Mujer
Extracto
Antecedentes
El sistema de amplificación refractario a las mutaciones de tetra-imprimación PCR (T-ARMS-PCR) es un medio rápido y económico para el ensayo de SNP de, requiriendo sólo la amplificación por PCR y la posterior electroforesis para la determinación de genotipos. Para mejorar el rendimiento y la eficiencia de T-ARMS-PCR, se combinaron T-ARMS-PCR con una estrategia quimérico interruptor de temperatura basada en los iniciadores de PCR (TSP), y utilizamos la electroforesis capilar (CE) para la separación e identificación de amplificación. Se evaluó este proceso en el genotipado simultáneo de dos SNPs relacionados con el riesgo de cáncer de cuello uterino cáncer de mama y cuatro.
Métodos
Un total de 24 cebadores T-ARMS-PCR, cada 5 ' etiquetadas con una secuencia universal y un par de cebadores universales, se agruparon para amplificar los 12 alelos objetivo de 6 SNPs en 186 muestras de sangre de control femenino. También se realizó la secuenciación directa de todas las muestras para evaluar la exactitud de este método.
Resultados
De las 186 muestras, tantos como 11 amplicones se pueden producir en un solo PCR y separados por CE . genotipo resultados del múltiplex T-ARMS-PCR estaban en completo acuerdo con la secuenciación directa de todas las muestras.
Conclusiones
Este método multiplex nuevos T-ARMS-PCR es el primer método reportado que permite a uno determinar el genotipo de seis SNPs en una sola reacción con ningún tratamiento post-PCR distinta de la electroforesis. Este método es fiable, rápido y fácil de realizar
Visto:. Zhang C, Liu Y, Anillo BZ, Nie K, M Yang, Wang M, et al. (2013) A Novel Multiplex Tetra-PRIMER ARMS-PCR para la genotipificación simultánea de seis polimorfismos de nucleótido único asociado con cánceres femeninos. PLoS ONE 8 (4): e62126. doi: 10.1371 /journal.pone.0062126
Editor: Gayle E. Woloschak, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2012; Aceptado: March 19, 2013; Publicado: 17 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Mega-Proyecto de china de Enfermedades Infecciosas (2011ZX10004-001, 2012ZX10004-215 y 2013ZX10004-202). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el papel de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP de) en la contribución a la variabilidad entre individuos en la susceptibilidad a cáncer [1] tasa, el crecimiento tumoral y la metástasis [2] - [4], así como en la eficacia del tratamiento y respuestas adversas a los medicamentos, ha sido bien reconocido [5], [6]. Entre los muchos métodos que se han desarrollado para determinar el genotipo de SNPs, la amplificación del sistema de mutación refractario tetra-cebador de PCR (T-ARMS-PCR) ha demostrado ser rápido, simple y económico [7] - [11]. A través de la combinación de dos cebadores externos y los dos cebadores internos específicos de alelo, genotipificación requiere sólo una única PCR seguido de la separación de electroforesis [8]. Multiplex PCR se incorporó en T-ARMS-PCR, usando ocho cebadores en una PCR, y es capaz de detectar simultáneamente dos mutaciones [9]. Por separado, a base de quimérico-primer multiplex PCR, lo que añade una etiqueta universal de 5 'a la secuencia de cebadores específicos para varios objetivos, se ha informado para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la reacción en cadena de la polimerasa [12]. Con su alta eficiencia en la detección de decenas de diferentes productos de la PCR en una reacción, el uso de cebadores de PCR quimérico con frecuencia se ha informado de su uso en mRNA cuantificación [13] - [15]. Y detección de patógenos [16], [17]
el cáncer de mama y cáncer de cuello uterino se han convertido en los cánceres más frecuentemente diagnosticados y las principales causas de muerte por cáncer entre las mujeres [18]. Estudios recientes muestran que las variantes somáticas en las regiones de susceptibilidad están asociadas con la probabilidad de aparición de cáncer de mama y ginecológicos [19] - [23]. SNPs fueron escogidos para este estudio sobre la base de asociaciones reportadas con estos tipos de cáncer y que tiene una razonablemente alta prevalencia en las poblaciones asiáticas. Se seleccionaron cuatro variantes de baja penetrancia para la predicción del riesgo de cáncer de mama. rs4784227 SNP [24] y rs3803662 [25] se encuentran en el TOX3 factor de transcripción; rs1219648 se encuentra dentro de FGFR2, que contribuye al crecimiento celular, la invasión, la motilidad y la angiogénesis [26]; rs889312 [27] está dentro de MAP3K1, que está vinculada a la respuesta celular a los mitógenos. Se seleccionaron dos variantes asociadas con el riesgo de cáncer cervical o de ovario. rs750749 SNP [21] es un polimorfismos en CD83, que está implicado en el reconocimiento inmune y la presentación de antígenos; rs749292 en CYP19A1, que desempeña un papel clave en la biosíntesis de estrógenos [22], [23].
En el presente trabajo, se describe un nuevo múltiplex T-ARMS-PCR que permite el genotipado simultáneo de 6 SNPs (rs4784227 , rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 y rs749292) asociado con cánceres de mama y ginecológicos en un solo tubo utilizando 24 cebadores quiméricos y un par de cebadores universales el uso de cebadores quiméricos y una estrategia interruptor de temperatura PCR (TSP) se combinaron con T- ARMS-PCR para optimizar los parámetros de amplificación y mejorar el rendimiento de SNP genotipado. La combinación de estas diferentes técnicas de genotipificación demuestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR para detectar de forma fiable y eficiente seis SNPs en una sola reacción. Desde hace más de 10 productos de PCR con diferentes longitudes deben ser identificados, electroforesis capilar (CE) se utiliza en lugar de la electroforesis en gel de agarosa.
Materiales y Métodos
Un total de 186 muestras de sangre de sana mujeres voluntarios chinos que estaban bajo el control de la hipertensión potencial se recogieron en los centros de salud comunitarios en Wuhan, china en 2011 para este estudio. Se llevaron a cabo todos los aspectos del estudio de acuerdo con las regulaciones nacionales de ética y aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de China 70 de, así como el Comité de Ética de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. Los participantes recibieron "consentimiento informado por escrito" del propósito del estudio y de su derecho a mantener la información confidencial. Se obtuvo consentimiento escrito de todos los participantes o sus tutores.
ADN genómico fue extraído de 0,2 ml muestras de sangre periférica frescos mediante el uso del Asistente
® kit de purificación de ADN genómico (Promega) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADN extraídas tenían una concentración final que oscila entre 55-365 ng /mL.
Para superar las limitaciones de los métodos estándar multiplex armas T-PCR, el método propuesto se ha optimizado en términos de diseño de la cartilla, las condiciones de los ciclos de PCR y en la utilización de cebadores quiméricos y estrategia de TSP, tal como se describe en nuestros informes anteriores en la detección de virus de la gripe y el pie y la mano del hombre en la boca asociada patógenos [16], [28]. Se utilizaron un total de 24 cebadores quiméricos cada uno consiste en una secuencia específica de gen con una secuencia de etiqueta universal en el extremo 5 '. Las porciones de genes específicos de los primers fueron diseñados de acuerdo a los requerimientos de T-ARMS-PCR. La especificidad de los cebadores específicos de alelo es conferida por la identidad del nucleótido terminal 3 'con cualquiera de los de tipo salvaje o el alelo mutante, la especificidad se incrementa por la introducción de una falta de coincidencia deliberada en la posición -1 del extremo 3'. Un par de cebadores universales y seis juegos de T-ARMS-PCR cebadores quiméricos fueron utilizados para la amplificación. secuencias de cebadores detalladas y las concentraciones de trabajo para cada SNP se enumeran en la Tabla 1.
El genotipado de los polimorfismos ensayados se realizó mediante la amplificación multiplex PCR y análisis de fragmentos. Seis juegos de T-ARMS-PCR primers para la amplificación de doce fragmentos de diferentes tamaños se agruparon en un solo 20 l de volumen de reacción, que también contenían 10 l de mezcla maestra kit Qiagen Multiplex PCR, 50-100 ng de ADN genómico, y las concentraciones de cada cebador optimizado (véase la Tabla 1). Multiplex PCR se realizó utilizando Bioer LifePro termociclador. Una PCR (TSP) protocolo interruptor de temperatura optimizada, que utiliza cuatro temperatura de hibridación diferente se realizó como sigue: etapa de desnaturalización inicial de 95 ° C durante 10 min, 3 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 45 s, 10 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 45 s, 20 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 45 s, 15 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 45 s, seguido de un ciclo de extensión final a 72 ° C durante 10 min, y después se enfrió a 4 ° C.
Los productos de PCR múltiple se separaron por QIAxcel
® cartucho de ADN de alta resolución en gel (Qiagen) en el sistema QIAxcel (Qiagen). ADN Tamaño de marcador de 25 a 450 pb (Qiagen) y alineación de marcador 15 pb /500 pb (Qiagen) se utilizaron en cada QIAxcel se ejecuta y se determinó el tamaño de los productos mediante el software ScreenGel (Qiagen). Debido a que cada uno de los amplicones era de una longitud diferente, se detectaron los alelos sobre la base de los patrones de tamaños de pico.
Un total de 186 muestras también fueron secuenciados en paralelo con un ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems , EE.UU.) de acuerdo con la versión 3.1 de terminación BigDye protocolo de Invitrogen Corporation (Shanghai, china) para confirmar los resultados múltiplex T-ARMS-PCR utilizando los cebadores externos que figuran en la tabla 1 para cada SNP.
un total de 186 muestras se tipificaron con un ensayo T-ARMS-PCR multiplex y también escribe en paralelo con la secuenciación directa para evaluar la exactitud y la eficiencia del ensayo. Todos los productos de PCR fueron bien resueltos y dimensionadas por CE y ScreenGel, permitiendo la fácil identificación de los diferentes genotipos. Dos de las 186 muestras tenían once amplicones únicos, es decir, aquellos pacientes que tienen un solo SNP homogénea entre los seis loci analizados. imagen gel de estas dos muestras (Fig. 1) electroferograma y muestran que CE en QIAXEL puede separar claramente un máximo de 11 fragmentos en una muestra. La precisión de múltiples análisis de PCR de una muestra se confirmó por secuenciación directa (Fig. 2). tamaños de los fragmentos determinados por la CE basada QIAXEL se enumeran en la Tabla 2. Leer las longitudes eran de 2 a 10 pb más grande que los esperados, pero esto no interfirió con la determinación de los alelos. Heterocigotos y homocigotos fueron asignados de forma inequívoca a partir de los perfiles de CE. No se observó reacción cruzada. Los genotipos obtenidos a partir del ensayo multiplex estaban en el 100% de acuerdo con la secuenciación directa
A:. Gel imagen de las 4 muestras. B. imagen Gel y electroferograma de la muestra en el carril 1. Se observaron 11 bandas que van desde 202 a la 356 pb, lo que indica 5 heterogéneos y homogéneos 1 SNPs se identificaron C: imagen Gel y electroferograma de la muestra en lane2. Se observó otra combinación de 5 heterogéneos y homogéneos 1 SNPs.
Las frecuencias alélicas y genotípicas de distribución de cada SNP se enumeran en la tabla 3. El alelo informado que se asocia con un riesgo de la incidencia de cáncer se pone de relieve. La frecuencia observada de los genotipos en este estudio fue en general similar a la medida por HapMap para una población china Han (HCB). Si se utilizaron las frecuencias HapMap para predecir genotipo cuenta que se esperan de este estudio, a continuación, una comparación de esta población a la población HapMap HCB mostró divergencia significativa para rs4784227 en TOX3 y rs749292 en CYP19A1, en el que el riesgo y los alelos no de riesgo, respectivamente, están presentes en una proporción significativamente mayor que lo reportado previamente para una población china. Es probable que haya diversidad dentro de la población de Han que aún no es capturado por los estudios de HapMap. Se proporciona una tabla adicional (Tabla S1) para mostrar los conjuntos exactos de los alelos de los 6 SNPs que se encuentran en cada muestra individual para mayor referencia.
Discusión
Los métodos que permiten bajo costo , la determinación rápida y fiable SNP están atrayendo a un creciente interés en la era de la medicina personalizada. Es ampliamente reconocido que el uso de la información de múltiples genotipos SNP proporciona una evaluación del riesgo más precisa que la predicha por un alelo único riesgo [29], por lo tanto, métodos capaces de identificar genotipos múltiples, tales como MALDI-TOF espectrometría de masas [30], [31 ] y basado en la hibridación [32] - [34] o la base de enzimas [35] se han utilizado métodos. Sin embargo, estos métodos requieren equipo especial ya sea costosa, como espectrómetro de masas, o mucho tiempo después de la operación-PCR.
Tetra-imprimación ARMS-PCR método se ha convertido en uno de los métodos más comúnmente utilizados para el genotipado de SNP. Sólo se requiere equipo de biología molecular regular y elimina la necesidad de hibridación o reacciones enzimáticas adicionales. Aunque se han reportado métodos tríplex y cuádruplex de PCR, se hace un uso limitado de múltiplex T-ARMS-PCR en la determinación del genotipo debido a dos limitaciones clave. En primer lugar, la probabilidad de encontrar cebadores con temperaturas de fusión emparejados cae drásticamente cuando se trata de combinar la detección de varios SNPs en una sola reacción. En segundo lugar, la piscina que resulta de los amplificados requiere suficientes intervalos de longitud entre bandas vecinas en la electroforesis para facilitar la separación. Mediante la combinación de T-ARMS-PCR con una estrategia quimérica basada en los iniciadores de temperatura de activación PCR eludimos en gran medida estas limitaciones. Nuestro método demuestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR para detectar fácilmente seis SNPs en una sola reacción.
La fiabilidad del método se ilustra escribiendo 186 muestras de sangre clínicas en paralelo con la secuenciación directa , y se obtuvo una consistencia de 100% entre los dos métodos. Por tanto, este estudio de prueba de concepto establece un método efectivo rápido, reproducible, y el coste para la detección de SNPs multiplex, ya que CE por QIAXCEL es capaz de resolver los amplicones con tan poco como 5 diferencia de tamaño pb, la diferencia de tamaño más pequeño en esta prueba fue de 10 pb. Como las longitudes de lectura en este ensayo tiene una desviación estándar de 0,8 a 1,3 (Tabla 2), la determinación de alelo se lo tanto no interferido.
El uso de cebadores quiméricos y interruptor de temperatura bifásica en el proceso de recocido disminuye la diferencia en la eficiencia de amplificación entre amplicones. Durante los primeros pocos ciclos de PCR, la amplificación se lleva a cabo por los cebadores quiméricos específicos de alelo. En etapas posteriores de PCR, la amplificación se realiza predominantemente a por cebadores universales, de modo que todos los objetivos de este sistema de PCR multiplex se amplifican de una manera imparcial por un solo par de cebadores universales. Esto reduce la aparición de amplificación sesgada y parcial, minimiza las reacciones no específicas, y reduce la necesidad de optimización de cada ensayo de PCR individual.
Para evaluar los errores resultantes de la utilización de electroforegramas multibanda para distinguir amplicones , la longitud de lectura de cada banda se comparó con las longitudes teóricos calculados a partir de imprimación-alineación (Tabla 2). No se observó superposición en el rango de longitud de lectura entre dos cualesquiera de los amplicones, además, no hay superposición de los intervalos de confianza del 99% de la longitud de lectura promedio observado. Es notable que la intensidad de la banda pueden ser objeto de varios factores, incluyendo la calidad del ADN genómico y PCR calidad de los reactivos; se ha encontrado que 50 a 100 ng /l de ADN es óptima para proporcionar bandas suficientemente clara y brillante con el fondo mínima (datos no mostrados). Además, a diferencia de la mayoría de otros métodos informó T-ARMS-PCR, una falta de coincidencia en la posición -1 deliberado del extremo 3 'se incorporó en los dos cebadores internos y era suficientemente específico para la detección diferencial de dos alelos para cada SNP. Debido a la limitación de tamaño de la discriminación entre los productos de PCR, diseño de cebadores de PCR puede ser restringido en cierta medida, hacer múltiples T-ARMS-PCR difícil de escribir los SNPs que se encuentran más cerca que 20 pb de la otra.
dos claras ventajas del método ARMS-PCR múltiple son el corto tiempo de ensayo y los bajos costos, incluso para ensayar un gran número de muestras. El método propuesto, solo que incluya la PCR convencional con un CE, puede llevarse a cabo antes de 3,5 horas con un mínimo esfuerzo práctico. Después de la extracción de ADN genómico, los pasos posteriores se pueden completar en un solo tubo de reacción, lo que permite el análisis de múltiples muestras listo en una única prueba para cribado de alto rendimiento. Este ensayo consume solamente reactivos de PCR estándar y cartuchos de electroforesis; los costos en este estudio fueron sólo 2 US $ para la detección simultánea de seis SNPs por muestra.
A nuestro entender, el método propuesto es el primero en detectar seis SNPs en una sola reacción utilizando tetra-primer Arms- PCR. El nuevo método multiplex tetra-primer ARMS-PCR desarrollada en este estudio tiene un potencial significativo para ser ampliamente aplicable tanto en entornos comerciales y clínicos para la detección de múltiples SNPs.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Los alelos de los SNP 6 de cada muestra individual en este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062126.s001 gratis (DOCX)