ensayo de acumulación del fármaco se realizó como se describe anteriormente [16], [26] con algunas modificaciones. Brevemente, 10
6 células en cultivo se preincubaron con varias concentraciones de PZ-39, FTC, o control de vehículo (0,1% DMSO) durante 1 hora a 37 ° C, seguido de la adición de 20 mM mitoxantrona y la incubación durante 30 minutos.