Extracto
El desarrollo de la resistencia a la quimioterapia es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer. Elucidar los mecanismos de resistencia a los medicamentos debe por lo tanto dar lugar a nuevas estrategias terapéuticas. factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) -2 señalización induce el ensamblaje de un complejo multi-proteína que proporciona las células tumorales con la maquinaria molecular necesaria para la resistencia a los medicamentos. Este complejo, que implica la proteína quinasa C (PKC) ε, v-raf sarcoma murino viral oncogén homólogo B1 (B-RAF) y p70 S6 quinasa β (S6K2), mejora la traducción selectiva de proteínas anti-apoptóticas, tales como las células B leucemia /linfoma de 2 (BCL-2) e inhibidores de proteína de apoptosis (IAP) y miembros de la familia son capaces de proteger a múltiples tipos de células de cáncer de la muerte celular inducida por quimioterapia. Las quinasas Janus (JAKs) son los más conocidos por sus papeles críticos en la mediación de la señalización de citoquinas y la respuesta inmune. En este sentido, muestran que JAK tienen nuevas funciones que apoyan su consideración como nuevos objetivos de terapias dirigidas a reducir la resistencia a fármacos. Como ejemplo, se muestra que la Janus quinasa TYK2 se fosforila aguas abajo de FGF-2 de señalización y necesaria para la fosforilación completa de quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2. Por otra parte, TYK2 es necesaria para la inducción de las proteínas anti-apoptóticas claves, tales como BCL-2 y la secuencia de la leucemia de células mieloides (MCL) 1, y para la promoción de la supervivencia celular a FGF-2. Silenciamiento de JAK1, JAK2 o TYK2 utilizando la interferencia de ARN (RNAi) inhibe la proliferación y resultados FGF2 mediada en la sensibilización de las células tumorales a la muerte inducida por la quimioterapia. Estos efectos son independientes de la activación de transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) 1, STAT3 y STAT5A /B, los objetivos normales de señalización JAK. En lugar de ello, los asociados Tyk2 con las otras quinasas implicadas previamente en la resistencia a fármacos FGF-2 mediada. A la luz de estos hallazgos que postula que TYK2 y otros JAK son moduladores importantes de la supervivencia celular impulsada por el FGF-2 y que los inhibidores de estas quinasas es probable que mejorar la eficacia de otras terapias contra el cáncer
Visto:. Carmo CR, Lyons-Lewis J, Seckl MJ, Costa Pereira-AP (2011) Un requisito para la novela Janus quinasas como mediadores de la Resistencia a las Drogas inducidas por el factor de crecimiento fibroblástico-2 en células de cáncer humano. PLoS ONE 6 (5): e19861. doi: 10.1371 /journal.pone.0019861
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Febrero 2011; Aceptado: 5 Abril 2011; Publicado: 20 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Carmen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Tratamiento del Cáncer y la confianza de la investigación financiada este trabajo. MJS y JLL también son apoyados por un Departamento de Salud financió Experimental del Cáncer Centro de Medicina Grant y APC-P y MJS por el Cancer Research UK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el desarrollo de resistencia a los fármacos por las células tumorales es responsable de la mala supervivencia global observada con la mayoría de tipos de cáncer [1]. Entre la gran cantidad de mecanismos de resistencia a fármacos se encuentra el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) -2 señalización. FGF-2 puede proporcionar células con señales pro-supervivencia y mitógenos, y conferir resistencia de amplio espectro a los fármacos quimioterapéuticos [2], [3], [4]. regulado De señalización FGF-2 se ha asociado con una variedad de tumores malignos y niveles elevados de esta molécula en el suero del paciente se establecieron como un factor de mal pronóstico independiente para el linfoma, cáncer de pulmón y los pacientes con sarcoma [5], [6], [7 ]. En particular, se demostró que FGF-2 para promover la resistencia a fármacos de las células de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) a través de la formación de un complejo multi-proteína que comprende la proteína quinasa C (PKC) ε, v-raf sarcoma murino viral homólogo de oncogén de B1 (B RAF) y p70 S6 quinasa β (S6K2). Esto depende de la actividad de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) 1/2 [3], [8], [9]. La formación de este complejo llevó a traslacional sobre regulación de las proteínas anti-apoptóticas clave, que a su vez confieren resistencia a la apoptosis y las células para sobrevivir permitidos cuando fueron estimulados con fármacos citotóxicos.
La mayoría de las citocinas y muchos factores de crecimiento de la señal
vía
quinasas Janus (JAKs) y transductores de señal y activadores de transcripción (Stats) [10], [11]. fosforilación STAT constitutivo es característica de una amplia variedad de líneas celulares de cáncer humano y los tumores primarios [12]. Sobreactivación de JAKs también se ha implicado en la tumorigénesis [13]. El hecho de que JAK y STAT se activan por varios mitógenos ha animado a los investigadores a desarrollar estrategias para dirigirse a ellos en tratamientos contra el cáncer. No es limitada, un tanto confuso, la evidencia de JAK /STAT de señalización corriente abajo de FGF-2 y su relevancia no está clara [14], [15], [16]. Nosotros y otros [17] hemos observado expresión /STAT de-regulada JAK en una variedad de líneas de carcinoma de pulmón de células y sarcoma. Esto y el hecho de que los pacientes con niveles elevados de FGF-2 en el suero tienen peores resultados en la clínica nos ha llevado a la hipótesis de que JAK y /o STAT jugaron un papel en la FGF-2 vía de resistencia a los medicamentos de señalización mediada (s). Aquí, mostramos que el Janus quinasas JAK1, JAK2 y TYK2, pero no se requiere su principal efectores STAT1, STAT3 o STAT5A /B, por chemoprotection mediada por FGF-2 en células de osteosarcoma U2OS. Esto, a su vez, abre nuevas vías terapéuticas para el cáncer que siguen siendo difíciles de controlar.
Resultados
FGF-2 protege a las células de osteosarcoma U2OS de la muerte celular mediada por cisplatino a través de un mecanismo que implica PKCε , complejos de proteína B-RAF y S6K2
desde que se demostró FGF-2 para proteger las células de SCLC de la muerte celular inducida por fármacos citotóxicos [4], que inicialmente se buscó extender esta observación a las U2OS osteosarcoma tipo de células cancerosas distintas Células. Estos fueron tratados con el cisplatino clínicamente relevante fármaco en presencia y ausencia de FGF-2 (Fig. 1). La concentración de factor de crecimiento utilizado fue determinada usando ERK1 /2 fosforilación como una lectura (Fig. S1). La muerte celular se evaluó mediante el ensayo de viabilidad celular WST-1, lo que produjo resultados idénticos a los obtenidos por el recuento de células con azul de tripano (datos no mostrados). tratamiento durante la noche con cisplatino 60 mM mató a 50% de las células, pero antes de la incubación con FGF-2 durante 4 h prevenir esto, lo que sugiere que FGF-2 células U2OS protegidas contra cisplatino (Fig. 1A). El ensayo de WST-1 no discrimina entre la apoptosis y la necrosis. Por otra parte, el rescate de cisplatino podría atribuirse a la proliferación, que también fue inducida por FGF-2, en lugar de puramente a la inhibición de la muerte celular. Por lo tanto, a supervisar en paralelo la inducción de la apoptosis mediante la escisión de sustratos de caspasa, tales como poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y lamin B como de espera de lectura (Fig. 1B y datos no presentados). Además, se utilizó el análisis del ciclo celular por citometría de flujo para cuantificar la pérdida de contenido de ADN, que puede ser usado como otra lectura de la apoptosis (Fig. 1C). tratamiento durante la noche con la apoptosis inducida por cisplatino en células U2OS, que se manifiesta por la aparición de un 85 kDa PARP fragmento de escisión (Fig. 1B) y un aumento de la población de células sub-G1 (Fig. 1C). Estos eventos fueron impedidos por las células pre-tratamiento con FGF-2, que también reduce la muerte celular basal detectado en las muestras sin tratar. Los gráficos representan los valores medios obtenidos en tres experimentos independientes. Como se observó para las células de SCLC [8], la reducción de la muerte celular por FGF-2 podría prevenirse por la inhibición de la MAP quinasa quinasa (MEK) la actividad /ERK con un inhibidor selectivo (Fig. S2), mientras que la inhibición de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y el objetivo de complejo (dE TORC) 1 señalización rapamicina no tuvieron impacto (datos no mostrados). Por lo tanto FGF-2 ejerce un efecto anti-apoptótico en células U2OS que fue mediada por ERK1 /2 y prevenirse los efectos citotóxicos del cisplatino. Es importante destacar que, en la retirada del fármaco, las células rescatados-FGF-2 permanecieron viables en cultivo durante varias semanas (datos no mostrados). Esto además apoya la idea de que el FGF-2 se puede promover eficazmente la supervivencia de las células cancerosas expuestas a fármacos citotóxicos.
Las células se incubaron en medio libre de suero durante la noche. Después de 4 h pre-tratamiento con FGF-2 (10 ng /ml), las células se trataron con cisplatino (60 mM) durante la noche. A. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de WST-1. Los valores corresponden a la sal de tetrazolio WST-1 escinde en compuestos formazano coloreado por deshidrogenasas mitocondriales. Media ± SEM de tres experimentos independientes realizados por triplicado se presentan como veces de inducción con respecto a los controles no tratados. B. Las proteínas se separaron en un gel de SDS-PAGE 7,5% y el análisis de transferencia Western realizado en lisados de células totales (células vivas y muertas) utilizando anticuerpos contra PARP. β-actina se utilizó como control de carga. Un western blot representativo y media ± SEM de los valores densitométricos (escindido PARP) de tres experimentos independientes se muestran. C. Las células se permeabilizaron y el ADN se tiñeron con yoduro de propidio (PI). perfiles del ciclo celular se evaluó mediante citometría de flujo y los datos extraídos utilizando FlowJo. La media ± SEM de eventos sub-G1 de tres experimentos independientes se expresa como factor de cambio de las poblaciones sub-G1 sobre el control sin tratar.
En las células de SCLC, las vías de resistencia a fármacos FGF-2 mediada implica la formación de un complejo de proteína que participa en PKCε, B-RAF y S6K2 [4]. A continuación pregunta si el FGF-2 podría inducir interacciones de proteínas similares en células U2OS. Las células incubadas en presencia o ausencia de FGF-2 durante los tiempos indicados se lisaron y se inmunoprecipitaron S6K2 antes de la transferencia de western para PKCε, B-RAF o S6K2 (Fig. 2A). B-RAF y PKCε asociados con S6K2 en células en reposo, un efecto que se incrementó significativamente por tratamiento de FGF-2 para 10 min (Fig. 2A). Las interacciones fueron transitorios y ya no significativa en un 30 min de tratamiento post-FGF-2. Para corroborar la idea de que las tres proteínas interactúan, el próximo inmunoprecipitaron ya sea PKCε (Fig. 2B) o B-RAF (Fig. 2C) a partir de lisados celulares. A continuación realizó el Western Blot para sondear estas proteínas y S6K2. Mientras que B-RAF y la interacción basal PKCε aumentaron 10 minutos después de la estimulación de FGF-2 y, posteriormente, persistieron, no fuimos capaces de detectar S6K2 en estos inmunoprecipitados (Fig. 2B, 2C y datos no mostrados). Esto puede ser explicado por los menores niveles de expresión de S6K2 en comparación con PKCε y B-RAF en las células U2OS, variación en la estequiometría de las asociaciones o la formación de múltiples, complejos de proteínas, distintas. En general, los datos sugieren que el FGF-2 promueve las interacciones moleculares entre PKCε, B-RAF y S6K2. En paralelo con todas las inmunoprecipitaciones, los niveles de las tres proteínas también se analizaron en los extractos de células enteras (Fig. S3). Curiosamente, una pequeña (1.5 a 1.7 veces) pero altamente reproducible y estadísticamente significativo aumento de S6K2 se detectó 10 min después de la adición de FGF-2, mientras que los niveles de PKCε, B-RAF, ERK1 /2 y β-actina (este último dos utilizados como controles de carga) no se vieron afectados (Fig. S3 y S5 también). Si el aumento de la señal S6K2 es puramente debido a un aumento en la fosforilación o la estabilización de la proteína que queda por determinar. La fosforilación de ERK1 /2 también se monitorizó para garantizar la funcionalidad de FGF-2 (Fig. S3). A fin de verificar que las células U2OS se comportaban como SCLC en respuesta a FGF-2 de señalización también se determinó si el aumento de las proteínas anti-apoptóticas se pudo detectar [8] favor de la supervivencia. Como se predijo, FGF-2 aumentó la leucemia de células B /inhibidor de linfoma-2 ligada al cromosoma X (BCL-x
L) y (BCL-2), BCL-2-como 1 proteína de la proteína de apoptosis (XIAP) los niveles de expresión pero, además, también se observó la inducción de otra proteína anti-apoptótica importante, a saber la secuencia de la leucemia de células mieloides (MCL) 1, en células U2OS (Fig. 2D y datos no presentados).
Las células fueron suero hambre como antes y después de la estimulación con FGF-2 (10 ng /ml), proteínas extraídas utilizando el tampón de lisis co-inmunoprecipitación. Los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con (A.) S6K2, (B.) PKCε o anticuerpos y proteínas detectadas por transferencia Western (C) de B-Raf como se indica. El análisis de transferencia Western D. se realizó usando lisados de células totales y los anticuerpos contra MCL1 y BCL-2. β-actina se utilizó como control de carga. transferencias Western representativas y la media ± SEM de tres experimentos independientes se muestran en los gráficos. '-. Min
regulación a la baja de JAK1, JAK2 o TYK2, pero no STAT1, STAT3 o STAT5, inhibe la resistencia a los medicamentos FGF-2 mediada por células U2OS en
Muchas líneas celulares de cáncer utilizados en la investigación han desregulado señalización JAK /STAT. Esto refleja el
in vivo
situación que el mismo se observa en muestras de tumores humanos. A pesar de su papel tradicional en las respuestas inmunes JAK y STAT están siendo cada vez más reconocido como moléculas importantes en la biología del cáncer. Nuestros datos anteriores demostraron que FGF-2 interacciones inducidas entre B-RAF, PKCε y S6K2, el aumento de la expresión de moléculas anti-apoptóticas claves y las células U2OS protegidas de la apoptosis inducida por cisplatino. A continuación pregunta si los miembros de la familia JAK de expresión ubicua y /o sus estadísticas de sustrato fueron parte de esta vía de señalización. Para abordar esta cuestión, la interferencia de ARN (RNAi) se indujo usando oligonucleótidos de interferencia corto (SI) contra JAK1, JAK2, TYK2, STAT1, STAT3 y STAT5A /B. A lo largo de este estudio hemos utilizado siRNA piscinas que comprenden cada una cuatro oligonucleótidos siRNA dirigidos contra diferentes regiones de las mismas moléculas diana. Todas las piscinas siRNA fueron validados por deconvolución y transferencia Western usando anticuerpos producidos contra la diana conocida, así como moléculas estrechamente relacionadas, como se ha descrito previamente en nuestro laboratorio [18]. Silenciamiento de la eficiencia y la especificidad de siRNAs agrupados se muestran en la Figura S4. células U2OS transfectadas con siRNA se trataron con o sin FGF-2 durante 4 h y posteriormente expuestos a cisplatino (Fig. 3 y 4). Aproximadamente el 50% de las células U2OS que había silenciado JAK1 (Sijak), JAK2 (siJAK2) o TYK2 (siTYK2) tratados con cisplatino se sometió a la apoptosis y esto no se podría evitar por pre-tratamiento de estas células con FGF-2 (Fig. 3). La apoptosis se evaluó usando el ensayo de WST-1 (datos no mostrados), o el uso de escisión de PARP (Fig. 3A) y la fragmentación del ADN (Fig. 3B) como lecturas. En marcado contraste, la población de escisión de PARP y sub-G1 de células aumentado inducida por cisplatino fue impedido por FGF-2 en células de control transfectadas con un siRNA no específica (NS) y en las células no transfectadas. Por lo tanto, cada uno de los JAKs analizados se requería para una eficiente quimioprotección mediada por FGF-2 de la apoptosis inducida por cisplatino.
Las células fueron transfectadas con 75 nM de ARNsi contra JAK1, JAK2 o TYK2. las células no transfectadas y células transfectadas con siRNA no específica (NS) se utilizaron como controles. Después de 48 h, las células fueron re-chapada (2 × 10
5 células /pocillo) y se incubaron en medio libre de suero durante la noche. Después de 4 h pre-tratamiento con FGF-2 (10 ng /ml), las células se trataron con cisplatino (60 mM) durante la noche. A. Media ± SEM de valores densitométricos (escindido PARP) de tres experimentos se muestran. B. perfiles del ciclo celular de tres experimentos independientes se representan gráficamente como media ± SEM de las poblaciones sub-G1. Los paneles superiores ejemplifican los datos y se corresponden con las células control.
Las células fueron transfectadas con 75 nM de siRNA contra STAT1, STAT3 o STAT5A /B. las células y las células no transfectadas transfectadas con siRNA no específica (NS) se utilizaron como controles (c.f. la Fig. 3). Las células se trataron como en la Figura 3. A. media ± SEM de valores densitométricos (escindidos PARP) de tres experimentos se muestran. B. perfiles del ciclo celular de tres experimentos independientes se representan gráficamente como media ± SEM de las poblaciones sub-G1.
A continuación examinó si JAK podrían actuar a través de su canónica objetivos de abajo STAT1, STAT3 o STAT5. Sin embargo, silenciando cada una de estas moléculas tenía individualmente ningún efecto sobre la resistencia a los fármacos inducida por FGF-2. De hecho, la escisión de PARP (Fig. 4A) y sub-G1 eventos (Fig. 4B) provocadas por cisplatino permanecieron significativamente reducidos en las células pretratadas con FGF-2 con independencia de los niveles de STAT1, STAT3 o STAT5A /B.
FGF-2 induce TYK2 pero no STAT fosforilación
STAT1, STAT3 y STAT5A /B son sustratos naturales de las JAKs, pero nuestros datos anteriores indican que no pueden ser necesarios para pro-supervivencia inducida por FGF-2 señalización. Si esto fuera cierto, entonces uno esperaría que el FGF-2 sea incapaz de activar STAT, un proceso que implica la fosforilación de la tirosina en los residuos específicos para los cuales los anticuerpos phosphospecific están disponibles [19]. En consecuencia, hemos investigado si la próxima STAT se modificaron aguas abajo de FGF-2 mediante el análisis de la fosforilación de la tirosina de STAT1 (Tyr
701), STAT3 (Tyr
705) y STAT5A /B (Tyr
694) por el Western Blot . De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores (Fig. 4), FGF-2 no logró inducir la activación de STAT1, STAT3 o STAT5 en células U2OS (Fig. 5A). Sin embargo, como era de esperar, estas proteínas podrían ser fosforilados por interferón (IFN) -. Γ, interleucina (IL) -6, o la oncostatina M (OSM), que se utilizaron como controles positivos (Fig. 5A)
A. FGF-2 no indujo STAT1, STAT3, STAT5 o fosforilación. U2OS células fueron suero de hambre durante la noche y luego se estimularon con FGF-2 durante los tiempos indicados. Las células tratadas con IFN-γ (500 IU /ml), IL-6 (200 ng /ml) /sIL-6R (250 ng /ml) y OSM (50 ng /ml) se utilizaron como controles positivos para la activación de STAT1, STAT3 y STAT5, respectivamente. Las proteínas se analizaron como antes usando anticuerpos contra fosforilados STAT1 (Tyr
701), STAT3 fosforilado (Tyr
705), STAT5 fosforilada (Tyr
694) y los anticuerpos que reconocen ambas proteínas fosforiladas y no fosforiladas. B. FGF-2 indujo la fosforilación de TYK2 en células U2OS. Las células se incubaron en medio libre de suero y luego tratados con FGF-2 (10 ng /ml) durante los tiempos indicados. TYK2 se inmunoprecipitó y análisis de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos contra tirosinas fosforiladas y TYK2 total. TYK2 se utilizó como control de carga. C. lisados de células totales utilizados para inmunoprecipitar TYK2 y de células transfectadas con siTYK2 se separaron en un gel SDS-PAGE al 7,5% y se analizaron por Western blot. Las membranas se probaron para TYK2, pERK1 /2-Thr
202/185 /Tyr
204/187 y el total de ERK1 /2. β-actina se utilizó como control de carga. '-. Min
Una posible explicación de estos resultados incluye la posibilidad de que el FGF-2 simplemente no activa el JAK, un proceso que también implica la fosforilación de la tirosina. Para determinar si JAK pueden ser activados por FGF-2, decidimos centrar nuestra atención en TYK2, una de las JAK menos estudiadas que se expresa ampliamente en muchos tipos de células. células U2OS se trataron con se inmunoprecipitó FGF-2 para diferentes períodos de tiempo y TYK2. la fosforilación de la tirosina TYK2 se determinó usando anticuerpos contra tirosinas fosforiladas (4G10 y PY20, 1:01 de la mezcla) y la expresión de proteínas TYK2 con un anticuerpo anti-TYK2. FGF-2 indujo un aumento de 2 veces transitorio de la fosforilación de la tirosina TYK2, que alcanzó un máximo de 5 min y volvió cerca de los niveles basales por 30 min (Fig. 5B). No fosfo-TYK2 o TYK2 se observó en muestras de control (inmunoprecipitaciones con los granos solamente, o con un anticuerpo irrelevante). En paralelo, los lisados de células enteras utilizados para la inmunoprecipitación y lisados de las células transfectadas-siTYK2 (anticuerpo de control) fueron analizados (Fig. 5C). Así, los datos sugieren que TYK2 es fosforilada, y potencialmente activa, aguas abajo de FGF-2. Estos resultados, junto con los presentados en la Figura 3 son totalmente coherentes con un papel para TYK2 aguas abajo de FGF-2, que no depende de la fosforilación simultánea /activación de STAT1, STAT3 y STAT5. Queda por establecer si JAK1 y JAK2 también son fosforiladas aguas abajo de FGF-2.
TYK2 se une a PKCε y B-RAF en el tratamiento de FGF-2 y se requiere para la plena fosforilación de ERK1 /2 y la inducción MCL1
Los datos anteriores nos llevaron a determinar si TYK2 interactuó con B-RAF, PKCε y S6K2. No era trivial para detectar TYK2 en S6K2, B-RAF y PKCε complejo de proteínas (es) presumiblemente debido a los bajos niveles de expresión de esta proteína en células U2OS. Por lo tanto, TYK2 se inmunoprecipitó después del tratamiento con FGF-2 y los inmunoprecipitados se analizaron por Western Blot con anticuerpos contra B-RAF, PKCε y S6K2 lugar. Al FGF-2 estimulación TYK2 asociado brevemente con B-RAF y PKCε (Fig. 6A). La naturaleza transitoria de estas asociaciones también puede explicar por qué también era difícil de detectar S6K2 en estos inmunocomplejos. Los lisados de control se muestran en la Figura S5.
A. FGF-2 inducida por la interacción de TYK2 con PKCε y B-RAF en las células U2OS. Las células se trataron como se ha descrito anteriormente y las proteínas aisladas usando tampón de co-inmunoprecipitación. TYK2 se inmunoprecipitó a partir de lisados de células enteras y los inmunoprecipitados se analizaron mediante transferencias Western. Las membranas se probaron para PKCε, B-RAF y TYK2, este último usado aquí como control de carga. B. y C. TYK2 silenciamiento en células U2OS conducido a una disminución de ERK1 /2 fosforilación e inhibió la regulación al alza de MCL 1 en respuesta a FGF-2. Las células fueron transfectadas con siTYK2 como antes. las células no transfectadas y células transfectadas con un siARN no específico (NS) se utilizaron como controles. Después de 48 h, se trataron las células como se describió anteriormente y después se estimularon con FGF-2 para (B) 10 min y (C) 4 h. B. Las proteínas se analizaron usando anticuerpos contra p-ERK1 /2 (Thr
202/185 /Tyr
204/187) y el total de ERK1 /2. Los valores corresponden al fosfato ERK1 y -ERK2 niveles. análisis de transferencia de Western C. se realizó usando lisados de células totales y anti-MCL1 anticuerpo. β-actina se utilizó como control de carga y para la normalización. La media ± SEM de los valores densitométricos de tres experimentos independientes se muestran.
mediada por FGF-2 chemoprotection requerido ERK1 /2 la actividad (Fig. S2). Para determinar si esto era dependiente de TYK2, las células U2OS se transfectaron con siTYK2, tratado posteriormente con FGF-2 y ERK1 /2 fosforilación evaluado por Western blot (Fig. 6B). Cuando se compara con las células no transfectadas, RNAi contra TYK2 redujo significativamente ERK1 /2 fosforilación (por 40% para ERK1 y 25% para ERK2), un fenómeno no observado en las células transfectadas con siRNA no específica. Esto nos llevó a investigar a continuación si la regulación al alza de las proteínas anti-apoptóticos por el FGF-2 se vio afectada al silenciamiento TYK2. RNAi se realizó como antes y, como un ejemplo, la expresión de MCL1 monitoreado por transferencia de western (Fig. 6C). las células no transfectadas y células transfectadas ya sea con un siRNA no específica o siERK1 /2 se utilizaron como controles. En las células no transfectadas, o células transfectadas con un cable de control no específico, FGF-2 a un aumento significativo en los niveles de proteína MCL1. Como se predijo, siRNA contra ERK1 /2 inhibió la regulación al alza de la proteína MCL 1. Es importante destacar que la expresión MCL1 no aumentó en respuesta a FGF-2 en células con niveles disminuidos de TYK2, lo que sugiere que este JAK es necesario para la regulación al alza de MCL1.
Discusión
Hay muchos molecular mecanismos por los cuales las células se vuelven resistentes a los fármacos citotóxicos y por tanto diferentes tipos de resistencia a los medicamentos que deben abordarse para someter a las células cancerosas. FGF-2 ha sido identificado como un factor pronóstico adverso para muchos pacientes de cáncer [5], [6], [7] y Seckl y Pardo han demostrado su importancia para la resistencia a los medicamentos [3], [4], [8], [ ,,,0],9], [20].
la salida de vías de señalización JAK /STAT impactos más allá del dominio de citoquinas. Es ampliamente aceptado que la señalización JAK /STAT es altamente dependiente del contexto [18], [21], [22], [23], [24], que es de naturaleza modular y que implica tanto la diafonía y la cruz -recruitment de otras vías [11], [25]. STAT no se suelen encontrar mutado pero se ven con frecuencia constitutivamente activados en las células del cáncer [12], [19]. Por el contrario, a menudo se JAK mutado y por lo tanto no reguladas, particularmente en neoplasias hematológicas [26], [27]. A nuestro entender, JAK nunca se han implicado directamente en la resistencia a los medicamentos. Es, sin embargo, se reconoce ampliamente que muchos cánceres se acompañan por la inflamación, que está mediada por citocinas y, en consecuencia, la actividad STAT [28] JAK y. inflamación De-regulada, a su vez, se ha implicado en muchos aspectos del desarrollo y progresión del cáncer, incluyendo la resistencia a fármacos [12]. Curiosamente, JAKs pueden tener respuestas celulares contradictorios y, como se mencionó anteriormente, esto depende en el gatillo y del contexto celular [13], [29]. Las respuestas proliferativas pueden ser mediados directamente por las estadísticas, o por otras moléculas tales como ras viral homólogo de oncogén (RAS), ERK, v-src sarcoma viral homólogo de oncogén (SRC) y PI3K [revisado en [30]]. La regulación de las respuestas de citoquinas por las JAK es STAT-dependiente, pero también se ha informado de respuestas celulares STAT-independiente JAK-dependientes. De hecho, JAK1 y JAK2 modulan la expresión de Bcl-2 miembros de la familia, moléculas cruciales para las decisiones de vida o muerte celular, independientemente de la actividad STAT [31], [32]. Los estudios que utilizan líneas celulares deficientes Tyk2 sugirieron que TYK2 era crítico para las respuestas a IFN-α /β y algunas citocinas. En contraste, ratones knockout, a pesar de ser más susceptibles a las infecciones virales, tenían sus respuestas de citocinas en gran parte intactas [33]. Los estudios sobre un paciente con una deficiencia TYK2 de origen natural, sin embargo, sugirieron que era necesario para la señalización de citoquinas TYK2 completo [revisado en [13]]. Las funciones precisas de TYK2, incluso dentro de las respuestas de citocinas, siendo por lo tanto ser completamente aclarada.
A continuación, hemos demostrado que en células U2OS TYK2 es rápidamente fosforilada aguas abajo de FGF-2 (Fig. 5B), se requiere para la activación completa de ERK1 /2 (Fig. 6B) y para la inducción de MCL1 (Fig. 6C). Por otra parte, TYK2, JAK1 y JAK2 se requieren para la protección de FGF-2 mediada contra cisplatino (Fig. 1 y 3). Este efecto parece ser independiente de las estadísticas, como silenciamiento de STAT1, STAT3 o STAT5A /B no bloquear los efectos de supervivencia mediada por FGF-2 (Fig. 1 y 4). Cada STAT fue silenciado de forma independiente y es posible que desmontables concomitante de los tres STAT, o incluso de otros miembros de la familia STAT, puede repercutir en la FGF-2 resistencia a los medicamentos. El hecho de que no la fosforilación de STAT se puede detectar después del tratamiento FGF-2 sugiere, sin embargo, de lo contrario (Fig. 5A). Todavía no se sabe cómo TYK2 es fosforilada aguas abajo de FGF-2. TYK2 pueden ser reclutados directamente al receptor de FGF, o puede ser fosforilada más aguas abajo por otra quinasa tal como SRC [30]. La falta de fosforilación STAT aguas abajo de FGF-2 y la falta de impacto en FGF-2 resistencia a los fármacos (Fig. 4 y 5A) también sugiere que las citoquinas no están implicadas en las vías de resistencia a fármacos desencadenados por este factor de crecimiento. El papel de TYK2 en resistencia a los medicamentos FGF-2 mediada puede ser enzimática y /o estructural (Fig. 5B y 6A). De hecho, un papel estructural para TYK2 se ha atribuido a TYK2 en las respuestas /beta IFN-alfa, donde no sólo se requiere su presencia para la señalización sino también para la expresión en la superficie celular de la cadena IFNAR1 [34]. Hay que seguir trabajando, por lo tanto, necesaria para determinar si se requiere la actividad y /o estructura TYK2 quinasa para mediar en el favor de la supervivencia y la resistencia a los medicamentos fenotipo inducido por FGF-2.
En cuanto a las células de SCLC [4], el tratamiento de las células U2OS con FGF-2 induce la formación de complejos de proteínas que implican B-RAF, PKCε y S6K2 (Fig. 2A-2C). Conceptualmente, FGF-2 puede conducir a la formación de tres dímeros diferentes (B-RAF /PKCε; B-RAF /S6K2; S6K2 /PKCε) y /o la formación de un trímero (B-RAF /PKCε /S6K2). La estequiometría precisa de los complejos de proteínas inducidas por FGF-2 queda por determinar. La interacción entre estas tres proteínas se produce dentro de los 10 min de tratamiento de FGF-2 y es de naturaleza transitoria, disminuyendo significativamente en un 30 min. Aunque el papel exacto del complejo aún está siendo descifrado, es tentador especular que su función puede ser la de proporcionar una plataforma de señalización en estas quinasas pueden montar y someterse a eventos de fosforilación específicas requeridas para obtener más respuestas biológicas aguas abajo que finalmente conducen a la supervivencia celular. Curiosamente, los niveles S6K2 aumentan rápidamente después del tratamiento FGF-2 que indica que, además de inducir la fosforilación de S6K2, FGF-2 también puede estabilizar S6K2 (Fig. S3 y S5). A lo mejor de nuestro conocimiento, este es un nuevo hallazgo que merece una investigación más detallada. TYK2 inmunoprecipitación después del tratamiento FGF-2 co-inmunoprecipitados PKCε y B-RAF, lo que sugiere un papel importante para TYK2 en resistencia a los medicamentos FGF-2-mediada (Fig. 6A). Por consiguiente, el silenciamiento o bien TYK2, JAK1 o JAK2 utilizando RNAi bloqueado FGF-2 resistencia a los medicamentos contra el cisplatino (Fig. 3). Será particularmente pertinente para determinar si la formación de complejos de proteínas que implican PKCε, B-RAF y S6K2 depende de TYK2 desde fosforilación TYK2 es relativamente rápido y se puede detectar 5 min de tratamiento post-FGF-2. Además, hemos identificado MCL1 como una molécula TYK2 regulado. De hecho, en estas condiciones experimentales, el aumento de expresión de MCL1 siguiente FGF-2 dependido de TYK2 intacta (Fig. 6C). Esto es probablemente un hallazgo importante ya que, como BCL-2, MCL1 no induce la proliferación, sino más bien promueve la viabilidad de las células del cáncer mediante el bloqueo de la apoptosis [35]. Además, es uno de los genes de relieve en un estudio realizado por Meyerson y compañeros de trabajo que fue diseñado para identificar áreas genómico alterado que con frecuencia en los cánceres humanos [36].
En conjunto, nuestros datos sugieren que TYK2, JAK1 y JAK2 son nuevos objetivos que pueden resultar útiles para eludir la resistencia a fármacos mediada por FGF-2, un factor de crecimiento a menudo secretada por las células cancerosas, o sus tejidos de soporte, y elevada en pacientes con cáncer. Los mecanismos moleculares exactos involucrados son, pues, actualmente bajo investigación en nuestro laboratorio.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
U2OS células de la ATCC se cultivaron en la Dulbecco Modificado Medio Eagle ( DMEM) suplementado con 10% (v /v) de suero de ternera fetal (FCS) (FirstLink), 2 mM L-glutamina, penicilina 50 unidades /ml y 50 mg /ml de estreptomicina (Biowhittaker) en una atmósfera humidificada de 10% CO
2 a 37 ° C, tal como se describe anteriormente [18]. FGF-2 era de Calbiochem.
Los anticuerpos
Anti-TYK2 (C-20), STAT3 (N-terminal), STAT5A (L-20), STAT5B (G-2), ERK1 (subdominio XI), B-RAF (H145) y Bcl-2 (100) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. STAT1 anticuerpos (N-terminal) y PY20 se obtuvieron de BD Transduction Laboratories. Los anticuerpos contra fosforilados STAT1 (pSTAT1-Tyr
701), STAT3 fosforilado (pSTAT3-Tyr
705), STAT5 fosforilada (pSTAT5-Tyr
694), fosforilados ERK1 /2 (pERK1 /2-Thr
202/185 /Tyr
204/187) y PARP se compraron de Señalización celular Tecnología. Anti-MCL 1 fue de BD Pharmingen. β-actina se utilizó como control de carga. β-actina se utilizó como control de carga. β-actina se utilizó como control de carga. β-actina se utilizó como control de carga.