Extracto
inhibición de la angiogénesis es una estrategia terapéutica importante para el cáncer de próstata en etapa avanzada. El trabajo previo de nuestro laboratorio mostraron que la estimulación sostenida de Rap1 en un 8-PCPT-2'-O-Me-cAMP (8CPT) a través de la activación de EPAC, un Rap1 GEF, o mediante la expresión de un mutante constitutivamente activa Rap1 (cRap1) suprime endotelial quimiotaxis de células y la posterior angiogénesis. Cuando probamos este modelo en el contexto de un xenoinjerto de tumor de próstata, se encontró que 8CPT no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento del tumor de próstata solo. Sin embargo, en células que albergan cRap1, 8CPT inhibió dramáticamente no sólo el crecimiento del tumor de próstata, pero también VEGF expresión y la angiogénesis dentro del microambiente del tumor. El análisis posterior del mecanismo reveló que, en las células epiteliales tumorales de próstata, 8CPT actuaba a través de la estimulación de la PKA en lugar de Epac /Rap1. PKA antagoniza Rap1 y la inducción hipóxica de la expresión de proteínas 1α, la producción de VEGF y, en última instancia, la angiogénesis. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de una novela interacción entre Rap1, EPAC, y PKA que regula la inducción de tumor del estroma de la angiogénesis
Visto:. Menon J, Doebele RC, Gomes S, E Bevilacqua, Reindl KM, Rosner MR (2012) a Novel Interacción entre Rap1 y PKA Regula La inducción de la angiogénesis en el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (11): e49893. doi: 10.1371 /journal.pone.0049893
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Septiembre, 2012; Aceptado: 15 Octubre 2012; Publicado: 15 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Menon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por PC094476 - Departamento de Defensa (DOD) Programa de Investigación de cáncer de próstata (PCRP) Beca de Doctorado (JM) y los Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional del cáncer-R01 CA109278 (MRR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos [1]. La elevada morbilidad y mortalidad asociada con el inicio de la hormona-refractario, cáncer de próstata metastásico mandatos la necesidad de que los regímenes de tratamiento innovadoras para mejorar el pronóstico de esta enfermedad. Varias estrategias se han utilizado para orientar la angiogénesis en el cáncer de próstata, incluyendo el bloqueo de factores pro-angiogénicos como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a través de anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña de orientación vías efectoras de señalización corriente abajo como la vía del receptor VEGF de tirosina quinasa [2], [ ,,,0],3], [4]. Sin embargo, el principal inconveniente de este enfoque es el importante número de factores pro-angiogénicos, además de VEGF, que pueden inducir la angiogénesis y de este modo evadir estos agentes. Una alternativa a la inhibición de uno o más de los factores pro-angiogénicos es identificar moléculas de señalización que funcionan para regular la angiogénesis [5].
Varios estudios han implicado a Rap1 como un mediador de la angiogénesis [5], [6] , [7], [8], [9], [10], [11]. angiogénesis defectuosa y la hematopoyesis se observaron en ratones que carecen Rap1A o Rap1b, y un mecanismo que implica integrinas y receptores de VEGF en las células endoteliales se informó recientemente [12], [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Por lo tanto, la pérdida de Rap1 inhibe la angiogénesis durante el desarrollo, en consonancia con el papel que juega Rap1 en la señalización celular, la adhesión celular mediada por integrina y uniones célula-célula, funciones que son importantes para la formación de la estructura tubular. El derivado 8CPT-2Me-cAMP cAMP (8CPT) es un potente agonista de Epac, un factor de intercambio de nucleótidos de guanina para Rap1, y un agonista débil de PKA [18], [19]. El trabajo previo de nuestro laboratorio mostraron que, en las células endoteliales microvasculares primarios humanos, la estimulación prolongada de Rap1, ya sea por la activación EPAC después del tratamiento 8CPT o por expresión de constitutivamente activado Rap1 A63E (cRap1) inhibe la quimiotaxis y la angiogénesis [8], [9]. Por lo tanto, la angiogénesis también puede ser inhibida en las células endoteliales, cuando Rap1 está sujeta a la estimulación prolongada por las drogas o mutación. En conjunto, estos estudios sugieren que el grado de activación Rap1 es crítica para el proceso angiogénico.
PKA también se ha relacionado con la angiogénesis tanto como un regulador positivo y negativo [20], [21], [22], [ ,,,0],23], [24], [25], [26]. Aumento de la actividad de PKA promueve la formación de tubo endotelial, promoviendo así la angiogénesis [27]. Por el contrario, la activación de PKA provoca la fosforilación del represor transcripcional Id1 [28] e interrumpe su shuttling núcleo-citoplasma, lo que inhibe la angiogénesis [29]. Además, ya sea sobre-expresión de la subunidad catalítica de PKA o activación farmacológica de PKA induce la muerte de las células endoteliales por apoptosis, la supresión de la angiogénesis [22], [23]. En total, estos resultados indican que los resultados de la angiogénesis de un equilibrio de factores pro-angiogénicos y anti-incluyendo Rap1 y PKA, y ninguno de los extremos tendrá efectos deletéreos.
El objetivo de este estudio fue determinar si Rap1 regula la angiogénesis en tumores de próstata. Nuestros resultados sugieren que la activación Rap1 constitutiva en las células tumorales de próstata humano promueve la inducción hipóxica de VEGF y la angiogénesis, y PKA antagoniza este efecto. Además, nuestros estudios sugieren que el tratamiento 8CPT puede inhibir la angiogénesis a través de dos mecanismos diferentes que implican la activación de PKA en células de tumor de próstata, como se muestra aquí, y la activación Epac /Rap1 en las células endoteliales [8].
(A y B)
Panel izquierdo
: El volumen tumoral (expresado en mm
3) del humanas PC3 y PC3-xenoinjertos tratados como se indica cRap1 se midió como se describe en Métodos. Día 0 representa el primer día de tratamiento; * P
& lt;
0,05, n = 7 para cada grupo.
Panel derecho
: Las imágenes de un tumor representante de cada grupo de tratamiento al final del experimento (día 28). (C) El volumen del tumor (expresado en mm
3) de PC3 humana y xenoinjertos PC3-cRap1 al tratamiento indicado se midió como en A; * P
& lt;
0,05, n = 7 para cada grupo. (D) Tumores de panel C se pesaron al final del experimento (día 28) y se expresa en gramos; * P & lt; 0,05; (
n
= 7).
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de próstata, tratamientos, anticuerpos, plásmidos, y Reactivos
EPAC activador de 8- (4-clorofeniltio) -2-O-metil-cAMP (8CPT) y PKA activador N6-Benzoyladenosine- 3 ', 5'-monofosfato cíclico (6-Bz-cAMP) fueron adquiridos de BIOLOG vida Instituto de Ciencias (Bremen , Alemania). células LNCaP y células PC3, se obtuvieron de American Tissue Culture Collection (Manassas, Virginia), mantenida a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en Mediatech RPMI suero bovino fetal 1640 con 10%, 50 mg /ml de penicilina y 50 U /ml de estreptomicina. Todos los medios y reactivos de crecimiento fueron adquiridos de Gibco BRL (Grand Island, NY). Las células se incubaron durante 24 h con medio libre de suero antes de cada tratamiento. Las células se trataron durante la noche con 10 mM 8CPT o 10 mM 6BZ-cAMP disuelto en PBS o PBS solo como un medio de control. Las células se trataron adicionalmente durante 6 h (a menos que se indique lo contrario) con 10 mM CoCl
2 para imitar las condiciones de hipoxia o con SDF-1α a 200 ng /ml durante 20 min. Las células se trataron previamente con el PKA inhibidores de H-89 (10 M) durante 30 minutos antes de CoCl
2 de tratamiento. Los anticuerpos a EPAC y tubulina se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ratón CD31 anti-humano y conejo VEGF anti-humano se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA). SDF-1α se obtuvo de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN) y H-89 se adquirió de Sigma-Aldrich (St Louis, MO), miristoilada PKI fue de Invitrogen (Grand Island, NY), y los anticuerpos a VASP o phosphoVASP eran de Señalización celular (Boston, MA).
(a y B) y CD31 inmunoreactividad VEGF en tumores PC3 y PC3-cRap1. La inmunotinción se midió como se describe en Métodos.
Paneles Derecho
: fotomicrografías representativas.
paneles de la izquierda
: La cuantificación de la tinción inmunohistoquímica de las rebanadas de tumores; * P & lt; 0,05; n = 7; a.u. = unidades arbitrarias. (C) El volumen tumoral (expresado en mm
3) de xenoinjertos PC3-cRap1 humanos. Se inyectaron células PC3-cRap1 como xenoinjertos en el día 0 y se dejan crecer durante 10 días antes de una minibomba osmótica que contiene los tratamientos se implantó para la infusión constante (Día 10, la bomba). Los tumores tratados como se indica se midieron como se describe en Métodos; * P & lt; 0,05; n = 8 para cada grupo. (D) El peso del tumor de xenoinjertos PC3-cRap1 humanos. Los tumores de panel C se pesaron al final del experimento (día 38) y expresada en gramos; * P & lt; 0,05; (
n
= 8).
Ética Declaración
Todos los procedimientos con ratones apegaron a las políticas de la Universidad de Chicago Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC ) y fueron aprobados por el IACUC bajo el protocolo#1196. Los animales fueron alojados en el Vivarium en el Centro de Gordon Integral de la Ciencia en la Universidad de Chicago en habitaciones dedicadas con jaulas ventiladas con aire filtrado HEPA (12 horas de luz /oscuridad ciclo). Los ratones tienen pleno acceso a agua y alimento. Los ratones fueron controlados diariamente por el personal de investigación. Se evaluó la capacidad de acceso a los alimentos y el agua, la movilidad de las extremidades posteriores, la respiración normal, la deambulación normal y el comportamiento social. Si un animal parecía estar enfermo que se controló durante 24 horas y luego anestesiados con isoflurano y se sacrificaron por el agente gaseoso seguido por dislocación cervical. Los animales también fueron sacrificados por recomendación del veterinario o personal clínico. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con ketamina /xilazina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata humano
ratones atímicos macho (15-20 g, 4-6 semanas de la edad, del Instituto Nacional del cáncer, Frederick, MD) se inocularon por vía subcutánea en la parte baja del flanco izquierdo con 1 × 10
6 PC3 (PC3-GFP) o PC3-cRap1 (células de cáncer de próstata PC3-cRap1A63E-GFP) suspendidas en 200 l de PBS. Los ratones fueron aleatorizados para el tratamiento con PBS o 2,5 mol 8CPT, o 2,5 mol H-89. Para este propósito, los ratones fueron anestesiados como se describió anteriormente y minibombas osmóticas (Alzet modelo 2004, Durect Corp, Cupertino, CA) se insertaron subcutáneamente para infundir o bien PBS, 8CPT o H-89 durante 28 días. Al final del tratamiento los animales fueron sacrificados, los tumores se retiraron, se ponderan y se procesaron para inmunohistoquímica. El volumen del tumor se midió utilizando la fórmula -1/2 l × × w
2 cada dos días, donde L = longitud y la anchura w =.
(A) los niveles de VEGF se midieron por ELISA en PC3 y células PC3-cRap1 bajo condiciones de hipoxia-como (CoCl
2) como se describe en Métodos; * P & lt; 0,05, (n = 3). (B) Análisis de inmunotransferencia de extractos nucleares de células PC3 y PC3-cRap1 tratados como se indica. los niveles de proteína HIF-1a se determinaron por inmunotransferencia con anticuerpo específico; (C) Análisis de los niveles de ARNm de VEGF por qPCR en PC3 y células PC3-cRap1 tratado como se indica. Los datos se normalizaron a los niveles de GAPDH; * P & lt; 0,05 (
n
= 3) guía empresas
La inmunohistoquímica
tumores de ratón se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 24 horas y se incubaron en un 70% de etanol para. 48 h antes de la incrustación de parafina. Los tumores embebidos se cortaron en cinco secciones gruesas micras y se tiñeron con hematoxilina y eosina para determinar la morfología. Secciones de tumores infundidos con 8CPT, H-89 o PBS se inmunotiñeron para VEGF, CD31 o Ki67 utilizando el método de estreptavidina-biotina marcada para medir la angiogénesis o la proliferación celular. Las secciones teñidas se visualizaron y se fotografiaron con un sistema de análisis de imagen de vídeo (Scion, Inc., Frederick, MD). Un sistema de imágenes de células automatizado se utilizó para cuantificar VEGF tinción inmunohistoquímica. La densidad capilar se calculó contando vasos inmunoteñidas con CD31 +. Al menos 6 campos al azar fueron contados en una sección representativa. Los valores se representan como medios más o menos SEM.
VEGF ELISA
Las células (5 × 10
4) en placas de 24 pocillos. Cuando las células fueron 70 a 80% de confluencia, fueron tratados como se describe anteriormente. Se recogió medio de los pocillos y los niveles de VEGF fueron determinadas según las instrucciones del fabricante para kits ELISA VEGF humano Desarrollo (Peprotech, Rocky Hill, NJ).
El aislamiento de ARN y la transcripción reversa /del tiempo real de reacción en cadena de polimerasa
se aisló el ARN de las células usando QIAshredder y RNeasy
R Minikit de Qiagen Biosciences y se sometió a RT-PCR usando cDNA de alta capacidad kit-transcriptasa inversa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo mediante ensayos de expresión de genes de Applied Biosystems y maestro de la mezcla 2X de Applied Biosystems o ABGene en un Applied Biosystems 7300 en un Real-Time PCR System Plus StepOne. Los resultados se cuantificaron como los valores de Ct, donde Ct se define como el umbral del ciclo de PCR en el cual amplifica producto se detecta primero, y se define como la expresión génica relativa (la relación de diana /control). Todas las reacciones se realizaron por triplicado y se normalizaron a GAPDH (Applied Biosystems, Carlsabad, CA).
Preparación de extractos nucleares y Western Blot
p>
siRNA transfección
EPAC siRNAs (ON-TARGETPlus siRNA, Dharmacon) a 100 nM. se transfectaron en células PC3 por electroporación (223 V para 23 mseg). Las células se analizaron 48 horas después de la transfección.
Rap1 Ensayo de actividad
niveles Rap1-GTP se midieron usando un ensayo de activación Rap1 Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) siguiendo el protocolo del fabricante.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc). Los datos se presentan como media ± SE y se compararon mediante la prueba t, prueba de Wilcoxon y de una o dos vías ANOVA, respectivamente, seguida por la prueba t post-hoc relevante para determinar los valores de p. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Las células fueron tratadas como se indica y los niveles de VEGF se midieron por ELISA como se describe en Métodos.. (A y B) células PC3 o PC3-cRap1; * P & lt; 0,05, n = 3. Las células LNCaP o LNCaP-cRap1 (C y D); * P & lt; 0,05, n = 2.
Las células fueron tratadas como se indica, y los niveles de VEGF se midieron por ELISA como se describe en Métodos. (A) Reversión del efecto de 8CPT de H-89 en células PC3-cRap1; * P & lt; 0,05, n = 3. (B) Reversión de 6BzcAMP (6 mil millones) efectos por H-89 en células PC3-cRap1; * P & lt; 0,05, n = 3. (C) Reversión de los efectos 8CPT por H-89 en PC3-cRap1cells; * P & lt; 0,05, n = 3.
Resultados
8CPT inhibe el crecimiento de xenoinjerto de células de la próstata Expresando Activado Rap1
Para determinar el efecto de Rap1 activado en la próstata el crecimiento del tumor, inyectamos ratones atímicos con células PC3 que expresan constitutivamente Rap1A63E activado (PC3-cRap1) o tratados con el derivado 8CPT cAMP. Para la entrega 8CPT, los animales fueron tratados por vía subcutánea con PBS o 8CPT utilizando una mini-bomba osmótica. 8CPT se administró a una dosis de 2,5 mol más de 28 días, sobre la base de un estudio piloto anterior mostrando que esta velocidad de infusión fue bien tolerada por los ratones. Durante el periodo de perfusión, los animales mantienen el consumo normal de alimentos y agua, y no mostraron pruebas de la función motora reducida. No se observaron anormalidades patológicas brutas en los principales órganos, lo que indica una falta de efectos tóxicos a la dosis 8CPT dado. El primer día de la infusión fue designado como el Día 0, y los animales fueron sacrificados después de 28 días de tratamiento.
Ni constitutivamente expresado Rap1 (PC3-cRap1 + PBS), ni el tratamiento 8CPT solo (PC3 + 8CPT) alteró significativamente el crecimiento tumoral en xenoinjertos de PC3 (Fig. 1A, 1C). Sin embargo, 8CPT reduce drásticamente el crecimiento tumoral en xenoinjertos de PC3-cRap1 (Fig. 1B, 1C). Análisis de pesos de los tumores confirmó a & gt; 50% de disminución en los tumores de los ratones PC3-cRap1 tratados con 8CPT (Fig 1D.). se requiere Tanto el tratamiento Rap1 y 8CPT activado para este efecto, ya que no se observaron cambios en los tumores en xenoinjertos PC3 8CPT-tratada o PBS-tratada xenoinjertos Rap1.
(A y B) El inhibidor de PKA, H-89 (2,5 mol), invertido inhibición del crecimiento tumoral y la reducción de peso del tumor mediada por 8CPT en xenoinjertos PC3-cRap1. tumores PC3-cRap1 de ratones infundidos con PBS, 8CPT, o H-89 se midieron y el volumen del tumor determinaron como se describe en Métodos; * P & lt; 0,05; n = 8 para cada grupo de tratamiento. (C) CD31 y VEGF inmunoreactividad en tumores PC3-cRap1 tratados como se indica. La inmunotinción se midió como se describe en Métodos.
paneles superiores
: fotomicrografías representativas.
paneles inferiores
: La cuantificación de la tinción inmunohistoquímica de las rebanadas de tumores; * P & lt; 0,05; n = 8 para cada grupo de tratamiento; a.u. = Unidades arbitrarias.
8CPT inhibe la angiogénesis en PC3-cRap1 xenoinjertos
Para controlar el efecto de 8CPT sobre la angiogénesis en los tumores de próstata, Inmunomarcamos rebanadas tumorales fijados en formalina con anticuerpos frente a CD31 y VEGF, un marcador de células endoteliales y un factor proangiogénico, respectivamente. vasos sanguíneos intratumorales (CD31 +) se identificaron por la morfología recipiente y se contaron (Fig. 2A). Los tumores del grupo PC3 de los animales infundidos con PBS o 8CPT tenían números similares de vasos sanguíneos y los niveles de VEGF inmunoreactividad (Fig. 2A, 2B). La inmunorreactividad general VEGF en los tumores de ratón PC3-cRap1 se aumentó en relación con los tumores PC3 ratón sin afectar significativamente la densidad capilar. Sorprendentemente, el tratamiento con 8CPT, en comparación con PBS, reduce drásticamente tanto la densidad de los vasos y la inmunorreactividad VEGF en tumores PC3-cRap1. Estos resultados indican que constitutivamente activa Rap1 induce la producción de VEGF, y 8CPT antagoniza este efecto. Por otra parte, 8CPT reduce la formación de vasos sanguíneos, lo que puede contribuir a la inhibición del crecimiento del tumor de próstata en estos ratones.
8CPT Reduce el continuo crecimiento de los tumores de próstata pre-formada Expresando Rap1
En nuestros experimentos iniciales (Fig. 1), que inyecta PC3-cRap1 células y se trató con 8CPT en el mismo día (día 0) para evitar el crecimiento del tumor. Para determinar si 8CPT también podría bloquear el crecimiento de células tumorales en curso, inyectamos células PC3-cRap1 en ratones y les permitió crecer en un tumor palpable antes del tratamiento con 8CPT a través de minibombas osmóticas (Fig. 2C). Al igual que en el régimen anterior, el tratamiento de 8CPT preexistentes tumores causados reducción de más del 43% en peso del tumor en comparación con los animales infundidos PBS (Fig. 2D). Análisis de proliferación de células tumorales mediante inmunotinción con el anticuerpo Ki67 mostró sólo una disminución modesta después del tratamiento 8CPT, lo que sugiere que la reducción en el número de células se debe también a la pérdida de células (Fig. S1). Sin embargo, la apoptosis por sí solo es poco probable que sea responsable, puesto que la tinción de TUNEL no mostró una diferencia significativa (datos no mostrados). Los resultados indican que 8CPT no sólo actúa para prevenir el crecimiento del tumor, sino también reduce el crecimiento continuo de los tumores preformados.
8CPT Inhibe la Angiogénesis Los inductores en células PC3-cRap1 bajo condiciones hipóxicas Condiciones
Para comprender la mecanismo por el cual 8CPT suprime VEGF en la próstata xenoinjertos de tumor cRap1, hemos desarrollado condiciones de cultivo celular para imitar este efecto. las células tumorales sólidos a menudo crecen en condiciones de hipoxia, y la hipoxia promueve la angiogénesis. Por lo tanto, se analizaron los niveles de proteína VEGF en los medios de comunicación aisladas de células pretratadas durante la noche con 8CPT en el suero reducida y luego se trata adicionalmente con CoCl
2 durante 6 horas para generar condiciones de hipoxia-similares. En las células PC3-cRap1, el tratamiento 8CPT disminución de la producción de VEGF sólo bajo condiciones de hipoxia-como (CoCl
2) (fig. 3A). Por el contrario, no había marcada reducción en la producción de VEGF en células PC3 después del tratamiento 8CPT con la exposición simultánea a CoCl
2 (Fig. 3A). Estos resultados sugieren que la inhibición inducida por 8CPT de la expresión de VEGF observada en los tumores PC3-cRap1 puede recapitula
in vitro
imitando un ambiente hipóxico.
HIF-1α es un factor de transcripción heterodimérico que es upregulated en las células tumorales hipóxicas y promueve la angiogénesis, permitiendo la transcripción de genes pro-angiogénicos como VEGF [30]. Para determinar si la inhibición de HIF-1α podría ser el mediador del efecto sobre los niveles de VEGF 8CPT, analizamos la expresión de proteína HIF-1α en extractos nucleares de células PC3 y PC3-cRap1 tratados con 8CPT y CoCl
2. Como era de esperar, un aumento significativo en el nivel de proteína HIF-1α se observó tanto en el PC3 y las células PC3-cRap1 siguiente CoCl
2 de tratamiento. Sin embargo, los niveles de proteína HIF-1α disminuyó cuando las células PC3-cRap1 pero no fueron pretratados con células PC3 8CPT (Fig. 3B). De acuerdo con este resultado, se observó una disminución significativa de VEGF mRNA sólo en células PC3-cRap1 tratados tanto con CoCl
2 y 8CPT (Fig. 3C).
8CPT regula la producción de VEGF en la próstata líneas celulares tratadas con un activador fisiológico de Rap1
Rap1 se activa por un número de factores endógenos incluyendo estroma 1α derivado Factor (SDF-1α), una quimioquina que se une al receptor CXCR4 y facilita homing de las células derivadas de médula ósea [ ,,,0],31], [32]. Como se muestra anteriormente [31], el tratamiento de células PC3 con SDF-1α durante 20 minutos aumentó notablemente el nivel de activado endógeno Rap1-GTP (Fig. S2). No se observaron niveles elevados de endógena Rap1-GTP, ya sea en células PC3-cRap1 PC3 o después del tratamiento durante la noche de células con 8CPT. Estos resultados indican que, o bien el tratamiento agudo SDF-1α o activación constitutiva Rap1 pero no el tratamiento 8CPT sostenida conduce a la actividad Rap1 elevada en las células de tumor de próstata.
Para determinar si Rap1 activa en respuesta a SDF-1α actúa de manera similar a constitutivamente Rap1 activados, se investigó el efecto de la SDF-1α y 8CPT de VEGF secretada. SDF-1α induce la producción de VEGF en células PC3 en comparación con células PC3 no tratados (Fig. 4A), y esta inducción fue bloqueada en las células PC3 que expresan Rap1GAP, una GTPasa Rap1 que inactiva Rap1 (Fig. S3). Además, el tratamiento con CoCl
2 inducida por la producción de VEGF en células PC3 más estimuladas con SDF-1α, similar a CoCl tratamiento
2 de las células PC3-cRap1 (Fig. 4A, 4B). Al igual que con las células PC3-cRap1, 8CPT invierte la inducción de la producción de VEGF en células PC3 tratadas con SDF-1α en condiciones de hipoxia.
Resultados similares se observaron también en una línea menos agresiva, dependiente de andrógenos tumor de próstata de células, LNCaP, que, o bien se trató con SDF-1α o con expresado de forma estable constitutiva Rap1 (Fig. 4C, 4D). Estos resultados indican que la regulación de la producción de VEGF por 8CPT en condiciones hipóxicas no se limita a un tipo de célula y se observa en respuesta a la fisiológica, así como la activación constitutiva de Rap1.
8CPT regula la producción de VEGF Aguas abajo de Rap1
Para entender el papel de la activación Rap1 en la regulación de la producción de VEGF, estudios similares que implican 8CPT o CoCl
2 tratamiento se realizaron en células PC3 no estimuladas o estimuladas SDF-1a-que expresan de forma estable Rap1GAP. En general, los niveles de VEGF se redujeron como resultado de la expresión Rap1GAP (Fig. S4). Aunque la inducción debido a SDF-1α se suprimió por completo, CoCl
2 todavía estimuló la producción de VEGF en presencia de Rap1GAP, en consonancia con la estabilización de HIF-1α. Además, el tratamiento previo durante la noche con 8CPT todavía reduce CoCl
2 estimuló la producción de VEGF-, coherente con nuestra observación de que 8CPT actúa aguas arriba de HIF-1α para reducirlo niveles de expresión (véase la Fig. 3B). Finalmente, 8CPT pretratamiento no redujo la actividad constitutiva Rap1 (Fig. S2), lo que sugiere que actúa aguas abajo de Rap1. Tomados en conjunto, los datos sugieren que 8CPT inhibe la producción de la proteína VEGF mediante la inhibición o la inducción hipóxica Rap1 de HIF-1α.
8CPT regula la producción de VEGF a través de PKA en células tumorales de próstata
Aunque 8CPT activa a través de Rap1 Epac en las células endoteliales [8], nuestros resultados actuales indican que 8CPT antagoniza activa la función Rap1 en las células tumorales de próstata epiteliales lo que sugiere que un mecanismo diferente es responsable. Consistente con esta hipótesis, el agotamiento parcial de Epac1 y Epac2 de siRNAs no tenía ningún efecto sobre VEGF secretada en las células PC3-cRap1 (Fig. S5), aunque no podemos descartar un papel para EPAC.
8CPT puede activar PKA aunque su afinidad por Epac es 107 veces mayor [19], [33]. Para probar esta posibilidad, se determinó si 8CPT estimula PKA en células PC3 y PC3-cRap1 usando fosforilación VASP como un indicador de la activación de PKA. 8CPT activa PKA similar a la 6-benzoil-cAMP (6BzcAMP), una más selectivo activador PKA (Fig. S6). A continuación, examinó la capacidad de dos inhibidores de PKA, H-89 o PKI, para revertir la inhibición de la producción de VEGF mediada por 8CPT. El tratamiento de células PC3-cRap1 expuestos a CoCl
2 y 8CPT con los inhibidores de PKA rescató parcialmente la inhibición de la producción de VEGF en células PC3-cRap1 (Fig 5A;.. Fig S7). Además, 6BzcAMP imitaba 8CPT mediante la inhibición de la producción de VEGF en células PC3-cRap1 en condiciones de hipoxia, y esta inhibición se invirtió parcialmente por H-89 o PKI (Fig 5B;.. Fig S8). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que 8CPT actúa como un inhibidor de factores pro-angiogénicos en las células tumorales de próstata Rap1 estimulada por hipoxia a través de la activación de PKA.
Para probar este mecanismo en los tumores de próstata, se determinó si la inhibición de PKA podría revertir la inhibición del crecimiento del tumor y la angiogénesis mediada por 8CPT
in vivo
. Después de la inyección de los ratones atímicos con la proliferación de células PC3-activamente cRap1, los animales fueron tratados por vía subcutánea con PBS, 8CPT, o H-89 + 8CPT utilizando minibombas osmóticas. Como ya se observó en los ratones inyectados con células PC3-cRap1, los tumores crecieron de tamaño con el tiempo, pero el crecimiento del tumor se redujo significativamente tras el tratamiento con 8CPT (Fig. 6A). Sin embargo, el tratamiento simultáneo con 8CPT y H-89 invierte la inhibición del crecimiento del tumor causado por 8CPT en xenoinjertos PC3-cRap1. Del mismo modo, la disminución de 65% en peso del tumor de los animales tratados con 8CPT fue rescatado por el tratamiento concurrente con H-89 (Fig. 6B). Por último, como se muestra en la Fig. 6C, el análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteínas CD31 y VEGF en secciones de ratones infundidos con PBS, 8CPT, o H-89 + 8CPT indicó que el inhibidor de PKA H-89 también revirtió la reducción de CD31 y VEGF inmunoreactividad mediada por 8CPT en el PC3- xenoinjertos cRap1. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inhibición de PKA podría revertir la inhibición inhibición del crecimiento tumoral y la angiogénesis mediada por 8CPT
in vivo
.
Discusión
Utilizando una combinación de análisis de ambos
in vitro
y
in vivo
sistemas, nuestro estudio proporciona evidencia de que una nueva interacción entre Rap1, EPAC, y PKA regula la inducción de tumor microambiente de la angiogénesis. Hemos demostrado previamente que la activación sostenida de Rap1 por 8CPT /EPAC o cRap1 inhibe la quimiotaxis de las células endoteliales y la angiogénesis [8], [9]. Para probar la importancia de la activación Rap1 en un modelo de xenoinjerto de tumor de próstata, se analizaron los efectos de 8CPT o cRap1 en células PC3. 8CPT no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral en las células PC3 de los padres, pero redujo significativamente no sólo el tamaño del tumor, sino también VEGF y la angiogénesis en los animales inyectados con células PC3 que expresan cRap1. Sorprendentemente, 8CPT inhibe la inducción de VEGF y el crecimiento del tumor de próstata mediante un mecanismo que implica la activación de PKA en lugar de EPAC /Rap1. Nuestros resultados indican que la activación Rap1 en las células tumorales de próstata promueve la angiogénesis en condiciones de hipoxia-como a través de HIF-1α y VEGF, y la activación de PKA antagoniza esta inducción (véase el esquema representado en la Fig. 7). Además, nuestros estudios sugieren que las células endoteliales se activan preferentemente Epac en respuesta al tratamiento 8CPT sostenida mientras que las células epiteliales de la próstata preferentemente activan PKA.
Tanto Rap1 y PKA se han relacionado anteriormente para el cáncer en un modelo de células epiteliales de próstata. líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-dependientes -independiente y expresan endógeno Rap1 [31], [34]. Rap1 se activa por una variedad de factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), endotelina, y el ácido lisofosfatídico (LPA) a través de diferentes mecanismos, incluyendo la activación de cAMP de Epac [35]. Tratamiento de LNCaP, pero no de cáncer de próstata PC3 células con forskolina o cAMP provoca la fosforilación Rap1 y la activación por la proteína quinasa A (PKA) [36], y se activa Rap1 se ha demostrado que induce la vía MAPK mediante la estimulación de B-Raf [37], [ ,,,0],38]. Sin embargo, los resultados que describimos aquí sugieren que un mecanismo diferente es responsable de los efectos observados. En primer lugar, vemos los efectos tanto en las células PC3 y LNCaP. Además, en lugar de potenciar la actividad de Rap1, PKA actúa de forma antagonista a suprimir la producción de VEGF inducida por Rap1.
Rap1 se ha implicado en la progresión de la tumorigénesis en gran medida a través de la regulación de la adhesión celular y la célula-célula cruces. Por ejemplo, Rap1 promueve la invasión y la metástasis en células PC3 a través de la regulación de la α4β3 integrinas y αvβ3 [31]. Por el contrario, un estudio reciente informó que 8CPT inhibe la migración de células en células de cáncer de próstata a través de la activación de Epac [39]. Nuestros resultados sugieren que este efecto podría ser debido en parte a la activación de PKA por 8CPT, una interpretación consistente con el antagonismo observada entre Rap1 y PKA en células de tumor de próstata. Nuestros resultados también sugieren que activado Rap1 en las células tumorales de próstata sensibiliza las células a la inhibición de la actividad de HIF-1α por PKA.