Extracto
Antecedentes
El cáncer de pulmón es la causa principal de cáncer la mortalidad en todo el mundo, sin embargo, la estrategia terapéutica para el cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM) es limitadamente eficaz. Además, los inhibidores de la histona desacetilasa validado (HDAC) para el tratamiento de tumores sólidos aún no se han desarrollado. En este caso, se propone un nuevo inhibidor de HDAC, OSU-HDAC-44, como un fármaco quimioterapéutico para el NSCLC.
Metodología /Principales conclusiones
El efecto de citotoxicidad de OSU-HDAC-44 fue examinado en tres líneas celulares de cáncer humano incluyendo A549 (p53 de tipo salvaje), H1299 (p53 nulo) y CL1-1 (p53 mutante). Los mecanismos antiproliferatative de OSU-HDAC-44 fueron investigados por el análisis del ciclo celular por citometría de flujo, ensayos de apoptosis y análisis de todo el genoma de la cromatina-inmunoprecipitación en chip (Chip-a-chip). Los ratones con xenoinjerto de tumor A549 establecido fueron tratados con OSU-HDAC-44 o vehículo control y se utilizaron para evaluar los efectos sobre el crecimiento del tumor, la inhibición de la citocinesis y la apoptosis. OSU-HDAC-44 era un inhibidor de pan-HDAC y exhibe 3-4 veces más eficacia que el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) en la supresión de la viabilidad celular en diversas líneas de células de NSCLC. Tras el tratamiento OSU-HDAC-44, la citocinesis se inhibió y, posteriormente, condujo a la apoptosis mediada por mitocondrias. La inhibición de la citocinesis el resultado de la degradación mediada por HDAC-44-OSU de la mitosis y citocinesis reguladores Auroroa B y survivina. La desregulación de los F-actina dinámicas inducidas por OSU-HDAC-44 se asoció con una reducción en la actividad de RhoA como resultado de la inducción srGAP1. Chip-a-chip análisis reveló que OSU-HDAC-44 induce el aflojamiento de la cromatina y la transcripción de genes implicados en las vías de señalización cruciales tales como la apoptosis, guía de axones y ubiquitinación de proteínas facilitado. Por último, OSU-HDAC-44 inhibe eficazmente el crecimiento de xenoinjertos de tumores A549 y la acetilación de histonas y inducida por proteínas no histonas y la apoptosis
in vivo
.
Conclusiones /Importancia
OSU -HDAC-44 suprime significativamente el crecimiento del tumor a través de la inducción de la citocinesis defecto y apoptosis intrínseca en modelos preclínicos de NSCLC. Nuestros datos proporcionan pruebas convincentes de que la OSU-HDAC-44 es un potente inhibidor de HDAC específica y puede ser probado para la quimioterapia NSCLC
Visto:. Tang YA, Wen WL, Chang JW, Wei TT, Tan Y-HC, Salunke S, et al. (2010) A Novel Inhibidor de histona deacetilasa Exposiciones Actividad antitumoral La apoptosis a través de la inducción, la interrupción de F-actina y Gene acetilación en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 5 (9): e12417. doi: 10.1371 /journal.pone.0012417
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 22 Febrero, 2010; Aceptado: August 2, 2010; Publicado: 14 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Tang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones NSC97-2627-M-006-005 y NSC99-2628-B-006-004-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia y otorgar DOH98-TD-G-111-024 del Departamento de Salud (la Yuan Ejecutivo, República de China). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo. La supervivencia global a los 5 años de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es inferior al 15% en muchos países [1], [2]. La estrategia terapéutica estándar para NSCLC avanzado es la quimioterapia basada en platino de doble agente que, sin embargo, ha llegado a una meseta de potencia para mejorar la supervivencia de los pacientes [3], [4]. Sólo unos pocos "agentes diana" han demostrado beneficios cuando se utiliza en combinación con doble agente basado en platino para la quimioterapia NSCLC, tales como bevacizumab, erlotinib y gefitinib, en un subgrupo de pacientes [5], [6]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos fármacos moleculares dirigidas con eficacia más general para pacientes con cáncer de pulmón es una tarea imprescindible.
Los cambios epigenéticos, así como alteraciones genéticas están asociadas con la tumorigénesis [7]. Un reciente informe identifica que los cambios epigenéticos que implican modificaciones de las histonas H2A y H3 en pacientes con CPNM influyen en la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad, siempre que el valor pronóstico de las modificaciones de las histonas [8]. También revela el fundamento para el uso de medicamentos contra la modificación de las histonas como estrategia terapéutica para el NSCLC
.
desacetilasas de histonas (HDAC) son las enzimas que catalizan la desacetilación de las histonas y epigenetically regulan la arquitectura de la cromatina y la expresión génica. Se ha demostrado que la inhibición de las HDAC invierte estado epigenético aberrante y presenta actividades antitumorales potentes mediante la inducción de la detención del ciclo celular, la diferenciación y /o apoptosis en diversas células de cáncer [9], [10]. inhibidores de HDAC se clasifican en seis grupos de acuerdo a sus estructuras químicas y al menos 12 de ellos han progresado a ensayos clínicos [9], [11]. Hasta la fecha, la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos aprueba dos inhibidores de HDAC, vorinostat (SAHA, ácido hidroxámico suberoilanilida, Zolinza®) y romidepsin (FK228, depsipéptidos, Istodax®), para el tratamiento de las manifestaciones cutáneas del linfoma cutáneo de células T (CTCL ) [12]. Sin embargo, algunos eventos adversos en los pacientes tratados con vorinostat u otros inhibidores de HDAC, lo que puede ser el resultado de las altas concentraciones de dosis utilizadas durante el tratamiento de tumores sólidos en los ensayos clínicos [11], [13].
el presente estudio, se propone una nueva clase de inhibidor de HDAC fenilbutirato basada en potentes, OSU-HDAC-44 [4- (2,2-dimetil-4-fenil-butirilamino) -
N CD - hidroxi-benzamida ], un derivado del inhibidor de HDAC conocido,
N
benzamida-hidroxi-4- (4-fenilbutirilo-amino) (HTPB) [14]. Las actividades antitumorales y mecanismos de OSU-HDAC-44 se estudiaron en células y ratones modelos de xenoinjertos NSCLC. Se encontró que la OSU-HDAC-44 fue un inhibidor pan-HDAC y exhibió 3-4 veces más eficacia en la supresión de la proliferación celular
in vitro
y el crecimiento tumoral
in vivo
comparación con SAHA o tricostatina A (TSA). Además, OSU-HDAC-44 induce la mitosis y citocinesis defecto seguido de la apoptosis mediada por mitocondrias en ambos modelos celulares y animales. Cromatina inmunoprecipitación en chip análisis reveló los genes diana de todo el genoma que fueron inducidos por hyperacetylation mediada por OSU-HDAC-44 de la cromatina. Nuestros datos sugieren que OSU-HDAC-44 era un inhibidor de HDAC y podría aplicarse como medicamento contra el cáncer dirigidos para la quimioterapia NSCLC.
Resultados
OSU-HDAC-44 inhibe la proliferación celular y muestra efectos sinérgicos con cisplatino independientemente del estado de p53
La estructura de OSU-HDAC SAHA-44 y se muestra en la Fig. 1A. análisis de acoplamiento demostró que OSU-HDAC-44 interactuaba con el dominio catalítico de HDAC 8, lo que sugiere la función directa de OSU-HDAC-44 en la orientación de HDACs (Fig. 1B).
(A) Estructura química de OSU -HDAC-44 y SAHA. (B) Análisis de acoplamiento molecular de OSU-HDAC-44 y SAHA. Las estructuras de OSU-HDAC SAHA-44 y se calcularon y el modo de atraque en el dominio catalítico de la HDAC8 se predijo usando el programa de acoplamiento GOLD 4.0.1. efectos (C) Dependiente de la dosis de OSU-HDAC-44 (
izquierda) y SAHA (
derecha) sobre la viabilidad celular en IMR90, H1299, A549 y células CL1-1. Las células se trataron con 0,5 a 10 M de OSU-HDAC-44 o SAHA durante 48 h, y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. (D) de OSU-HDAC-44 sinérgicos con cisplatino para suprimir la proliferación celular. Las células se expusieron a cisplatino (cis) solo durante 4 h, OSU-HDAC-44 (HDAC-44) por sí sola durante 48 h, o previamente con OSU-HDAC-44 para 48 h antes del tratamiento con cisplatino durante 4 h, y luego fueron drogas se retiraron y las células se incubaron con medio libre de drogas para el adicional de 48 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. CL1-1 células fueron tratadas con 4,4 M cisplatino o 0,3 M de OSU-HDAC-44. las células A549 se trataron con 1,6 M de cisplatino o 0,2 M OSU-HDAC-44. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. *
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Las actividades de inhibición del crecimiento de células de OSU-HDAC-44 se evaluaron en tres líneas celulares de cáncer humano incluyendo A549 (p53 de tipo salvaje) , H1299 (p53 null), y CL1-1 (mutante p53). SAHA se incluyó como un inhibidor de HDAC de control positivo. OSU-HDAC-44 proliferación celular inhibió significativamente en todas las líneas celulares de cáncer a pesar de sus diferencias de fondo p53, y no causa aparente citotoxicidad para las células IMR90, una línea celular de pulmón normal (Fig. 1C). OSU-HDAC-44 suprime la viabilidad celular de las células A549 y CL1-1 con submicromolar IC
50 valores (0,65 ± 0,08 y 0,67 ± 0,01 M, respectivamente) y el IC
50 valor de H1299 se extrapolaron a ser 1,14 ± 0,14 M. En particular, OSU-HDAC-44 exhibió 3-4 veces más potencia que SAHA en la capacidad anticancerígena (CI
50: A549, 1,90 ± 0,16; CL1-1, 2,85 ± 0,27; H1299, 4,87 ± 0,98 M). Además, la Fig. 1D mostró que OSU-HDAC-44 actuó en sinergia con cisplatino para mejorar la muerte celular en células A549 y CL1-1, que eran tanto las células resistentes al cisplatino.
OSU-HDAC-44 induce la inhibición de la apoptosis y la citocinesis
Para investigar el mecanismo subyacente de la represión del crecimiento celular por OSU-HDAC-44, los efectos de OSU-HDAC-44 sobre la progresión del ciclo celular se evaluaron por citometría de flujo. El tratamiento con 2,5 M OSU-HDAC-44 para 24 horas causó células A549 y H1299 a acumularse en la fase G2 /M (4N células), y posteriormente se llevó a apoptosis (células sub-G1) en tratamiento de 48 horas, mientras que la exposición a una mayor concentración (5 M) de SAHA durante 48 horas tuvo un efecto similar (Fig. 2A), lo que indica que OSU-HDAC-44 ejerce un efecto de la desregulación del ciclo celular más potente que hizo SAHA. Para examinar las consecuencias celulares de la acumulación de células 4N OSU-HDAC-44 mediada, se realizaron análisis microscópicos con lapso de tiempo. Como se muestra en la Fig. S1A, OSU-HDAC-44 provocó la aparición de la estructura de escisión surco defectuoso y las dos células hijas se fusionaron de nuevo juntos, mientras que las células no tratadas pasan normalmente a través de la división celular. Concordantemente, alrededor de 20% de las células tratadas con OSU-HDAC-44 se acumularon como células bi-nucleado, en comparación con menos del 5% de las células control (Fig. 2B y Fig. S1B). OSU-HDAC-44 también causó la formación de micronúcleos e interrumpió la estructura normal de F-actina de las células A549 y H1299 (Fig. 2B). Por lo tanto, estos resultados sugieren que OSU-HDAC-44 puede causar la citocinesis aberrante y posteriormente llevado a la apoptosis en células de cáncer de pulmón.
(A) Los efectos de OSU-HDAC-44 sobre la distribución del ciclo celular en A549 y H1299 Células. Las células se trataron con 2,5 mM OSU-HDAC-44 o 5 M SAHA durante los tiempos indicados y se evaluaron por citometría de flujo.
Izquierda
, se muestran los resultados de un experimento representativo.
Derecho
, el porcentaje medio de G2 M y la fracción de la población sub-G1 /se representa en el histograma. (B) Las células-bi nucleadas y desregulación de la F-actina inducida por OSU-HSAC-44. Las células se trataron con 2,5 mM OSU-HDAC-44 durante 48 h, y después se fijaron y se tiñeron con DAPI (ADN) y faloidina (F-actina). Asterisco señaló la bi-núcleo. Barras de escala: 30 m. (C) OSU-HDAC-44 inducida por la degradación de la Aurora B y survivina a través de vía del proteasoma 26S.
Alta
, disminuye en función del tiempo en Aurora B y los niveles de proteína survivina después de 2,5 M de OSU-HDAC-44 de tratamiento.
medio, las células A549 se trataron con 2,5 mM OSU-HDAC-44 en presencia o ausencia de MG132 durante 24 h.
Baja
, las células A549 fueron tratados con 2,5 M de OSU-HDAC-44 durante 24 h, y lisado celular se sometió a ensayo de IP utilizando anti-Aurora B o anti-survivin anticuerpos específicos y se transfirieron con anticuerpo anti-ubiquitinación ( anti-UB). ensayo (D) Actividad de la caspasa (
izquierda) Opiniones y análisis de Western blot (
Derecha)
confirmó que OSU-HDAC-44 induce la apoptosis vía intrínseca. Las células se trataron con 2,5 mM OSU-HDAC-44 durante los tiempos indicados y la sometieron a ensayo de actividad de caspasa y análisis de transferencia Western. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. *
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Para identificar el mecanismo molecular implicado en la inhibición inducida por la citocinesis OSU-HDAC-44, se examinaron las proteínas reguladoras del ciclo celular. La oscilación de inhibidor mitótico Weel y marcadores mitótico fosforilados histona H3 y la expresión de ciclina B indicó que las células tratadas con OSU-HDAC-44 estaban en fase M después de un tratamiento de 12 horas y posteriormente salió M fase (Fig. S1C), acompañado de citocinesis defecto. Por otra parte, OSU-HDAC-44 provocó un descenso en los niveles de proteína de Aurora B y survivina (Figura 2C;. Superior), que son esenciales para la progresión de la mitosis y la citocinesis [15], [16]. En particular, OSU-HDAC-44 ubiquitinación inducida de Aurora B y survivina, y co-tratamiento con el inhibidor de proteasoma MG132 impidió la degradación inducida por HDAC-44-OSU de Aurora B y survivina (Figura 2C;. Media y baja). A continuación, se utilizó nocodazole para sincronizar las células en metafase previamente y confirmar además que OSU-HDAC-44 hecho provocó la degradación anormal de Aurora B y survivina en la fase mitótica. Como se muestra en la Fig. S1D y E, el tratamiento con nocodazol durante 24 horas causadas acumulación en Aurora B y las proteínas de survivina, mientras que la combinación de OSU-HDAC-44 y nocodazol dio como resultado disminuciones en la Aurora B y los niveles de proteína survivina a 24 horas post-tratamiento. Estos resultados sugieren que el fracaso mediada por OSU-HDAC-44 de la citocinesis puede deberse en parte a la regulación a la baja de Aurora B y proteínas a través de survivina vía del proteasoma 26S.
OSU-HDAC-44 activa la vía intrínseca de apoptosis
para aclarar aún más la apoptosis inducida por HDAC-44-OSU, se realizó la fosfatidilserina (PS) tinción analiza para detectar temprano el proceso de apoptosis. Como se muestra en la Fig. S2, el tratamiento OSU-HDAC-44 durante 24 horas aumentó la intensidad de la tinción PS en contraste con baja intensidad de la tinción en el tratamiento DMSO en A549 y células H1299. Además, el tratamiento OSU-HDAC-44 estimuló significativamente la actividad de caspasa-3 y caspasa-9 (un indicador de la vía mitocondrial intrínseca) después de 24 horas de tratamiento mientras que la actividad de la caspasa-8 (un indicador de la vía del receptor de membrana extrínseca) se mantuvo afectada en las células A549 y H1299 (Fig. 2D, izquierda). Por otra parte, el tratamiento con 2,5 M de OSU-HDAC-44 durante 12 horas provocó una disminución de la proteína anti-apoptótica Bcl-x
L, mientras que aumentó la proteína pro-apoptótica, Bad, dentro de 6-12 horas de tratamiento en el A549 y H1299 células (Fig. 2D, derecha). La liberación de citocromo c en el citosol acompañado por la escisión de pro-caspasa-9 también se observó después del tratamiento OSU-HDAC-44 durante 24-48 horas. Estos resultados confirmaron además que OSU-HDAC-44 podría inducir la vía apoptótica intrínseca en células de cáncer de pulmón.
OSU-HDAC-44 induce la acetilación de la proteína con su capacidad de dirigirse a numerosos HDACs
Los biomarcadores de la inhibición de HDAC son acetilación de histonas y proteínas no histonas, y p21 inducción
Cip1 expresión de una manera independiente de p53 [17], [18]. La exposición a OSU-HDAC-44 acetilación inducida de la histona H3, H4 histonas y p53 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3A) y de manera dependiente del tiempo (Fig. 3B), mientras que no afecta a los niveles de proteína HDAC1 y HDAC6 (Fig. 3B y Fig. S3). En particular, estos efectos fueron mayores en comparación con la de SAHA. A pesar del estado de p53, OSU-HDAC-44 induce la expresión de p21
ARNm Cip1 y proteína en las células A549 y H1299 (Fig. S4). Para examinar la especificidad de la diana de OSU-HDAC-44 en la clase I, II, y IV HDAC,
in vitro
se realizó ensayo de inhibición de la HDAC. Como se muestra en la Fig. 3C, las actividades de la deacetilasa de diferentes isotipos de HDAC incluyendo los de clase I (HDAC1 y HDAC8), clase II (HDAC4 y HDAC6) y clase IV (HDAC11) se inhibió significativamente por OSU-HDAC-44. Estos efectos fueron mayores en comparación con la de SAHA, un conocido inhibidor de pan-HDAC. Estos resultados sugieren que OSU-HDAC-44 induce la acetilación de proteína ejerciendo amplia actividad inhibidora de numerosos HDACs.
dependiente de la dosis de efectos (A) y los efectos dependientes del tiempo (B) de OSU-HDAC-44 en el histonas y proteínas no histonas. Ac-H3, acetilada de la histona H3; Ac-H4, histona H4 acetilado; Ac-p53, p53 acetilado; p53, p53 total. (C) OSU-HDAC-44 actividades de clase I (HDAC1 y HDAC8), clase II HDAC clase IV (HDAC11) (HDAC4 y HDAC6), y suprimió. Diferentes isotipos de HDAC se inmunoprecipitaron a partir de extracto nuclear H1299 por anticuerpos específicos, y después se somete a
in vitro
ensayo de inhibición de HDAC en el que se describe en la sección Materiales y Métodos. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. **
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OSU-HDAC-44 aumenta la expresión de genes aflojando la estructura de la cromatina
Para determinar los efectos directos de OSU- lisinas HDAC-44 en la estructura de la cromatina y la expresión génica, la cromatina immunoprecipitation (cHIP) -on-chip se realizó un análisis utilizando el anticuerpo contra la marca de la cromatina suelta, acetilado 9 y 14 de la histona H3 (H3K9K14Ac), después de 2,5 M OSU- tratamiento HDAC-44 durante 2 horas en A549 y células H1299. La inducción de la acetilación de histonas en 33 loci de genes común de A549 y H1299 se identificaron después de OSU-HDAC-44 de tratamiento (Tabla S1). Varios de estos 33 genes habían sido demostrado que desempeñan papeles importantes en ciertas vías de señalización, tales como apoptosis, la respuesta al estrés oxidativo, guía de axones y las vías de ubiquitinación de proteínas (Tabla 1). Para confirmar los datos de microarrays, se validó la estructura de la cromatina de algunos de los loci de genes incluyendo
srGAP1
,
NR4A1
y
foxo4 fotos: por chip-PCR utilizando el anticuerpo contra H3K9K14Ac. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento con 2,5 M de OSU-HDAC-44 durante 2 horas aumentó la cantidad de
srGAP1
,
NR4A1
y
foxo4
promotor de ADN con la estructura de la cromatina floja en comparación con los no tratados Células. Concordantemente, los niveles de mRNA de
srGAP1
,
NR4A1
y
foxo4
se incrementó después de OSU-HDAC-44 el tratamiento durante 24 horas (Fig. 4B).
(a) de la cromatina-immunoprecipitation-PCR análisis confirmó que el tratamiento con 2,5 M OSU-HDAC-44 para 2 h inducen la acetilación de la histona H3 (H3K9K14Ac) en la región promotora de
srGAP1
,
NR4A1
y
foxo4
genes. (B) de OSU-HDAC-44 aumentó los niveles de mRNA de
srGAP1
,
NR4A1
y
foxo4
genes utilizando análisis en tiempo real de RT-PCR. Las células se trataron con 2,5 mM OSU-HDAC-44 durante 24 h y el ARN total se extrajo para el análisis en tiempo real RT-PCR. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05. ensayo (C) La inmunoprecipitación indica que el aumento de la interacción entre srGAP1 y RhoA fue inducida por OSU-HDAC-44. las células A549 se trataron o no tratada con 2,5 M OSU-HDAC-44 durante 24 h y se sometieron a análisis Western-IP. (D) si-srGAP1 abrogó la disminución inducida por HDAC-44-OSU en la actividad de RhoA (
superior) y rescató a la estructura normal de F-actina después del tratamiento OSU-HDAC-44 (
menor
). células A549 transfectadas con siRNA srGAP1 fueron tratados con 2,5 M OSU-HDAC-44 durante 24 h y se sometieron a ensayo de activación de RhoA y análisis de inmunofluorescencia. Las barras de escala: 30 micras.
OSU-HDAC-44 regula a la baja la dinámica de actina F través de la inducción srGAP1
OSU-HDAC-44 inducida por el tratamiento agregación de F-actina (Fig. 2B). estudio anterior ha indicado que srGAP1 se une a las formas activas de RhoA y Cdc42 e inhibe sus actividades en la regulación de la polimerización de actina en las células neuronales [19]. Sin embargo, la función biológica de srGAP1 unión a RhoA sigue siendo poco clara en otras células. El uso de la inmunoprecipitación (IP) Western, mostramos que OSU-HDAC-44 aumentó la interacción entre srGAP1 y RhoA en células de cáncer de pulmón A549 (Fig. 4C). Curiosamente, desmontables de srGAP1 no sólo abolió la disminución mediada por HDAC-44-OSU en el nivel de RhoA-GTP (Fig. 4D, superior), pero también restauró la dinámica de la F-actina después de OSU-HDAC-44 tratamiento (Fig. 4D , bajar). Estos resultados indican que 44 OSU-HDAC-abajo reguladas actividad de RhoA en parte a través de la inducción srGAP1, lo que lleva a la destrucción de las fibras F-actina normales.
OSU-HDAC-44 inhibe el crecimiento de xenoinjerto de tumor de pulmón
in vivo
a fin de evaluar la actividad antitumoral de c null ratones que llevan xenoinjerto de tumor de pulmón A549 OSU-HDAC-44, bulbo /fueron inyectados por vía intraperitoneal con 7,5-30 mg /kg de OSU-HDAC-44, 3 días /semana durante tres semanas. TSA de 0,5 mg /kg, que se ha demostrado que presentan efectos de crecimiento anti-tumorales en xenoinjertos de mama y células de cáncer de vejiga [20], [21], se utilizó como fármaco de control positivo. Como se muestra en la Fig. 5A, el tratamiento con 7,5, 15 y 30 mg OSU-HDAC-44 crecimiento /kg inhibió significativamente el tumor en un 62%, 78% y 90%, respectivamente, en el día 33 post-tratamiento en comparación con el control del vehículo. El tratamiento con OSU-HDAC-44 no afectó adversamente el peso corporal y no causó toxicidad detectable como se examinó por hematoxilina y eosina de los órganos principales (Fig. 6A, B). exámenes bioquímicos hematológicos estaban en los rangos normales para OSU-HDAC-44 animales tratados (Fig. 6C).
(A) Los ratones con los tumores A549 establecidos fueron inyectados (~ 50 mm
3) por vía intraperitoneal 7.5, 15 o 30 mg /kg de OSU-HDAC-44 o 1,5 mg /kg de TSA 3 días /semana durante tres semanas. Ocho ratones por grupo se utilizaron en el experimento de xenoinjerto. Se midieron los volúmenes de los tumores de los ratones. Puntos, significan; barras de error, los intervalos de confianza del 95%.
P
valores fueron para las comparaciones con el control del vehículo (*
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P
& lt; 0,001). (B-D) ratones portadores establecieron (alrededor de 100~200 mm
3) tumores A549 fueron inyectados por vía intraperitoneal con una dosis única de OSU-HDAC-44 a 60 mg /kg. Después del tratamiento durante el tiempo indicado, los tumores se cosecharon y se sometieron a transferencia de Western o inmunohistoquímica análisis. (B) Los tumores de dos ratones representativos de cada punto de tiempo (a-f) se recogieron y se sometió a análisis de Western blot usando los anticuerpos indicados. (C) los análisis de inmunohistoquímica se realizaron utilizando anticuerpos contra-forma escindida de la caspasa 3 (color marrón). Aumento original x 200. análisis (D) la fluorescencia de inmunohistoquímica se realizaron con anticuerpos contra Aurora B y DAPI (ADN). Las imágenes (D-f y j-l, bares escala: 10 micras) se magnificaron desde enmarcadas queridos (a-c y g-I, barras de escala: 30 micras).
(A) OSU-HDAC-44 tratamientos no causan pérdida de peso corporal significativa de los animales del grupo. (B) H & amp; E tinción de embebido en parafina, 5 m de espesor secciones del corazón, hígado, pulmón y riñón de ratones tratados con OSU-HDAC-44 y no tratados con xenoinjertos A549. Aparentemente no hubo diferencias histopatológicas entre estas secciones de tejidos (aumento original × 200). (C) pruebas de bioquímica hematológicas como GOT, GPT, albúmina, urea, creatinina, y WBC fueron examinados y los resultados no mostraron diferencias significativas entre DMSO y OSU-HDAC-44 de tratamiento.
OSU-HDAC -44 induce la inhibición de la acetilación de proteínas, la apoptosis y la citocinesis
in vivo
Para confirmar que OSU-HDAC-44 suprimió el crecimiento de xenoinjertos de tumores a través de la orientación de las HDAC e induciendo la apoptosis
in vivo
, los ratones portadores de tumores A549 establecidos fueron tratados con una dosis única de OSU-HDAC-44. Después del tratamiento durante el tiempo indicado, los tumores se diseccionaron y se sometieron a transferencia de Western, inmunohistoquímica o un análisis de inmunohistoquímica de fluorescencia (Fig. 5B-D). La acetilación de la histona H3, H4 histonas y p53 se incrementaron profundamente después del tratamiento 2 horas. Los niveles de proteína de Bcl-x
L y survivin empezaron a disminuir después del tratamiento 2 horas, mientras que el nivel de proteína Bad se aumentó después de 4 horas de tratamiento (Fig. 5B). También se detectó Activado caspasa-3, tanto en el citosol y en el núcleo después del tratamiento de 8 horas y se mejoró aún más después del tratamiento de 24 horas (Fig. 5C). Por otra parte, OSU-HDAC-44 disminuyó los niveles de Aurora B e interrumpió su asociación con el cromosoma en metafase en comparación con las células control DMSO (Fig. 5D). Estos resultados demostraron que la OSU-HDAC-44 podría inducir la apoptosis y regular a la baja de la mitosis y citocinesis reguladores, Aurora B y survivina,
in vivo
. Además, el aumento de los biomarcadores de inhibición de HDAC, tales como la acetilación de la histona H3, H4 histonas y p53 fue evidente en los tumores de los ratones tratados.
Discusión
Desde las HDAC son blancos prometedores para la terapia del cáncer, una número de inhibidores de HDAC están en ensayos clínicos como terapia única y /o en combinación con otros medicamentos contra el cáncer [9]. Sin embargo, los inhibidores de HDAC eficaces para el tratamiento de tumores sólidos aún no se han desarrollado. En este estudio, nos proporcionan pruebas convincentes procedentes de estudios celulares y animales que OSU-HDAC-44, un compuesto basado en fenilbutirato, es un inhibidor de HDAC potencial para el tratamiento del NSCLC. OSU-HDAC-44 dirigido numerosos miembros dentro de tres clases de HDAC
in vitro
y estimulado de manera eficiente la acetilación de proteínas en modelos celulares y animales (Fig. 3 y 5). OSU-HDAC-44 reprime la viabilidad celular y la apoptosis inducida en diversas líneas de células de NSCLC con 3-4 veces mayor potencia que SAHA (Fig. 1C y 2A). Además, la concentración submicromolar de OSU-HDAC-44 exhibió efectos prominente sinérgicos en combinación con cisplatino en la supresión de la proliferación de líneas celulares de NSCLC (Fig. 1D). Los experimentos de xenoinjertos confirmaron además que OSU-HDAC-44 induce la apoptosis celular y el crecimiento tumoral de ese modo inhibe
in vivo gratis (Fig. 5) y sin el peso corporal afectada negativamente, los órganos principales y los parámetros hematológicos (Fig. 6). En conjunto, estos resultados sugieren que OSU-HDAC-44 es un inhibidor de HDAC candidato prometedor para el tratamiento de NSCLC.
Se ha demostrado que varias quinasas y proteínas reguladoras, tales como Aurora B, suvivin así como GTPasa RhoA pequeña son necesarios para completar la citocinesis [22]. La inhibición de Aurora B o el agotamiento de survivina puede evitar que los finales de los pasos de la citocinesis, lo que lleva a la formación de células multi-nucleado [15], [16]. En el presente estudio, hemos presentado pruebas de que OSU-HDAC-44 proteólisis inducida de Aurora B y survivin tanto
in vitro
y
in vivo gratis (Fig. 2C y Fig. 5B, D) , que se asoció con la inhibición de la citocinesis mediada por OSU-HDAC-44, lo que resulta en la acumulación de células nucleadas bi-(Fig. 2B y Fig. S1 a-B). Además, la combinación de un inductor nocodazole pre-metafase y OSU-HDAC-44 dio como resultado la disminución de Aurora B y de la proteína survivin niveles sobre 24 h post-tratamiento (Fig. S1E). Estos datos sugirieron que citocinesis defecto mediada por OSU-HDAC-44 fue debido a la degradación anormal de Aurora B y survivina en la fase mitótica. Se ha informado de que la sobreexpresión de Aurora B se correlaciona con la expresión de survivina en el núcleo, invasión ganglionar, y de mal pronóstico en pacientes con CPNM [23]. Por lo tanto, la eficacia clínica de OSU-HDAC-44 en relación con reguladas por Aurora B y surivin en el tratamiento de pacientes con CPNM es digno de mayor investigación.
En este estudio, se realizó un chip-on-chip análisis para investigar los genes diana en todo el genoma inducidos por hyperacetylation mediada por OSU-HDAC-44 de la cromatina después de 2 horas de exposición, y se encontró que la acetilación de histonas se estimularon en 33 genes comunes en las líneas celulares examinadas, incluyendo los genes supresores de ocho tumorales (ETG ) o TSG-como genes (Tabla S1). Varios genes juegan un papel esencial en la apoptosis, la respuesta al estrés oxidativo, guiado de los axones y las vías de ubiquitinación de proteínas (Tabla 1). La
srGAP1
gen, que codifica una proteína GTPasa activación conocido para regular la guía de axones [19], se confirmó que en la estructura de cromatina abierta y el aumento en el nivel de expresión (Fig. 4A, B). Curiosamente, se encontró que OSU-HDAC-44 redujo la actividad de una pequeña GTPasa RhoA través de la inducción de srGAP1 y contribuyó a la desregulación de la dinámica de la actina F (Fig. 4C, D). Estos resultados indicaron que OSU-HDAC-44 puede interrumpir la mitosis y citocinesis que resulta de la alteración de varias vías adicionales, tales como srGAP1 de control /RhoA /F-actina. Por otra parte, dos genes relacionados con la apoptosis,
NR4A1 /Nur77
y
foxo4
, fueron validados a partir de los datos de Chip-a-chip y sus expresiones de ARNm fueron de hecho aumentó en OSU-HDAC-44 ( la Fig. 4A, B). NR4A1 /Nur77 y foxo4 se ha demostrado para activar la apoptosis intrínseca a través de la inducción de la liberación de citocromo c mitocondrial y la baja regulación de Bcl-x
L expresión, respectivamente [24] - [26]. Tal apoptosis mediada por Nur77 NR4A1 /ha demostrado ser inducida por un inhibidor de HDAC, LBH589, en LTC células [27]. Nuestros resultados de modelos celulares y animales muestran que la muerte celular inducida por OSU-HDAC-44 era posiblemente a través de la vía apoptótica intrínseca (Fig. 2D y 5B). Por lo tanto, la transcripción regulación de
NR4A1 /Nur77
y
foxo4
puede contribuir a OSU-HDAC-44 mediada por apoptosis intrínseca.
Al igual que en nuestro hallazgo de selectiva el cambio de la cromatina de una fracción de loci de genes en el chip-on-chip, estudios recientes utilizando microarrays de ADNc indican que varios inhibidores de HDAC tales como TSA, SAHA, MS-275 y depsipéptido alteran sólo 7-20% expresiones de genes en varias líneas celulares de cáncer [ ,,,0],28] - [30]. reclutamiento específico de complejos correpresores que contienen HDACs por factores de transcripción y /o reguladores de la transcripción se cree que juega un papel esencial en la represión transcripcional [31] - [33], sin embargo, la acción selectiva de los inhibidores de HDAC en genes específicos sigue siendo poco clara. Por lo tanto, vale la pena investigar si puede haber complejos comunes y críticos de transcripción-regulación que contienen HDAC que determinan los niveles de acetilación de la cromatina de estos genes a partir de datos validados chip-on-chip.
En conclusión, nuestros hallazgos muestra que OSU-HDAC-44 es un nuevo inhibidor de pan-HDAC que exhibe un amplio espectro de actividades antitumorales en modelos celulares y xenoinjertos de NSCLC, que implica la activación no sólo acetilación de histonas dependiente de la transcripción de genes, sino también la activación de las vías de apoptosis intrínsecos y postraduccional baja regulación de los reguladores de la mitosis, Aurora B y survivina. Además, el control de la motilidad RhoA /F-actina fue inhibida por srGAP1 y varias proteínas de inducción de apoptosis fueron activadas por OSU-HDAC-44 (Fig. 7). En conjunto, nuestros datos proporcionan evidencia convincente de que la OSU-HDAC-44 es un inhibidor de HDAC específica y tiene el potencial para ser probado para el tratamiento de NSCLC y la quimioterapia de combinación.
OSU-HDAC-44 es un nuevo inhibidor de pan-HDAC que exhibe un amplio espectro de actividades antitumorales en células NSCLC y modelos de xenoinjerto, que implica la activación de acetilación de histonas dependiente de la transcripción de genes en el núcleo. Por ejemplo, re-expresión de NR4A1 y foxo4 junto con la activación de caspasa induce apoptosis intrínseca.