Extracto
Antecedentes
witaferina A, que es una lactona esteroides de origen natural, se ha encontrado para evitar la angiogénesis y la metástasis en diversos modelos tumorales. También ha sido reconocido por diferentes grupos de papeles prominentes anti-cancerígenos. Sin embargo, a pesar de estos estudios sobre withanólidos, su detallada mecanismo anti-metastática de acción sigue siendo desconocido. El presente estudio ha contrapesado para hacer frente a la maquinaria involucrada en la regulación de la invasión de derivado estable de witaferina A, 3-azido witaferina A (3-azidoWA) en células PC-3 HeLa y de próstata cervical humano.
Métodos y Principal hallazgos
Sub concentración tóxica de 3-azidowithaferin a (3-azido WA) inhibe la motilidad celular y la invasión del cáncer en la curación de heridas y Boyden cámara de invasión por la supresión de la actividad de MMP-2 en zimografía de gelatina y su expresión se ha demostrado ser un obstáculo importante en la quimio-sensibilidad. Hemos descubierto un nuevo mecanismo de 3-azidoWA inducida extracelular pro-apoptótica supresor de tumor candidato Par-4 estimulación de proteínas en medio acondicionado y también notado una concomitante reducción marcada en pAkt y pERK señalización mediante análisis de inmunotransferencia. Además, nuestros resultados sugieren zimografía 3-azidoWA inducida por la inhibición de MMP-2 fue mediado a través de secreción Par-4. La inhibición de la apoptosis por 3-azidoWA no pudo restaurar la actividad gelatinasa MMP-2. Además de esto, nuestro
in vivo
datos de experimentos en animales mostraron 3-azidoWA abrogó la neovascularización en forma dependiente de la dosis en el ensayo de tapón de Matrigel ratón.
Conclusión /Importancia
En este informe, se encontró que 3-azidoWA suprime la motilidad y la invasión de las células HeLa y PC-3 en MMP-2 de forma dependiente. Nuestro
in vitro
resultado sugiere que las dosis sub-tóxica de 3-azidoWA mejoran la secreción extracelular de Par-4 que abolió secretora expresión y la actividad de MMP-2. El agotamiento de secretora Par-4 restauró la expresión de MMP-2 y la invasión de la capacidad de las células HeLa y PC-3. Además, nuestros hallazgos implican que azidoWA 3-fosfo-ERK atenuada interna y la expresión de fosfo-Akt en una forma dependiente de la dosis podría desempeñar un papel clave en la inhibición de la angiogénesis del ratón en un 3-azidoWA
Visto:. Rah B, Amin H, K, Yusuf, Khan S, G Jamwal, Mukherjee D, et al. (2012) A Novel MMP-2 inhibidor de 3-azidowithaferin A (3-azidoWA) abroga Cancer Cell La invasión y la angiogénesis mediante la modulación extracelular Par-4. PLoS ONE 7 (9): e44039. doi: 10.1371 /journal.pone.0044039
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2012; Aceptado: August 1, 2012; Publicado: 4 Septiembre 2012
Copyright: © Rah et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se consideran vías de secreción extracelular de jugar papel fundamental en. Fisiología humana. hormonas vitales del cuerpo y los factores de crecimiento son secretadas y controlan el desarrollo y la diferenciación de órganos en condición fisiológica normal. Del mismo modo, (extracelulares), las proteínas de los principales rasgos sistémicos
in vivo
función durante el crecimiento del tejido y la apoptosis [1]. Próstata respuesta apoptótica 4 (Par-4) se expresa de forma ubicua y la evolución de proteínas pro-apoptóticas conservada cuya expresión se correlaciona principalmente con las células que se someten a la apoptosis debido a los insultos exógenos [2]. Aparte de su función intracelular, la nueva perspectiva de la secreción extracelular en diferentes células de cáncer ha aumentado el potencial terapéutico de Par-4 [3]. Recientemente, Burikhanov et al. han demostrado que las células de mamíferos en general causados secreción de Par-4. Sin embargo, la inducción de apoptosis por extracelular Par-4 se produce a través de superficie celular GRP-78 fue encontrado para promover la invasión celular y la tumorigénesis [3]. La estabilización de los pro-angiogénico GRP-78 por Par-4 se ha designado un papel anti-invasivo de extracelular Par-4.
La metástasis es un proceso de múltiples etapas que implica la migración celular y la proteolisis pericelular de ECM que media células de cáncer de protrusión [4]. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) son responsables de la degradación de las barreras ambientales, tales como la matriz extracelular y la membrana basal [5], [6]. Entre los miembros de la familia de MMP, MMP-2 y -9 se considera generalmente que es el tumor maligno de diversos tumores, así como mal pronóstico de muchos tipos de cáncer [6]. Por lo tanto, las MMP son capaces de tipo de escisión de colágeno IV membrana basal (MMP-2 y -9) y un valor añadido para el desarrollo de fármacos. estudios preclínicos convincentes de diversos laboratorios han proporcionado un apoyo abrumador a la relación directa entre MMP-2 sobre la expresión y la invasión tumoral /metástasis [7], [8]. Durante la fase de desarrollo, muchos de los inhibidores de MMP fracasaron en los ensayos clínicos de fase temprana debido a la extensa homología entre los dominios catalíticos de MMP. Por otra parte, la mayoría de los /inhibidores semisintéticos sintéticos de MMP fueron retirados durante los ensayos clínicos debido al cumplimiento terapéutico reducido intolerancia al fármaco a largo plazo no anticipado [9]. Por otra parte, recientemente, los productos naturales o derivados de productos naturales se han considerado extremadamente potencial para abrogar MMP-2 y -9 mediada invasión /metástasis ya sea
in vitro
o
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configurado . Estos incluyen extracto acuoso de canela [10], extracto de té verde [11], la curcumina [12], y saponina esteroide con el fenogreco [4], chitooligosacharides (COS) a partir de productos naturales marinos [13].
Un witaferina (WFA) es un prototipo de la clase withanolide de productos naturales que exhiben diversas actividades farmacológicas, incluyendo antitumorales, anti-inflamatorios, y efectos antiangiogénicos, cardioprotectores inmunomoduladores [14], [15]. Las propiedades bioactivas de witaferina A incluye la remodelación del citoesqueleto mediante la unión a la anexina II [16], antiangiogénica [17], [18] y la actividad antitumoral [19], [20] por la inhibición de proteasomal quimotripsina [21] y la inducción de apoptosis mediante la inhibición de la proteína quinasa C [22]. Recientemente, Oh et al han demostrado la activación de la caspasa-3 a través de witaferina A [23]. Aparte de su actividad anti-canceroso, witaferina A también se ha documentado para su propiedad anti-inflamatoria mediante la supresión de la alfa-2-macroglobulina [24]. Con nuestro reciente éxito hacia el desarrollo de una biblioteca de witaferina A análogos semisintéticos, lo racional estrategia de detección de plomo a la generación de 3-azidoWA, el candidato potente contra el cáncer [25]. A pesar de la importancia de la funcionalidad α-β-insaturado en el anillo A de witaferina A y el potencial anticáncer de 3-azidoWA hizo evidente, siendo su mecanismo de acción no está claro.
En este estudio se evaluó la función mecánica de 3-azidoWA (3-azido WA), un azido witaferina derivado en la motilidad y la invasión de las células cancerosas. También queríamos a vincular este estudio con las vías de señalización
a saber
, ERK, Akt, que se activan en diferentes tipos de cáncer y potencia la invasión y metástasis de diversas células cancerosas. Los resultados de estos estudios nos proporcionan información importante sobre la función mecánica de 3-azidoWA en la abrogación de la invasión de células de cáncer de cuello uterino y de próstata que podrían ser en-enrutado a través extracelular Par-4.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y anticuerpos
Todas las líneas celulares se adquirieron de Colección Europea de Cultivo de células (ECACC), suero bovino fetal (FBS), RPMI-1640, medio esencial mínimo (MEM), penicilina G , estreptomicina, tripsina-EDTA se obtuvieron de Invitrogen Corp. 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), paraformaldehído, Crystal violeta, estaurosporina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Dithiothretol (DTT), NP-40, cóctel inhibidor de proteasa, gelatina, Brij- 35, Comassie Brilliant Blue (R-250), Brefeldina A (BFA), tunicamicina, TRAIL, anexina V-FITC apoptosis kit de ensayo de detección, dimetilsulfóxido (DMSO), el reactivo de Bradford se obtuvo de Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO ) Propedium yoduro y Ultracruz DAPI medio de montaje se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Z-VAD Pan inhibidor de la caspasa, recombinante humano VEGF-165 y FGF humano recombinante (básico 146 aa) se obtuvieron de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN). Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 /MEM que contiene 10% de suero fetal bovino en presencia de 70 mg /L de penicilina y 0,1 g /L de estreptomicina y se incubaron a 37 ° C con 95% de aire y 5,0% de dióxido de carbono. Se utilizaron todas las células en los experimentos durante la fase lineal de crecimiento. Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes fuentes comerciales: anti-Par-4, anti-MMP-2, anti-Akt, anti-ERK, y anti-TIMP-1 de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), anti-p-Akt desde y anti-caspasa-3 (Señalización celular) y anti-β-actina, anti-p-MAPK (Sigma Chemical, St. Louis, MO).
Síntesis de 3-azido WA
se añadió trietilamina a una solución de TMSN
3 (1,2 equiv.) en metanol seco (3,0 ml) a temperatura ambiente (RT) para mantener el pH de 8,5. Witaferina A (1,0 equiv., 470 mg, y 1,0 mmol) se disolvió por separado en metanol seco (2,0 ml) y la solución se añadió a la solución metanólica de TMSN
3 y se mantuvo durante la 3,5 h. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. Después de la terminación, la mezcla de reacción se secó completamente, se disolvió en agua (5,0 ml) y se extrajo con CHCl
3 (10 ml) tres veces para obtener el producto 3-azidoWA. Para 3-azidoWA tratamiento, 3-azidoWA se disolvió en 100% de DMSO y se diluyó con medio de cultivo de modo que la concentración de trabajo de DMSO fue de menos de 0,2%.
clonogénico Ensayo
El ensayo se realizado de acuerdo con el método descrito previamente [10]. Brevemente, las células HeLa se colocaron en placas a una densidad de siembra de (1 × 10
3 células /pocillo) en placas de grado de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Después de 24 h el medio de cultivo se cambió y se añadió nuevo medio y las células se expusieron a diversas concentraciones de 3-azidoWA DMSO /vehículo durante 5 días a 37 ° C incubadora en 5% de CO
2. Más tarde, las colonias obtenidas se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con una solución de 0,5% de cristal violeta. Las colonias de las placas se contaron y promediaron a partir de los campos observados al azar (n = 3) y fotografiado con la cámara amplia c-7070 Olympus 700 M microscopio invertido.
Ensayo de proliferación celular
La célula viabilidad se determinó por el método de absorción de colorante MTT estándar [10]. Brevemente, HeLa, PC-3, A549 y las células DU-145 (3 × 10
3 células /pocillo) se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se trataron con diferentes concentraciones de 3-azidoWA por triplicado para que la final concentración de disolvente DMSO fue 0,2%. Después de 48 h de incubación, se añadió solución de MTT y las células se cultivaron durante otras 4 horas a 37 ° C en 5,0% de CO
2 incubadora. La cantidad de derivado de formazan de color se determinó midiendo la densidad óptica (OD) mediante un lector de microplacas TECAN (Infinito M200 PRO) a 570 nm. El porcentaje de viabilidad se determinó de acuerdo con el protocolo descrito [10].
Motilidad de Scratch (Curación de Heridas) Ensayo
El ensayo se realizó como se describió anteriormente [4]. En pocas palabras, HeLa y PC-3 células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una concentración de (5.5 × 10
5 células /pocillo) y se dejó para formar una monocapa confluente durante 24 h, fue entonces el suero en ayunas durante 24 h . Después de que la monocapa se rascó con una punta de pipeta estéril (200 l), se lavó con medio libre de suero para eliminar flotado y células desprendidas y fotografiado (tiempo 0 h). Las células se trataron sucesivamente en medio que contiene suero bajo (1,0%) en presencia de diferentes concentraciones de 3-azidoWA (0,25, 0,50, y 0,75 M) junto con vehículo DMSO durante 24 h. áreas heridas fueron fotografiados progresivamente con la Olympus C-7070 con los 700M cámara (100 aumentos) .El porcentaje de cierre de la herida se calculó mediante la siguiente ecuación: cierre de la herida% = [1- (área de la herida en t área
1 /herida en t
0) x 100%], donde t
1 es el tiempo después de la herida y t
0 es el tiempo inmediatamente después de la herida.
inmunotransferencia
o HeLa células PC-3 (1 x 10
6 células) se incubaron durante la noche y se expuso a diferentes concentraciones de 3-azidoWA junto con DMSO como vehículo. Las células fueron consecuencia enjuagaron con PBS, se tripsinizaron y se recogieron después de 24 h y después se lisaron con tampón de lisis (HEPES 1,0 mM /l, KCl 60 mM /L, NP-40 0,3%, EDTA 1,0 mM /L, DTT 1,0 mM /l, sodio orthovandate 1,0 mM /L, PMSF 0,1 mM /l, inhibidor de la proteasa cóctel). Las extracciones de células se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford estándar. Igualdad de cantidad (20 g) de proteína de cada muestra se sometió a SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a una membrana (Millipore), se bloquearon con 5,0% (w /v) de leche sin grasa en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y se sondaron con anticuerpos relevantes para 3 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Posteriormente transferencias se lavaron y se sondaron con anticuerpos secundarios específicos de especies acoplados a peroxidasa de rábano picante. Las proteínas inmunorreactivas se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia más (Amersham).
La apoptosis, Anexina V-FITC y PI tinción
Después de los tratamientos con 3-azidoWA /vehículo DMSO, las células adherentes (HeLa y PC- 3) se recogieron por digestión con tripsina y se lavaron dos veces con PBS frío. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% durante 10 min seguido de incubación con DAPI que contiene medio de montaje para 15 min /RT en la oscuridad y la apoptosis se detectó mediante microscopía de fluorescencia (aumento de 100x) .La Anexina V-FITC experimentos se realizaron con el Anexina V Kit de detección de FITC apoptosis de acuerdo con el manual del fabricante. Brevemente, los sedimentos celulares se resuspendieron en 600 l de tampón de unión (HEPES 10 mM [N-2- hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfónico], NaCl 140 mM, y CaCl2 2,5 mM, pH 7,4), y se tiñeron con 6,0 l Anexina V-FITC y 10 solución de tinción de yoduro de propidio l durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se analizaron sucesivamente por FACS (BD FACS Aria II) usando el software BD Diva.
Gelatina Zymography
La actividad de la gelatinasa de MMP-2 se evaluó mediante el método normalizado previamente. En consecuencia, HeLa y PC-3 células en cultivo confluente sub (densidad celular ~70-80% del cultivo confluente) se actualizan con el nuevo medio y se mantienen para la incubación con concentraciones crecientes de 3-azidoWA durante 48 h. Se emplearon los medios condicionales obtenidos a partir de ambas muestras tratadas y no tratadas para la estimación de la proteína y la misma cantidad de proteínas totales (20 g) se mezclaron con tampón de muestra (2,0% de SDS, 25% de glicerol, 0,1% azul de bromofenol y 60 mM Tris-HCl, pH 6,8). Gelatina zimografía de las muestras se llevó a cabo utilizando 7,5% en geles de SDS-poliacrilamida que contiene 0,1% de gelatina a 100 V durante 3 horas a 4 ° C. Los geles se consecuencia enjuagaron con tampón de lavado (2,0% de Triton X-100 en agua dd) a temperatura ambiente para eliminar SDS seguido de incubación durante la noche a 37 ° C en tampón TCNB (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, mM CaCl 10
2, 0,02% NaN
3). Los geles se tiñeron con azul Comassie R-250 (Sigma) (0,125% Comassie blue R-250, 50% de metanol, 10% de ácido acético) durante 1-1,5 h y destained con solución decolorante (20% de metanol, ácido acético 10%, 70% de agua dd). actividad de gelatinasa se detectó mediante la observación de las bandas no teñidas sobre un fondo azul en Comassie gel teñido.
Invasión de Matrigel ensayo
El efecto del tratamiento con 3-azidoWA en la invasión de células se determinó usando BD Biocoat invasión tumoral Ensayo Sistema (BD Bioscience, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, HeLa y PC-3 (1,25 × 10
6) las células se cultivaron en presencia de 0,25, 0,50, y 0,75 M 3-azidoWA o vehículo DMSO durante 24 h en medio libre de suero en las cámaras /insertos superiores, y los pocillos inferiores estaban llenos de quimio-atrayente (medio completo con 10% de FBS). Las células se dejaron migrar a 37 ° C. Después de 24 h se eliminaron los filtros de policarbonato recubiertos con Matrigel, las células no migratorias fueron separados de la cámara superior con un hisopo de algodón y el inserto se fijaron con metanol y se tiñeron con una solución de 0,1% de cristal violeta. Para cada réplica (n = 3), la migración de las células se cuantificó contando las células teñidas (células por cinco campos) bajo microscopio invertido.
transfección transitoria
células PC-3 y HeLa se cultivaron en un medio apropiado tal como se describe en la sección método, transfectadas con GFP y GFP-Par-4 (generosos donativos del doctor Vivek Rangnekar, Universidad de Kentucky, KY) utilizando lipofectamina-2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células en fluorescencia verde se visualizaron bajo microscopio de fluorescencia con la cámara y se empleó el medio condicionado por zimografía de gelatina.
inmunocitoquímica
Para la inmunotinción HeLa y se cultivaron células PC-3 en cubreobjetos en placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de 0,5 x 10
6 células por pocillo. Después de 24 h, las células se trataron con 3-azidoWA (1,0 M) o vehículo DMSO y estaurosporina control positivo (25 nM) en presencia o ausencia de inhibidor pan-caspasa por 48 h. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se fijaron en 2,5% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente, se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5,0 min y se bloquearon sucesivamente en 0,5% de BSA durante 1 h. Para la detección de la actividad de caspasa, las células se incubaron con la caspasa-3 anticuerpo primario (1:5000 dilución en tampón de bloqueo) durante 1 h y, en consecuencia lavó tres veces con PBS, después se incubaron con rojo Texas (Invitrogen) anticuerpo secundario conjugado ( 1:10000 dilución) durante 1 h y se lavó, montado con medio de montaje ultracruz y se analizó con Zeiss LSM-510 microscopio metaconfocal. Las imágenes fueron capturadas a 63x aumentos.
En vivo Matrigel angiogénesis Ensayo
Se mantuvieron cuatro a 6 semana /BL6J ratones viejos C57 (Instituto Indio de Medicina Integral central Animal House, Jammu, India) a 20-22 ° C en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Se llevaron a cabo estudios con animales de acuerdo con los protocolos experimentales que fueron aprobados por el comité de ética animal del Instituto Indio de Medicina Integral, Jammu, India. Los animales fueron inyectados por vía subcutánea, en los flancos derecho con Matrigel 0,5 ml de hielo-frío (BD Bioscience) suplementado con VEGF-A (250 ng /ml) y bFGF (500 ng /ml). Los ratones de control fueron inyectados con Matrigel sin VEGF-A y bFGF. Al final de cada estudio, los animales fueron sacrificados para eliminar tapones y fotografías que muestran el grado de vascularización de Matrigel fue tomada mediante el uso de una cámara Nikon. La neovascularización de los tapones de Matrigel se cuantificó mediante el uso de 4 ml de reactivo de Drabkin añadiendo así homogeneizó 20 l de neovascularised Matrigel. Después de mezclar bien, se midió la absorbancia con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm para estimar la hemoglobina. La estimación de la hemoglobina se calculó utilizando la fórmula Hb (g /dl) = absorbancia de la muestra /absorbancia de la concentración × estándar de la norma.
Un estudio preliminar se llevó a cabo para determinar el tiempo para la neovascularización óptima de Matrigel tapones para desarrollar . Con el fin de hacer esto, los tapones se retiraron de los ratones de control (sin adición de VEGF-A y bFGF) al final del día 4, 7 y 11. Los tapones que contenían VEGF-A y bFGF se retiraron de los ratones al final del día 2, 4, 7 y 11 después de la inyección de Matrigel. Estandarizar el momento óptimo para la neovascularización, se realizó un estudio de respuesta a la dosis usando 3-azidoWA en la que el compuesto se administró a 1, 10, 20, 30, y 50 mg /kg /d, i.p. durante 3 días (8
th, 9
th y 10
º). Al final de la duración, los tapones de Matrigel se eliminaron para la visualización y la cuantificación. Después de identificar las dosis de WA 3-azido que inhibe la vascularización, el número de dosis para inhibir la neovascularización (estudio preventivo) o interrumpir la vasculatura establecida (estudio de tratamiento) se investigó. A los ratones del estudio de prevención se dosificaron con (30 mg /kg /d, i.p.) durante 1-4 días después de 24 h de la inyección de Matrigel. Siete días después de la inyección de Matrigel tapones ratones se sacrificaron y los tapones eliminados para la visualización y la cuantificación.
Para el estudio de tratamiento, la neovascularización se dejó desarrollar durante un período de 7 días. Los grupos de animales se dosificaron con compuestos de día 8 (1-día de dosificación) o días 8-10 (3 días de dosificación) a 30 mg /kg /d, i.p. Los efectos sobre la vasculatura establecida fueron evaluados 11 días después de la inyección de los tapones de Matrigel.
Análisis estadísticos
Los datos se expresaron como media ± SEM. Las comparaciones utilizan
t de Student
. P & lt; 0,05 se asignaron valores importancia
Resultados
3-azidoWA La apoptosis es un agente anti-proliferativo e induce en células HeLa PC-3 y
A es un witaferina. potente agente citotóxico y mostró propiedades de inhibición del crecimiento en los experimentos de cultivo de células tumorales [19], [26]. Tan bueno como molécula parental witaferina A, la derivada de witaferina, probado 3-azidoWA (Fig 1, A.) Exhibió significativamente efecto anti-proliferativo en un panel de líneas celulares (que tienen IC
50 dentro de un rango de 800 nM - 1,0 M) [25] (Fig. 1, B). Para una confirmación adicional de la apoptosis por 3-azidoWA, se realizó Anexina V-FITC tinción de la 3-azidoWA tratada células HeLa. Como se muestra en la Fig. 1, las células C 59,1% temprano de apoptosis en comparación con 72,5% con 25 estaurosporina nM, aparecieron cuando las células HeLa se trataron con 1,0 mM 3-azidoWA para 24 h. Por tinción con DAPI se observó que 1,0 M de 3-azidoWA, no 0,5 M indujeron la apoptosis en Hela y células PC-3 en 24 h de incubación en comparación con estaurosporina control positivo (figura 1, D). Se observaron primeras células apoptoicos Un pases residual relacionado en los datos de FACS (a menor concentración de 0,25 M de tratamiento de 3 azidoWA), sin embargo, una concentración más alta (1,0 M) de 3-azidoWA, dar lugar a las células hacia la apoptosis con la condensación de la cromatina en torno a la nuclear periferia acompañado de la reducción de tamaño nuclear (puntas de flecha en blanco, Fig. 1, D). Activa la caspasa-3, cuantificado por Western blot mostró escisión de la caspasa-3 en 1,0 M de 3-azidoWA tratamiento, pero no en dosis sub-tóxicos (0,5 M) (Fig. 1, E). En conjunto, estos resultados demuestran que 3-azidoWA es un citotóxico prospectivo y apoptosis induciendo derivado de productos naturales.
(A) Síntesis de 3-azidoWA. (B) Efectos de la 3-azidoWA sobre la proliferación celular de A549 (cáncer de pulmón), PC-3, DU-145 (cáncer de próstata) y HeLa (cáncer cervical) líneas celulares se determinaron mediante el ensayo de MTT. (C) 3-azidoWA junto con vehículo DMSO y las células tratadas de control de estaurosporina positivos se analizaron mediante FACS, (como se indica); representación gráfica de los resultados muestran proporción de células no apoptóticas (Q3), temprana de apoptosis (Q4), necrótico (Q1) y células apoptóticas tarde (Q2). las células (D) HeLa (5 × 10
4) se cultivaron en portaobjetos de cámara y se trató con 3-azidoWA (0,25, 0,50 y 1,0 M) junto con vehículo DMSO y estaurosporina control positivo (25 nM) durante 24 h. Después de la fijación, las células se tiñeron con la tinción nuclear DAPI y se fotografiaron bajo el microscopio de fluorescencia (100x aumentos) para identificar los núcleos apoptóticos (puntas de flecha blanca). las células (E) HeLa fueron tratadas con concentraciones crecientes de 3-azidoWA como se indica, la procaspasa-3 y caspasa-3 escinden expresiones se determinaron por transferencia de Western junto con el control de carga β-actina.
3- azidoWA inhibe la motilidad celular, invasión y la formación de colonias
a medida que se conocían withanolidos para inhibir la capacidad de invasión de las células del cáncer [27], nos propusimos estudiar el efecto de 3-azidoWA sobre el potencial invasivo de células HeLa y PC-3 células
in vitro.
heridas curativas ensayos se utilizaron para determinar si la concentración sub-tóxica de 3-azidoWA podría inhibir la motilidad de las células HeLa y PC-3. Después de 48 h, la monocapa de células de resultaron heridas, las células tratadas DMSO vehículo se había completamente lleno en el área despejada (Fig 2, A.), Mientras que el tratamiento con 0,50 y 0,75 mM de 3-azidoWA significativamente (p & lt; 0,05) inhibió la motilidad de Hela y células PC-3, al igual que el tratamiento con estaurosporina (A y B, Fig. 2) (Fig. S1, A y B).
células (A) HeLa (0,5 × 10
5 células /pocillo) se cultivaron hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos de seis bien y se rascó con punta estéril; 3-azidoWA se añadió a las culturas como se indica. áreas rayadas se fotografiaron (100 aumentos) en cero horas y, posteriormente, de nuevo 24 h más tarde para evaluar el grado de cicatrización de heridas. (B) Las áreas rayadas se cuantificaron en tres campos al azar en cada tratamiento, y los datos se calcularon a partir de tres experimentos independientes. (C) HeLa (1 × 10
3) células /pocillo se cultivaron y se trataron con diversas concentraciones del compuesto 3-azidoWA durante 5 días a 37 ° C y luego se tiñeron con cristal violeta (para más detalles ver materiales y métodos), número de colonias teñidas se contaron, fotografiado de datos (D) (100x) y se calcularon a partir de tres experimentos independientes. Columnas significan; bares SD de tres experimentos independientes. P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con el control sin tratar. (E) la migración de células se determinó mediante el ensayo de cámara de Boyden modificada como se describe en Materiales y Métodos. células HeLa (2 × 10
5) se sembraron en la parte superior de cámara en la presencia o ausencia de 0,25, 0,50, y 0,75 M de 3-azidoWA. Las células se dejaron migrar durante 24 h, momento en el cual las células migratorias en la mitad inferior de la membrana de inserción se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se contaron bajo un aumento de 200x. (F) las células invasoras se contaron usando software de imagen como el número de células que migraron por campo de alta potencia (HPF). Cinco campos fueron contados por triplicado (n = 3) de cada inserto. imágenes de células se obtuvieron utilizando microscopio Nikon Eclipse E200 incorporado con la cámara. Columnas significan; bares SD de tres experimentos independientes. P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con el control sin tratar
capacidad formación de colonias de células HeLa y PC-3 fueron atenuadas por el tratamiento 3-azidoWA de una manera dependiente de la dosis.. Como se muestra en la Fig. dosis 2, C sub-letales de 3-azidoWA disminución de la capacidad de formación de colonias de células HeLa en forma estadísticamente significativa (P & lt; 0,05). (Fig. 2, D) (Fig. S1, C y D)
Un evento crítico en la invasión tumoral y la metástasis es la capacidad de las células tumorales para invadir a través de la matriz extracelular, permitiendo que las células tumorales se muevan más allá de los confines de ambiente del tumor primario [28]. Para examinar el efecto de 3-azidoWA en la invasión de células, ensayo de invasión de cámara de Boyden se llevó a cabo para determinar la capacidad de las HeLa y células PC-3 para invadir a través de matrices biológicas
in vitro
. Como se muestra en la Fig. 2, E y F, (Fig S1, E y F, P & lt;. 0,01) el tratamiento con 3-azidoWA (0,50 y 0,75 mM) inhibió la invasión de células (P & lt; 0,05) .Para anular la posibilidad de alteración de la invasión de células debido a la muerte celular programada, elegimos cuidadosamente las concentraciones fisiológicamente relevantes de 3-azidoWA. Todos estos resultados indican colectivamente que las dosis sub-tóxica de 3-azidoWA alteran la cinética de crecimiento de las células HeLa y células PC-3. Esto podría ser un indicador positivo para el ensayo de su actividad antineoplásica en células de cáncer de cuello uterino y de próstata.
La inhibición de la metaloproteinasa de la matriz 2 gelatinasa actividad y la expresión por 3-azidoWA
invasión de células tumorales a través de la matriz y el tejido obstrucción necesita los efectos combinados del aumento de la motilidad celular y la degradación proteolítica controlada de la matriz. Los altos niveles de MMP en los tejidos tumorales se han correlacionado con degradación de la matriz de células de cáncer, invasión y metástasis [29]. Como 3-azidoWA inhibe la motilidad celular, se investigó si 3-azidoWA ejerce actividad anti-gelatinasa. Como se ve en la Fig. 3, A y B (Fig. S2, A), fila superior, el aumento de concentración de 3 azidoWA-actividad de la gelatinasa abrogada selectivamente y la expresión de 72 KDa banda MMP-2 como se confirma por zimografía de gelatina y análisis de transferencia Western. El efecto de la inhibición de MMP-2 por 3-azidoWA fue más pronunciada que la molécula padre witaferina A (Fig. 3, C) (Fig. S2, B) .Further que examinó si 3-azidoWA podría inhibir otra gelatinasa (MMP-9) y los resultados revelaron que 3-azidoWA bloquear específicamente la actividad de MMP-2 en células HeLa y PC-3, pero no MMP-9 (Fig. 3, a fila del medio) (Fig. S2, a fila del medio). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la 3-azidoWA abroga fuertemente y selectivamente MMP-2 expresión y la actividad de una manera dependiente de la dosis.
(A) las células HeLa se dejaron sin tratar o se trataron con 0,50 M y 0,75 M de ácido 3- azidoWA de 48 h, se analizó el medio acondicionado para MMP-2 & amp; la actividad gelatinasa -9. (B) Las células HeLa se dejaron sin tratar o tratadas con 0,25, 0,50, 0,75 y 1,0 mM 3-azidoWA durante 48 h, los medios de condicionado obtenido se empleó para el análisis de transferencia de Western seguido por tinción con azul Coomassie para revelar la banda de 68 KDa BSA para el control de carga . (C) células HeLa se trataron con diversas concentraciones de los padres witaferina A durante 48 h y la actividad de MMP-2 se determinó por zimografía de gelatina. (Húmedo; las células (E) HeLa se trataron con TRAIL durante 180 minutos y con Tumicamycin durante 60 minutos (como se indica). Los medios acondicionados se sometieron a análisis de zimografía de gelatina para la actividad de MMP-2 y Western blot para extracelular Par-4, seguido de tinción con azul de Coomassie para el control de carga.
3-azidoWA Induce extracelular Par-4 Secreción por vía clásica
a medida que las parejas de agentes que inducen la apoptosis facilitan la secreción extracelular de Par-4 [3], hemos tratado de examinar un grupo de plantas medicinales derivados puros productos naturales que podrían promover la apoptosis y /o aumentar la secreción de Par-4 (datos no presentados). Sorprendentemente, se encontró que tan bajo como 0,5 M (muy por debajo de la dosis citotóxica) de 3-azidoWA, pero no la molécula original witaferina A (datos no mostrados) indujo la extracelular secreción de Par-4 en forma dependiente de dosis (Fig. 3, medio B fila), verificado por Western blot. Por otra parte, se observó 3-azidoWA tratamiento aumentó la secreción extracelular de Par-4 en los medios condicionales que esencialmente imitaban los efectos de 300 ng TRAIL (TNF relacionados con la apoptosis ligando inducir) y 1,0 M de tratamiento tunicamicina (Fig. 3, D y E fila del medio). Para evaluar si esta secreción de Par-4 se produjo a través de la vía de BFA-sensibles clásica que implica la ruta ER /Golgi, terminamos el tráfico de proteínas desde el RE al Golgi con Brefeldina A (BFA) y encontramos secretada nivel Par-4 se desaceleró en el medio acondicionado después de 3 azidoWA y tratamiento TRAIL en presencia de Brefeldina a (Fig. 4, a y B fila superior). A continuación, sugerimos que el 3-azidoWA induce la secreción extracelular Par-4 por la vía clásica sensibles BFA.
de las células PC-3. (A) las células PC-3 se dejaron sin tratar o pretratadas con BFA (1,0 M) durante 120 min, después se trató con 3-azidoWA como se indica para 48 h. Como se muestra en la Fig. (SEGUNDO). (SEGUNDO).