Extracto
La quimioterapia constituye la modalidad estándar de tratamiento para la cabeza y el cuello localizada carcinomas de células escamosas ( CECC). Sin embargo, muchos pacientes no responden y la recaída después de este tratamiento debido a la adquisición de la quimio-resistencia. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos fármacos que podrían revertir el fenotipo resistente. La curcumina, el constituyente de la cúrcuma se ha demostrado que tienen efectos anti-inflamatorios, anti-oxidante y propiedades anti-proliferativas en varios tipos de tumores. Sin embargo, el uso de la curcumina se ha limitado debido a su pobre bio-absorción. Recientemente, una nueva clase de análogos de curcumina, sobre la base de diarylidenylpiperidones (DAP), se ha desarrollado mediante la incorporación de un enlace piperidona a la estructura beta-dicetona y sustituciones de flúor en los grupos fenilo. En este estudio, se evaluó la eficacia de la H-4073, una variante parafluorinated de DAP, utilizando ambos
in vitro
y
y modelos de cáncer in vivo de cabeza y cuello. Nuestros resultados demuestran que H-4073 es un agente anti-tumor potente y que la proliferación de células inhibió significativamente en todas las líneas celulares ensayadas HNSCC de una manera dependiente de la dosis. Además, el pretratamiento de las líneas celulares resistentes al cisplatino HNSCC con H-4073 invirtió significativamente la quimio-resistencia como se observa por ensayo de viabilidad celular (MTT), ensayo de apoptosis (anexina V vinculante) y se escindió de la caspasa-3 (Western blot). H-4073 mediada sus efectos anti-tumorales mediante la inhibición de JAK /STAT3, FAK, Akt y VEGF vías de señalización que juegan un papel importante en la proliferación celular, la migración, la supervivencia y la angiogénesis. En el modelo de xenoinjerto de ratón SCID, H-4073 mejora de forma significativa los efectos anti-tumorales y anti-angiogénesis de cisplatino, sin toxicidad sistémica añadido. Curiosamente, H-4073 inhibe la angiogénesis tumoral mediante el bloqueo de la producción de VEGF por las células tumorales, así como inhibiendo directamente la función de la célula endotelial. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la H-4073 es un agente antitumoral potente y se puede utilizar para superar la resistencia a la quimioterapia en el CECC
Visto:. Kumar B, Yadav A, Hideg K, P Kuppusamy, Teknos TN, Kumar P (2014) a Novel curcumina analógico (H-4073) Mejora la eficacia terapéutica del tratamiento con cisplatino en cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 9 (3): e93208. doi: 10.1371 /journal.pone.0093208
Editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Noviembre 2013; Aceptado: 28 Febrero 2014; Publicado: 27 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Kumar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud (NIH /NCI-CA133250, P. Kumar), el Fondo de Becas de Investigación de Joan (BK P. Kumar), Experimental fondo semilla terapéutica de la Universidad Estatal de Ohio Centro Integral del cáncer (P. Kumar) , Arthur G. James Cancer hospital y Richard J. Solove Research Institute (TT, P. Kumar). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es una de las enfermedades más prevalentes en todo el mundo, con más de 600.000 casos son diagnosticados cada año [1]. El uso del tabaco y el consumo de alcohol han sido conocidos por ser los principales factores de riesgo para el desarrollo de esta enfermedad [2]. Sin embargo, ahora se está reconociendo que el virus del papiloma humano (VPH) también pueden desempeñar un papel en el desarrollo de un subconjunto de cánceres de cabeza y cuello [3]. La mayor parte del CECC son diagnosticados en etapas avanzadas y el resultado de estos pacientes es a menudo pobre [4]. El cisplatino es uno de los agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente para el tratamiento de los cánceres de cabeza y cuello [5]. El cisplatino es un agente de platino inorgánico, que puede unirse al ADN, induciendo intrastrand y de ADN entre hebras enlaces cruzados, así como ADN-proteína enlaces cruzados. Estos enlaces cruzados como resultado la inhibición de la apoptosis y el crecimiento celular [6]. Sin embargo, muchos pacientes desarrollan resistencia al tratamiento con cisplatino que conduce al fracaso del tratamiento [7]. Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas que son más eficaces y tienen menos efectos secundarios que los regímenes de tratamiento utilizados en la actualidad.
Los transductores de señal y activadores de transcripción (STAT) son una familia de proteínas de señalización que son activado por citoquinas y factores de crecimiento [8]. Hasta la fecha, 7 miembros de la familia STAT se han identificado en los mamíferos. En las células normales, las proteínas STAT obtener transitoriamente activadas por fosforilación y juegan un papel en citoquinas y de crecimiento respuestas mediada por el factor de crecimiento similar a celular, la supervivencia y la inflamación [9], [10], [11]. Sin embargo, se ha observado en numerosos estudios que STAT3 es constitutivamente activa en una variedad de tumores sólidos humanos, incluyendo cáncer de pulmón [12], cáncer de próstata [13], cáncer de mama [14] y en más de 95% de los cánceres de cabeza y cuello [10]. La desregulación y la activación constitutiva de STAT3 estimula el crecimiento celular del cáncer y contribuye al desarrollo y progresión del tumor por la regulación positiva de STAT3 genes diana incluyendo Bcl-2, c-myc, ciclina D1 y VEGF, que puede mejorar la supervivencia celular, la proliferación y la promoción de la angiogénesis [15] , [16], [17]. El aumento de expresión STAT3 se ha relacionado con mal pronóstico en pacientes con gástrico, cáncer colorrectal, carcinoma de células escamosas de cuello uterino y gliomas [18], [19], [20]. Además, se han encontrado STAT3 sobreexpresión y la señalización que se asocia con la resistencia a cisplatino en HNSCC [21], [22]. Por lo tanto, los esfuerzos intensos se han centrado en la orientación STAT3 señalización utilizando nuevos enfoques terapéuticos, que podría inducir la apoptosis y sensibilizar a los tumores a la quimioterapia [23].
Recientemente, una nueva clase de diarylidenylpiperidone (DAP) compuestos se ha sintetizado mediante la incorporación de una anillo piperidona en la estructura de esqueleto beta-dicetona de la curcumina [24]. Estos compuestos mostraron actividad anti-cáncer sustancialmente más alta que la curcumina en un modelo de cáncer de ovario [25]. También se encontró que estos compuestos inhiben la activación de STAT3. El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de un compuesto de la diarylidenylpiperidone (DAP), H-4073, ya sea como agente único o en combinación con cisplatino, tanto
in vitro
y
in vivo
. Se demuestra que H-4073, como agente único, fue eficaz en la inhibición de proliferación de células tumorales y la inducción de apoptosis. Por otra parte, H-4073 mediada por la inhibición de STAT3, quinasa de adhesión focal (FAK), Akt y factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) vías de señalización y fue capaz de sensibilizar a las células tumorales a los efectos de cisplatino, lo que resulta en la inhibición de la migración y la apoptosis
in vitro
así como la reducción en el volumen tumoral
in vivo
. Nuestros datos apoyan el uso terapéutico de la H-4073 en combinación con cisplatino en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo el trabajo con animales se aprobado por el comité de ética de la Ohio State University CICUAL animal y llevado a cabo de acuerdo con sus directrices (Bienestar Animal Aseguramiento Número A3261-01).
Líneas celulares y reactivos
UM-SCC-74A, UM SCC-1, UM-SCC-74B, UM-SCC-38 y UM-SCC-47 se obtuvieron del laboratorio del Dr. Thomas E. Carey de la Universidad de Michigan [26]. CAL27 se obtuvo de ATCC (Manassas, VA). línea celular resistente al cisplatino (CAL27-CII) se genera a partir de la línea de células CAL27 parental (ATCC) como se describe anteriormente [27]. La identidad de todas las líneas celulares fue autenticado por el genotipado STR (Kit AmpFlSTR Identifiler Amplificación por PCR, Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Todas las líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina /estreptomicina y aminoácidos no esenciales al 1% (Invitrogen). H-4073 se sintetizó como se describe anteriormente [24]. La reserva de compuesto estaba recién disuelto en DMSO para
in vitro
trabajo. Para
in vivo
trabajo, H-4073 se mezcló con la alimentación animal (50 ppm dosis por Harlan Tekland). Los anticuerpos contra pSTAT3 (Tyr705), pAkt (Ser473), pp38 (Thr180 /Tyr182), pERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) y GAPDH se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) y el anticuerpo pFAK (Tyr397) fue de Abcam ( Cambridge, MA). anticuerpo CD31 era de Dianova (Hamburgo, Alemania) y el anticuerpo p21 se obtuvo de Calbiochem (Merck Millipore, Billerica, MA).
Absorción celular
Para determinar la absorción de H-4073 por CECC células
in vitro
, las células UM-SCC-74A se cultivaron en placas de 10 cm y se tratan with10 M de H-4073 o 100 M curcumina. Después de 1 hora de incubación, las células se tripsinizaron, se contaron, y se lavaron con PBS. El sedimento de células se dejó secar, se resuspendió en metanol y se sometió a ultrasonidos durante 15 min. El sonicado se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se diluyó con un volumen igual de metanol y se mide con un espectrofotómetro (λ = 328 nm, ε = 25.000 M
-1 cm
-1).
Ensayo de UV /Vis de proliferación celular
la sensibilidad de las células a cisplatino y H-4073 se midió usando el kit de proliferación celular colorimétrico basado en MTT (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) [27]. Brevemente, 5000 células /pocillo se sembraron en una placa de 96 pocillos. El día siguiente, las células se trataron con diferentes concentraciones de H-4073, cisplatino, o una combinación de ambos. Después de 72 horas, 10 l /pocillo de solución de MTT se añadió a cada pocillo y se incubaron adicionalmente durante 4 horas a 37 ° C. Los cristales de formazán formados en los pocillos se solubilizaron mediante la adición de solución de solubilización y la incubación de las placas a 37 ° C durante la noche. Las placas se leyeron a 590 nm en un lector de placas Spectramax 190 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale CA). La inhibición del crecimiento celular porcentaje para cada grupo de tratamiento se calculó mediante el ajuste del grupo de control no tratado a 100%. Los datos se analizaron usando el software GraphPad Prism (GraphPad Sofware, Inc., San Diego, CA) y las curvas de respuesta de dosis se utilizaron para calcular la concentración de H-4073 o cisplatino resulta en una inhibición del 50% de la proliferación celular (IC50), utilizando una de cuatro modelo logístico paramétrico. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces
Para los estudios de combinación de fármacos, el efecto sinérgico se evaluó mediante el índice de combinación (CI), de acuerdo con el método de Chou y Talalay, en el que la sinergia se define como CI & lt;. 1, mientras que el antagonismo es CI & gt; 1, y un efecto aditivo se considera como CI = 1 [28]. Los valores de IC se calcularon utilizando software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).
Colonia ensayo de formación de
Las células tumorales se sembraron en placas de 6 cm y se trataron con cisplatino, H-4073 O una combinación de ambos. Después de 48 horas de tratamiento, 4 × 10
3 células viables de cada grupo se sembraron en placas de 6 cm y se cultivaron durante 10 días adicionales. Las colonias se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta. Se tomaron microfotografías y el número de colonias se contaron mediante software de imágenes de Alpha Innotech (San Leandro, CA).
Ensayo de apóptosis
Las células se sembraron en placas de 6 cm y se trató durante 24 horas. Cell sobrenadante de cultivo y las células se recogieron 48 horas después del tratamiento. Las células fueron teñidas con anexina V 488 (Life Technologies, Grand Island, NY) y yoduro de propidio (Sigma, St. Louis, MO) y se analizaron mediante citometría de flujo [27].
inmunotransferencia
Los lisados celulares se hicieron correr sobre Novex Bis-Tris gel (Invitrogen) en condiciones reductoras, se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare Life Sciences /Amersham, Piscataway, NJ), sondadas con anticuerpos primarios, a continuación, se enjuagó y se incubó con ovejas anti-ratón o burro anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare). Las membranas se visualizaron utilizando el kit ECL Plus (GE Healthcare).
Migración de ensayo
El efecto sobre la migración de las células después del tratamiento se midió utilizando el Instrumento DP RTCA xCELLigence (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania) [29]. Brevemente, las células fueron cultivadas en medio libre de suero durante 24 horas. La cámara inferior de la CIM-placa 16 se llenó con 160 l de medio completo. El fondo y cámaras superiores fueron tomadas en conjunto. medio libre de suero se coloca en la cámara superior y se incubaron durante 1 hora en el CO
2 incubadora a 37 ° C. Las células se tripsinizaron, sedimentaron y se resuspendieron de forma que se añadieron 80.000 células a cada pocillo de la cámara superior en el suero que contiene medio libre de cisplatino, H-4073, o una combinación de ambos. La CIM-Placa 16 se coloca en la estación RTCA DP y la migración se monitorizó durante 24 horas.
Los estudios in vivo
Para los estudios de eficacia anti-tumorales, se utilizaron ratones atímicos desnudos portadores de xenoinjertos de tumores . Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las directrices del Comité de la Universidad del Estado de Ohio para el Uso y Cuidado de los Animales. Las células tumorales (1 × 10
6) se mezclaron con 100 l de Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el área del flanco de los ratones [30]. Después de 8 días, los ratones fueron estratificados en diferentes grupos (n = 5), de manera que el volumen medio del tumor en cada grupo era comparable. Los animales se trataron con H-4073 mediante su mezcla con la alimentación (50 ppm dosis, Harlan Teklad) a partir de día 8. Los animales se trataron con cisplatino (5 mg /kg) en días 8, 11, 14, 17, 21, 24, y 28 a través de inyecciones intraperitoneales. mediciones del volumen tumoral [volumen (mm
3) = L x W
2/2 (longitud L, mm; anchura W, mm)] comenzó el día 6 y continuó dos veces a la semana hasta el final del estudio. Después de 30 días, los tumores primarios se retiraron cuidadosamente, fotografiados, y se analizaron para pSTAT3, células TUNEL-positivas y la angiogénesis tumoral.
La inmunohistoquímica
Los tejidos tumorales de xenoinjertos fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante la noche y embebidos en parafina. Las secciones de tejido fueron deparffinized, tratada previamente con tampón de recuperación de antígeno (EDTA, pH 8,0; pSTAT3) (citrato, pH 6,0; CD31) [27]. La peroxidasa endógena y los sitios de unión no específicos se bloquearon y se incubaron las secciones con pSTAT3 (Tyr 705) o CD31. La unión de anticuerpo primario se detectó utilizando IgG de cabra biotinilado anti-conejo (Vector Laboratories, Burlingame, CA) o de cabra biotinilado anti-IgG de rata (BD Biosciences, San Jose, CA). Los portaobjetos se incubaron a continuación con el complejo avidina-biotina (Vector Laboratories). Los sitios de reacción se visualizaron utilizando 3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron con Permount.
El ApopTag peroxidasa en Kit Situ Apoptosis Detección (EMD Millipore, Billerica, MA) se utilizó para detectar células apoptóticas por desoxinucleotidil transferasa terminal etiquetado final dUTP nick ( TUNEL) tinción en las secciones de tumor de xenoinjerto de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron con proteinasa K durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron. La actividad peroxidasa endógena se inactivó y después de lavar las secciones se incubaron con la concentración de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) que trabajan a 37 ° C durante 1 hora. A continuación, las secciones se lavaron y se incubaron con conjugado de anti-digoxigenina (peroxidasa) a temperatura ambiente. La señal se visualizó con DAB como cromógeno.
Análisis estadístico
Los datos de todos los experimentos se expresan como media ± SEM de un mínimo de 3 experimentos independientes. La significación estadística de los resultados se evaluó mediante análisis de dos vías de la varianza o la prueba t de Student (en su caso) y un valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo. IC
50 valores para H-4073 y cisplatino para la inhibición de la proliferación de células del tumor se calculó utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Sofware, Inc., San Diego, CA) y el índice de combinación (IC) se calculó utilizando el software CompuSyn (ComboSyn, Inc ., Paramus, Nueva Jersey).
resultados
H-4073 es un potente inhibidor de la proliferación CECC
Los efectos inhibidores del crecimiento de cisplatino en un panel de líneas celulares fueron HNSCC evaluado usando el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 1A, el tratamiento con cisplatino inhibió el crecimiento de líneas celulares HNSCC de una manera dependiente de la dosis. Se seleccionaron dos líneas celulares (CAL27-CISR y UM-SCC-74A) que eran más resistentes a cisplatino para experimentos adicionales. UM-SCC-74A es la línea celular de carcinoma de células escamosas derivados de una base del tumor lengua. Esta línea celular fue elegido para imitar la resistencia a cisplatino natural o inherente. CAL27-CISR se seleccionó por el crecimiento de la línea parental lengua carcinoma de células escamosas de células (CAL27) en concentraciones crecientes de cisplatino durante un período prolongado de tiempo [27]. Esta línea celular se generó para imitar fenotipo resistente a cisplatino adquirida. La curcumina ha sido amplia estudiado por sus propiedades STAT3-inhibidor y la actividad anti-tumor [31]. Sin embargo, debido a su escasa biodisponibilidad y metabolismo rápido, la curcumina no ha hecho la transición a la clínica. Por lo tanto, hemos desarrollado un análogo sintético de la curcumina, H-4073 (Fig. 1B). En nuestro estudio, H-4073 (10 mM) demostró & gt; 5 veces mayor captación celular en una línea celular de cáncer de cabeza y cuello (UM-SCC-74A) en comparación con la curcumina (100 mM, Fig 1 C.). H-4073 fue muy eficaz en la inhibición de la proliferación celular de todas las líneas celulares CECC que se probaron, independientemente de su condición o el estado de p53 del virus del papiloma humano (HPV, la Figura 1D). En nuestro estudio mecanicista, se observó una marcada inhibición de la STAT3, FAK y la fosforilación de Akt por tratamiento H-4073 de una manera dependiente de la concentración (Fig. 1E). Además, el tratamiento H-4073 también indujo la activación de MAPK p38, una quinasa activada por estrés que se sabe que median la muerte celular
A:. Líneas celulares HNSCC
se trataron con diferentes concentraciones de cisplatino (CDDP) y la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTT.
B:
estructuras químicas de la curcumina y H-4073.
C:
células UM-SCC-74A se cultivaron en placas de cultivo de 10 cm y tratados con curcumina o H-4073 durante 1 hora. La captación celular de la curcumina y H-4073 se midió con un espectrofotómetro UV /Vis.
D: líneas celulares
HNSCC se trataron con diferentes concentraciones de H-4073 y la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTT.
E:
células UM-SCC-74A fueron tratados con diferentes concentraciones de H-4073 durante 2 horas. STAT3, FAK, Akt y fosforilación de p38 se examinó por transferencia de Western y la igualdad de la carga de proteínas se verificó por extracción de los borrones y reprobing con anticuerpo GAPDH.
H-4073 sinérgicamente reforzada en la eficacia antitumoral del cisplatino en las células HNSCC
a continuación examinó si el tratamiento H-4073 podría revertir la resistencia a cisplatino en células de cáncer de cabeza y cuello y mejorar su eficacia antitumoral de una manera sinérgica. Se seleccionaron dos líneas celulares resistentes al cisplatino, UM-SCC-74A (naturalmente resistentes a cisplatino) y CAL27-cis-R (generado en nuestro laboratorio) para todos nuestros estudios. El efecto anti-proliferativo de H-4073 y el tratamiento de combinación con cisplatino (CDDP) se midió mediante el cálculo del índice de combinación (IC) de acuerdo al método de Chou-Talalay [28] utilizando una relación de dosis fija. Ambos H-4073 y CDDP se añadieron a los cultivos de células tumorales en el 0,25 × 0,5 ×, × 1, 1,5 y 2 veces su respectivo IC
50 dosis. La proliferación celular tanto en las líneas celulares se disminuyó notablemente después del tratamiento de combinación en las concentraciones múltiples emparejados en comparación con el tratamiento con cualquiera de los agentes individuales por sí solo (Fig. 2). índice de combinación (CI) para las diferentes dosis eficaces (ED) se calculó usando software CompuSyn. valores de CI para las células UM-SCC-74A en DE50, DE90 y Ed75 fueron 0,550, 0,537 y 0,244, respectivamente. Los valores de CI para las células CAL27-CISR fueron 0,628, 0,606 y 0,507 en DE50, DE90 y Ed75, respectivamente. Estos resultados sugieren que H-4073 y el tratamiento de combinación con cisplatino fue muy eficaz en la inhibición de proliferación de células tumorales de una manera sinérgica, tanto en las líneas de células resistentes a cisplatino
A y C:.
UM-SCC -74A
(
Un
)
o CAL27-CISR
(
C
)
células eran tratado con H-4073 o cisplatino (CDDP) por sí sola o en combinación a las 0,25, 0,5, 1, 1,5 y 2 veces su respectivo IC
50 dosis y la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Los resultados se analizaron según el método de Chou-Talalay y los valores del índice de combinación (IC) calculado por el software CompuSyn.
B y D: diagramas de barras que muestran
resultados de la proliferación celular para UM-SCC-74A
(
B Opiniones
) Opiniones y CAL27-CISR
(
D
) Restaurant at IC dosis
50 de H-4073 y cisplatino (CDDP). *, Representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con el grupo sin tratamiento y **, representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05)., En comparación con los grupos de tratamiento individuales
A continuación se investigó la efecto de H-4073 solo o en combinación con cisplatino en la formación de colonias de células tumorales. Según se observó con ensayo de proliferación celular, un tratamiento de combinación con H-4073 y cisplatino en su respectivo IC
50 dosis la formación de colonias de células tumorales inhibidas de manera sinérgica (93% en UM-SCC-74A y 92% en CAL27-CISR células) (Fig. 3A-C).
CAL27-CISR
(
A-B Opiniones
)
o UM-SCC-74a
(
C
)
células se trataron con H-4073 o cisplatino (CDDP) por sí sola o en combinación durante 48 horas. Cuatro mil células viables de cada grupo se cultivaron durante 10 días adicionales en placas de 6 cm. Cada ensayo fue fotografiada y el número de colonias se analizó. *, Representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con ningún grupo de tratamiento y **, representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05)., En comparación con los grupos de tratamiento individuales
H-4073 inhibió la migración celular y aumento de la apoptosis de las células tumorales
a continuación examinó el efecto de la H-4073 y el tratamiento de combinación con cisplatino sobre la motilidad de las células tumorales mediante el ensayo de cero. H-4073 y el tratamiento cisplatino solo mostraron 48% y 44% de inhibición de la motilidad celular UM-SCC-74A y 46% y el% de inhibición de la motilidad celular CAL27-CISR, respectivamente (Fig. 4A-B) 42. H-4073 cuando se combina con cisplatino mostraron significativamente mayor inhibición de la UM-SCC-74A y la motilidad CAL27-CISR celular (85% y 82%), respectivamente. En el próximo grupo de experimentos, se examinó si los efectos antitumorales mediadas-H-4073 están mediadas por apoptosis. De hecho, H-4073 en el tratamiento de combinación con cisplatino mostraron significativamente mayor apoptosis de las células tumorales (Anexina V tinción, Fig. 4C) en comparación con las células no tratadas o H-4073 y las células tratados con cisplatino solo. Además, el tratamiento combinado, inhibió la activación de STAT3 y aumentó notablemente los niveles de caspasa 3 activa y p21 (Figura 4D).
A-B:.
Motilidad de las células del tumor se examinó mediante ensayo de cero . Cada ensayo fue fotografiado y las distancias entre los bordes de células que migran se cuantificó y se calculó la migración celular en porcentaje. *, Representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con ningún grupo de tratamiento y **, representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con los grupos de tratamiento individuales.
C-D:
células UM-SCC-74A se trataron con H-4073 o cisplatino (CDDP) por sí sola o en combinación. Después de 24 horas, las células se tiñeron con anexina V y se analizaron por citometría de flujo o transferencia Western para pSTAT3, p21 o escindidos de caspasa 3. carga igualdad de proteína se verificó por extracción de los borrones y reprobing con anticuerpo GAPDH.
H-4073 aumentó significativamente la eficacia terapéutica de cisplatino en los cánceres de cabeza y cuello resistentes a cisplatino
Nuestro
in vitro
datos sugirieron que H-4073 invirtió significativamente la resistencia a cisplatino en células de cáncer de cabeza y cuello . Hemos validado aún más nuestra
in vitro
resultados mediante el uso de un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos atímicos. En la primera serie de experimentos, se utilizó una línea celular de cáncer de cabeza y cuello resistentes de forma natural (UM-SCC-74A). H-4073 (50 ppm) y cisplatino (5 mg /kg) tratamiento solo mostraron 33% y la inhibición del crecimiento tumoral del 39% en el día 30, respectivamente (Fig. 5A-B). H-4073 en combinación con cisplatino mostró inhibición del crecimiento tumoral significativamente mayor en comparación con el grupo no tratado (84%) o un único agente (Fig. 5A-B). Además, el tratamiento de combinación fue muy bien tolerado y no causó ningún tipo de toxicidad animal o inducir disminución significativa en el peso corporal.
Los animales que lleven UM-SCC-74A, CAL27 y CAL27-CISR fueron tratados con H -4073 (50 ppm) o cisplatino (CDDP, 5 mg /kg) solo o en combinación.
A:
microfotografías representativas de tumores UM-SCC-74A de tratar, cisplatino (CDDP), H-4073, o los grupos tratados con H-4073 y CDDP.
B:
curvas de crecimiento tumoral de los tumores UM-SCC-74A tratados con cisplatino (CDDP), H-4073, o CDDP y H-4073.
C:
curvas de crecimiento tumoral de los tumores CAL27 y CAL27-CISR tratados con cisplatino (CDDP), H-4073, o CDDP y H-4073. *, Representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con el grupo sin tratamiento y **, representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05)., En comparación con los grupos de tratamiento individuales
En el segundo set de experimentos, se utilizó la línea celular resistente al cisplatino (CAL27-CISR, IC
50 28 mmol /L) y su línea parental cisplatino-sensibles celular (CAL27, IC
50 3 mmol /L). Como hemos demostrado anteriormente [27], el tratamiento con cisplatino (5 mg /kg) de los animales portadores de tumores CAL27-CISR no afectó significativamente el crecimiento del tumor (9%) en el día 30, mientras que el tratamiento con cisplatino de sus células parentales (CAL27) disminuyeron marcadamente el crecimiento del tumor (45%). tratamiento H-4073 en células CAL27-CISR fue significativamente más eficaz en la reducción de la carga tumoral (32%). H-4073 y la combinación de cisplatino tratamiento fue más eficaz en la inhibición del crecimiento tumoral de los tumores CAL27-CISR (77%, Fig. 5C).
H-4073 y el tratamiento de combinación con cisplatino, inhibió la fosforilación de STAT3
in vivo Opiniones y aumento de la apoptosis de las células tumorales
en nuestro
in vitro
estudio, hemos observado que la H-4073 es un potente inhibidor de la fosforilación de STAT3. A continuación examinó si el tratamiento H-4073 inhibe la fosforilación SAT3
in vivo
. tumores UM-SCC-74A modelo de xenoinjerto de ratón se tiñeron con anticuerpos pSTAT3. H-4073 y el tratamiento con cisplatino, inhibió la fosforilación de STAT3 (43% y 30%, respectivamente). H-4073 y la combinación de cisplatino tratamiento fue más eficaz en la inhibición de la fosforilación de STAT3 (94%) (Fig. 6A-B). De manera similar, H-4073 y la combinación de cisplatino tratamiento fue más eficaz en la inducción de apoptosis en las células tumorales
A-D (Fig 6C-D.):.
Incluidas en parafina UM-SCC-74A Las muestras tumorales fueron teñidas con pSTAT3 (Y705) y las células apoptóticas (Apop Tag kit).
A:
microfotografías representativas de las muestras tumorales teñidas para pSTAT3 de tratar, cisplatino (CDDP) o H-4073 solo o grupos de combinación.
B:
células pSTAT3 positivas se cuantificaron en 5 campos de alta potencia (400 ×) de cada muestras de tumor y el porcentaje de células positivas calculados.
C:
microfotografías representativas de las muestras tumorales teñidas para células apoptóticas de tratar, cisplatino (CDDP) o H-4073 solo o grupos de combinación.
D: células
TUNEL-positivas se cuantificaron en 5 campos de alta potencia (400 ×) de cada muestras de tumor y el porcentaje de células positivas calculados. *, Representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con ningún grupo de tratamiento y **, representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05)., En comparación con los grupos de tratamiento individuales
H-4073 inhibió la angiogénesis tumoral mediante la regulación negativa de la secreción de VEGF de las células tumorales
un número de estudios han demostrado que STAT3 es un regulador clave de la angiogénesis [16], [32]. A continuación examinó si H-4073 y la combinación de cisplatino tratamiento afectó la angiogénesis tumoral. H-4073 y el tratamiento cisplatino solo mostraron 24% y 31% de inhibición de la angiogénesis tumoral en UM-SCC-74A (Fig. 7A-B), mientras que H-4073 y el tratamiento de combinación con cisplatino mostraron una inhibición 62% de la angiogénesis tumoral. A continuación examinó si H-4073 inhibe la angiogénesis tumoral mediante el bloqueo de la producción de VEGF por las células tumorales. células UM-SCC-74A se trataron con H-4073 y los niveles de VEGF en los sobrenadantes de cultivo se midieron por ELISA. células UM-SCC-74A no tratadas producen altos niveles de VEGF (1.121 pg /ml /10
6 células, Fig. 7C). H-4073, y el tratamiento con cisplatino solo mostraron un 36% y el% de inhibición de los niveles de VEGF 55. H-4073 y el tratamiento de combinación con cisplatino inhibieron significativamente la producción de VEGF (83%). En la siguiente serie de experimentos, examinamos si H-4073 podría afectar directamente la función angiogénica de las células endoteliales mediante la inhibición de la señalización de VEGF. Nuestros resultados de este estudio demuestran que H-4073 marcadamente inhibir VEGF mediada por ERK1 /2 y la fosforilación de Akt (Fig. 7D). Además de la inhibición de la señalización de moléculas pro-supervivencia (ERK1 /2 y Akt) H-4073 MAPK p38 también activado (una molécula pro-apoptótica) de una manera dependiente de la dosis (Fig. 7D).
R:
fotomicrografías representativas de tinción de los vasos sanguíneos del tumor para tratar, cisplatino (CDDP) o H-4073 solo o grupos de combinación para tumores UM-SCC-74A.
B:
densidad de microvasos en las muestras tumorales se calculó contando 5 campos aleatorios (200 ×) y se expresó como la densidad de vasos ± SE.
C:
células UM-SCC-74A se trataron con cisplatino o H-4073 solo o en combinación. Después de 72 horas, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se analizaron para los niveles de VEGF. *, Representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con ningún grupo de tratamiento y **, representa una diferencia significativa (p & lt; 0,05) en comparación con los grupos de tratamiento individuales.
D:
Las células endoteliales fueron tratadas con VEGF en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de H-4073 durante 30 minutos. ERK1 /2, Akt y p38 fosforilación fue examinado por Western Blot y la igualdad de carga de proteínas fue verificada por extracción de los borrones y reprobing con anticuerpos GAPDH.
Discusión
Los pacientes con cabeza y cuello cáncer abarca un grupo heterogéneo e incluso con el avance de las opciones de tratamiento, la tasa de supervivencia general de los pacientes con enfermedad avanzada no ha cambiado sustancialmente en las últimas décadas [33]. Cirugía seguida de radioterapia adyuvante ha sido utilizado en el tratamiento de pacientes con HNSCC [34]. Más recientemente, los regímenes basados en platino se están integrando en las opciones de tratamiento [35]. Sin embargo, muchos de los pacientes desarrollan resistencia a cisplatino, uno de los agentes de platino más ampliamente utilizado, lo que lleva al fracaso del tratamiento [21], [36]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos agentes terapéuticos que se dirige específicamente a las vías pro-supervivencia. Estudios recientes han demostrado que STAT3 se activa constitutivamente en las células tumorales y se sobreexpresa en líneas celulares resistentes al cisplatino [21], [37].