Extracto
ADN-metiltransferasa (DNMT) -3A que contiene
DNMT3A1
y
DNMT3A2
isoformas se han propuesto para desempeñar un papel crucial en la carcinogénesis y mostró una expresión aberrante en la mayoría de los cánceres. evidencias acumuladas también indicaron que los polimorfismos de nucleótido único (SNP) en los genes Dnmt estaban asociados con la susceptibilidad a diferentes tumores. La hipótesis de que las variantes genéticas en
DNMT3A1
región promotora se asocian con el riesgo de cáncer gástrico. Se seleccionaron los tagSNPs de la base de datos HapMap para los chinos y genotipo en un estudio de casos y controles para evaluar la asociación con el cáncer gástrico (CG) en una población china. Identificamos que los rs7560488 tagSNP funcionales T & gt; C asocian con un riesgo significativamente mayor de GC.
in vitro
análisis funcional mediante el ensayo indicador de luciferasa y la EMSA indicó que el rs7560488 tagSNP T & gt; C modifiquen sustancialmente la actividad transcripcional de
DNMT3A1
gen que influye a través de la unión de algunos factores de transcripción, aunque un transcripcional definida factor de aún debe ser establecida. En comparación con los homocigotos TT, los sujetos que eran heterocigotos y homocigotos CC TC mostraban una expresión reducida de
DNMT3A1
. Por otra parte, el análisis estratificado mostró que los individuos que albergan TC o genotipos CC menos de 60 años de edad eran más susceptibles a la GC. Nuestros resultados sugieren que las variaciones genéticas en el
DNMT3A1
promotor contribuyen a la susceptibilidad a la GC y también proporcionan una visión que rs7560488 tagSNP T & gt; C pueden ser un prometedor biomarcador para predecir GC susceptibilidad genética y una información valiosa en GC patogénesis
Visto:. Wu H, Zhang K, P Gong, Qiao M, L Wang, Cui H, et al. (2014) A Novel funcional TagSNP Rs7560488 en el DNMT3A1 promotor está asociado con la susceptibilidad al cáncer gástrico mediante la modulación de la actividad del promotor. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10.1371 /journal.pone.0092911
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: Diciembre 22, 2013; Aceptado: 27 Febrero 2014; Publicado: 25 Marzo 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81171915 y N ° 91229107) y de la Investigación Científica e Innovación para los graduados universitarios de la provincia de Jiangsu, China (Grant No. CXZZ13_0082). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es uno de los tumores malignos más comunes en china, especialmente en la provincia de Jiangsu, con una alta tasa de incidencia y la mortalidad [1], [2]. Se puede propagar a través del estómago y otros órganos, incluyendo el esófago, pulmones, ganglios linfáticos o el hígado. Por lo tanto, el cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el [3] mundo. En el examen de la eficacia terapéutica, la resección quirúrgica puede ser un tratamiento curativo primario para la etapa más temprana de los pacientes GC [4]. Por desgracia, la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se detectan en etapa avanzada, período durante el cual el tumor no resecable son más. Por otra parte, la recaída después de la cirugía es otro acontecimiento terrible para una tasa de supervivencia a los 5 años. Teniendo en cuenta los pacientes con cáncer gástrico avanzado o recurrente, no hay duda de que el descubrimiento de biomarcadores y su aplicación acompañado de diagnóstico tradicional podría ser una indicación valiosa y una extensa ayuda en la formulación de la estrategia de prevención y tratamiento. Sin embargo, hasta el momento, se han identificado algunos marcadores biológicos medibles para predecir la recurrencia GC.
Tumorigénesis se sabe que es un proceso de varios pasos, que es el resultado no sólo de alteraciones genéticas, sino también los cambios epigenéticos [5]. metilación del ADN es una forma importante de la modificación epigenética y desempeña un papel esencial en el desarrollo, la diferenciación, la estabilidad genómica, X-inactivación, y la impresión por regulación específica de la expresión génica. El fenómeno epigenético más estudiada es la metilación del ADN, un regulador esencial de la estructura de la cromatina y la transcripción. patrones de metilación del ADN aberrante en un fondo susceptible genéticamente pueden estar asociados con un mayor riesgo de una serie de trastornos humanos [6], [7], incluyendo GC [8].
DNMT3A
que contiene
DNMT3A1
y
¿Cuáles son dos DNMT3A2
de novo
metiltransferasas de ADN juega un papel crucial en el desarrollo embrionario y la metilación aberrante del ADN en la carcinogénesis. Algunos polimorfismos del
DNMT3A
gen pueden regular la expresión génica, influir en su actividad enzimática y pueden contribuir a la susceptibilidad al cáncer. evidencias acumuladas en genética molecular indican que el SNP en
DNMT
genes están asociados con la susceptibilidad al cáncer [9], [10]. Los recientes avances en el estudio de todo el genoma asociación (GWAS) también se han identificado nuevos SNPs de susceptibilidad para la GC, que es útil para comprender el mecanismo subyacente de las variaciones genéticas en el desarrollo de GC [11] - [14]. Nuestro estudio anterior encontró un SNP rs1550117 funcionales en
DNMT3A
promotor que puede aumentar su actividad transcripcional y contribuir a la susceptibilidad genética al cáncer gástrico en una población china [15], [16].
GWAS ha producido numerosos SNPs asociados con muchos tipos de cáncer. En algunos casos, de SNPs docenas, llamados tagSNPs que representan SNPs en una región del genoma con alta desequilibrio de ligamiento pueden identificar la variación genética sin genotipificación de cada SNP en una región cromosómica, por lo tagSNPs son útiles en todo el genoma de los estudios de asociación de SNP, tal como de próstata, de mama, de ovario, colorrectal y los cánceres de cerebro [17] - [19]. En el presente estudio, se seleccionaron un rs7560488 tagSNP de la base de datos HapMap para los sujetos chinos para evaluar las asociaciones entre las variantes genéticas en el
DNMT3A1
promotor y el riesgo de cáncer gástrico en una población china. Se identificaron un rs7560488 riesgo asociado a T & gt;. C polimorfismo en el
DNMT3A1
promotor, y nuestro trabajo adicional sugiere que esta variante podría alterar la actividad promotora y destruir la capacidad de unión de factores de transcripción
materiales y Métodos
sujetos de estudio
Un total de 405 pacientes con diagnóstico histológico de cáncer gástrico y 408 controles sin cáncer fueron reclutados en este estudio de casos y controles, y las características de los casos y controles se detallan en la Tabla 1. los casos y controles fueron emparejados por edad, sexo y fueron seleccionados de entre el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing. Todas las muestras se obtuvieron con consentimiento por escrito y se analizaron de forma anónima. Este estudio se realizó con la aprobación del Comité de Ética Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad del Sureste.
TagSNP selección y la TF sitio de unión de predicción
La principal hipótesis que subyace en este experimento fue que hay uno o más SNPs en el
DNMT3A1
regiones promotoras que están asociados con el riesgo de cáncer gástrico. Dependiendo de la estructura de desequilibrio de ligamiento (LD) en un locus concreto, tagSNPs pueden ser sustitutos para muchos otros miles de SNPs. Postulamos que tales tagSNPs también son propensos a etiquetar los SNPs identificados hasta ahora en el
DNMT3A1
promotor. De este modo, se seleccionaron los SNPs en el
DNMT3A1
región promotora con un alelo menor frecuencia (MAF) de & gt; 5% a partir de las bases de datos de HapMap y dbSNPs. Para llevar a cabo la selección tagSNP potencialmente funcional, se utilizan los datos de las herramientas de selección del tagSNP libremente basada en web HapMap Internacional y para seleccionar tagSNPs, y utilizar el algoritmo de búsqueda TF-(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH .html) para predecir el factor de transcripción rs7560488 (TF) sitio de unión.
Extracción de ADN y HRM Genotipado
para estudiar el
DNMT3A1
promotor rs7560488 tagSNP, se aisló el ADN genómico de se extrajo 1 ml de sangre periférica de pacientes e individuos sanos y de los glóbulos blancos dentro de una semana después de la recogida de la muestra por digestión con proteinasa K como se ha descrito anteriormente [20]. rs7560488 tagSNP se genotipo utilizando el colorante de ADN de doble cadena LC verde en combinación con una alta resolución de fusión análisis (GRH). En detalle, los cebadores de PCR fueron diseñados por el software de diseño de cebadores LightScanner (Idaho Technology) (cebador directo: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 '; cebador inverso: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3') cuál es el producto de un solo fragmento de 208 pb. Cada reacción de PCR se llevó a cabo inicialmente en un volumen final de reacción de 10 l, utilizando 25 ng de ADN genómico, 0,2 pmol de cada cebador, 0,8 mu l dNTPs 2,5 mM, 1 l MgCl 25 mM
2, 1 l 10 x tampón de Taq con (NH4)
2SO
4, 0,4 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas), 1 l de 1X LC Green Plus (Idaho Technology) y 0,4 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). La mezcla de reacción se incubó a 95 ° C durante 5 min y después se sometió a 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 segundos, seguido de 72 ° C durante 7 min utilizando un termociclador PTC-200 (Bio-Rad). Las reacciones de PCR se transfirieron a las placas de 96 pocillos (Bio-Rad) y se analizaron en el escáner de luz (Idaho Technology). Se recogieron datos de fluorescencia en un intervalo de temperatura de 70-97 ° C, y el análisis de curva de fusión se realizó de acuerdo con el software del fabricante. HRM podría discriminar directamente el heterocigoto (CT) y homocigotos (CC o TT) genotipos de tagSNP rs7560488 T & gt; C a través de la exploración en estado fundido. Después de la mezcla de ADN homocigótico con una cantidad igual de productos de PCR conocidos (por ejemplo, CC), se distingue además entre el CC y TT genotipos. Para mayor confirmación, se seleccionaron aleatoriamente 5% de las muestras de cada grupo detectado por HRM y se sometió a secuenciación de ADN para asegurar la fiabilidad y reproducibilidad.
Construcción de plásmido informador de luciferasa
Para construir el DNMT3A1 tagSNP plásmido reportero rs7560488, que amplifica el fragmento de 948 pb 25.422.345 a 25.422.345 de
DNMT3A1
región del promotor, que contiene el alelo T y C de SNP por PCR a partir de ADN genómico. Los cebadores utilizados para las amplificaciones de PCR fueron: (adelante: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', inversa: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). Los productos de PCR se subclonaron en los sitios de restricción NheI y HindIII del vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI). Verificamos todos los clones recombinantes mediante secuenciación de ADN.
transfección transitoria y Dual Luciferase reportero de ensayo
AGS células humanas de cáncer gástrico y BGC-823 (ATCC) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina /estreptomicina 1% (10 000 U /ml y 10 mg /ml, respectivamente). AGS y células BGC-823 (1 × 10
5) se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos. Después de 24 horas de cultivo, las células AGS, BGC-823 fueron transfectadas por Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) con 0,8 mg de cada vector construido, ya sea con alelo T o C alelo. Al mismo tiempo, 10 plásmidos pRL-TK ng (Promega) por pocillo también se transfectó como un control interno para corregir la eficiencia de transfección. Antes de que, las células se sembraron en placas de 24 pocillos durante la noche para asegurar 90% -95% de confluencia en el momento de la transfección. Veinticuatro horas después de la transfección, la actividad luciferasa se midió por el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y se expresó como la relación de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla actividades. Todas las células se realizaron por triplicado con las mismas condiciones. Se realizaron tres experimentos de transfección independientes, y cada ensayo de luciferasa se llevaron a cabo por triplicado.
Shift movilidad electroforética de ensayo (EMSA)
Los oligonucleótidos 5'-biotina 25 pb de longitud se obtuvieron de Beijing Instituto de genómica (BGI). secuencias de oligo fueron rs7560488 [T] Adelante: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] inversa: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Adelante: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] inversa: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Para el recocido, se concentraron oligonucleótidos complementarios se mezclaron en una proporción 01:01 molar y se incubaron a 95 ° C durante 5 min y luego reducida gradualmente durante horas hasta que los oligonucleótidos alcanzado la temperatura ambiente. oligos hibridados se diluyeron a una concentración final de 10 fmol. proteínas nucleares fueron extraídos de las células BGC-823 utilizando los reactivos nucleares y citoplasmáticas NE-PERTM de extracción (Pierce, Rock-ford, IL, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit LightShift quimioluminiscente EMSA (Pierce /Thermo Fisher Scientific) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las reacciones de unión se realizaron de la siguiente manera: los extractos nucleares (8 g de proteína) y el tampón de unión 1 x con 2,5% de glicerol, mM MgCl2 5, 50 ng /poli l (dI-dC), 0,05% NP-40, y 60 fmol rs7560488 sondas C T /rs7560488 marcados con biotina se incubaron en hielo durante 30 min en un volumen de 20 l. Para los estudios de competición, los extractos nucleares se incubaron con el oligonucleótido no marcado durante 30 min antes de la adición de oligonucleótido marcado. Para una supershift, se añadió AP-1 anticuerpo (BOSTER, China). Los complejos se separaron por electroforesis en nativo PÁGINA 6% en 0,5 x tampón TBE a 110 V. Los geles se transfirieron a membranas Biodyne B pre-cortadas de nylon modificadas (Pierce /Thermo Fisher Scientific) utilizando una célula de transferencia semi-seco Trans-Blot SD ( Bio-Rad Laboratories). Las membranas se reticulado (UVC-508 reticulador UV, Ultra LUM) y se detectó la señal con un sistema de detección quimioluminiscente (Pierce /Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
detección de DNMT3A1 Transcripciones por RT-PCR cuantitativa (Q-PCR)
para detectar aún más la correlación entre los niveles y rs7560488 DNMT3A1 mRNA polimorfismo, los 44 tejidos de cáncer gástrico con diferentes genotipos fueron sometidos a la extracción del ARN total usando el reactivo Trizol ( Invitrogen, Inc.). El nivel DNMT3A1 mRNA se midió por cuantitativa en tiempo real PCR después de la transcripción inversa en una máquina de PCR 7900 Real-Time Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-actina se utilizó como un control cuantitativo interna para cada muestra. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron DNMT3A1 F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'y R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; los cebadores para β-actina fueron F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'y R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Cuantificación relativa de DNMT3A1 ARNm se calculó utilizando el método 2-ΔΔCT, y cada ensayo se realizó por triplicado.
Análisis estadísticos
Todos los datos fueron analizados con el
SPSS versión
13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Los pacientes y los controles se compararon mediante Estudiante de
t-test
para las variables continuas y la prueba de chi-cuadrado (χ2) para las variables categóricas. Se obtuvieron las frecuencias alélicas y genotípicas entre los sujetos de control y GC mediante la prueba de chi-cuadrado, y se utilizó la prueba estándar de bondad de ajuste para poner a prueba el equilibrio de Hardy-Weinberg. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Características de los sujetos de estudio
La distribución de frecuencias de los casos y los controles son presentado en la Tabla 1, no hubo diferencia significativa en la distribución de frecuencias entre los casos y los controles (P = 0,243 para la edad y P = 0,355 para el sexo). La media de los pacientes y controles fue de 59,8 años (rango 20~93 años) y 60,6 años (rango 25~90 años), respectivamente. No se encontraron diferencias significativas en la edad media y género, lo que sugiere que la igualación sobre la base de estas dos variables fue adecuado.
Candidato tagSNP Selección y Genotipado
Entre los candidatos SNPs en
DNMT3A1
, nos centramos en los tagSNPs en el promotor de
DNMT3A1
y predijo su función potencial en la unión de factores de transcripción, que afectan a la expresión cualitativa y cuantitativa de la
DNMT3A1
. Se aplicó un algoritmo de selección basado tagSNP-LD (r
2≥0.80, MAF≥5%), que identificaron dos tagSNPs que representa la variación genética en la población común CHB, incluyendo el candidato tagSNPsrs7560488 y rs1550117 que es un polimorfismo funcional que modifica la la susceptibilidad de cáncer gástrico que confirma antes [15], [16]. TFSEARCH algoritmo predijo que rs7560488 T crea un sitio de unión para AP-1 (Figura 1). Las muestras para el genotipado de gestión de recursos humanos y la secuenciación de ABI 3730 secuenciador automatizado, respectivamente (Figura 2).
(A) HRM directamente discriminado los heterocigotos (TC) y los homocigotos TT (o CC), los productos de PCR homocigotos (TT o CC) se midieron por LightScanner después de haber sido mezclado con una cantidad igual de un producto conocido (TT), que distingue las muestras de homocigotos salvajes (TT) de las variantes (CC), como se convirtieron los homocigotos mutacionales (CC) en heterocigotos (TC). (B) muestras al azar de la rs7560488 T & gt; la prueba C se secuenciaron para su confirmación, La flecha negro indica que el polimorfismo de nucleótido en los loci rs7560488
TagSNP rs7560488 variante T & gt;. C en DNMT3A1 Promotor aumenta significativamente el riesgo de GC
la distribución de genotipos y frecuencias alélicas de rs7560488 se presentan en la Tabla 2. las frecuencias genotípicas en los controles estaban de acuerdo con el modelo de Hardy-Weinberg (P = 0,274). Como se muestra en la Tabla 2, las frecuencias genotípicas de rs7560488 fueron 68,9%, 27,4% y 3,7% para el TT, TC, y los genotipos CC entre los casos y 79,9%, 18,4% y 1,7% entre los controles, respectivamente, la diferencia entre los casos y los controles fue estadísticamente significativa (P & lt; 0,05). Además, la frecuencia del alelo T fue significativamente menor entre los casos que en los controles (82,6% frente a 89,2%; p = 0,000). Además, la frecuencia del genotipo CT /CC combinado fue mayor en los casos que en los controles (31,1% frente a 20,1%; p = 0,002). Al tomar el genotipo TT y el alelo T como referencia, se encontró que los genotipos variantes (TC y CC) se asociaron con un mayor riesgo de CG (OR = 1,653; IC del 95% = 1,194-2,287; p = 0,002). Del mismo modo, también se observó que las frecuencias de los alelos C fue estadística y significativamente mayor que los controles (OR = 1,744; IC del 95% = 1.310-2.321; P = 0,000). En conjunto, estos datos sugieren que los genotipos de CT y CC se asociaron con la susceptibilidad genética a la GC;
DNMT3A
1 rs7560488 alelo T puede ser un alelo protector putativo. No hubo significativas frecuencias diferentes de rs7560488 en GC en el rango de edad & gt; 60 años frente a ≤ 60 años (p = 0,756), y varón contra hembra (P = 0,459) (tabla 3)
.
individuos menores de 60 años de edad eran más susceptibles al cáncer gástrico con tagSNP rs7560488 variante T & gt; C
la edad y el sexo fueron factores importantes en la carcinogénesis de tumores, incluyendo el cáncer gástrico. Cuando los análisis se estratificó por la edad y el sexo de los pacientes, se encontró que no se observó asociación significativa, los individuos portadores de genotipos TC /CC se asociaron con la susceptibilidad genética a GC, tanto en el grupo masculino y femenino. Por lo tanto, rs7560488 alelo C fue un aumento significativo del factor de riesgo en comparación con el alelo T (Tabla 4). Una mayor estratificación evaluó la asociación de rs7560488 T & gt; C con cáncer gástrico en diferentes edades. genotipos TC /CC se asociaron con la susceptibilidad genética a la GC en el rango de edad ≤ 60 años (OR = 1,794, IC del 95% = 1,118-2,877; p = 0,015) que no sean mayores de 60 años, de manera similar, también se observó que el C las frecuencias de alelos fue estadísticamente significativamente mayor que los controles (OR = 1,720; IC del 95% = 1.127-2.622; P = 0,011). Estos resultados sugieren que los genotipos CT y CC se asociaron con la susceptibilidad genética a la GC, particularmente en individuos no más de 60 años (Tabla 4) guía empresas
El rs7560488 T & gt; C. Afecta a la variante DNMT3A1 la actividad transcripcional
Para evaluar el efecto biológico funcional del polimorfismo rs7560488 en la transcripción DNMT3A1, se construyeron vectores indicadores de luciferasa (pGL3), que abarca la base de 4389823 a 4.390.770 de
DNMT3A1
promotor, ya sea de tipo salvaje (T alelo) o de tipo mutante (alelo C) y los transfectados en BGC-823, las células AGS (Figura 3A). Como se muestra en la Fig. 3B, se encontró que la actividad de transcripción del alelo T fue mayor que el alelo C con un aproximado de 2 veces en más de dos líneas celulares, lo que sugiere que rs7560488 alelo T se desempeñaba como defensor para el cáncer gástrico mediante el aumento de la transcripción de
DNMT3A1
.
(a) representación esquemática de plásmidos informadores que contienen el alelo C rs7560488 T o rs7560488, que se insertó aguas arriba del gen informador de luciferasa en el plásmido pGL3 básico. (B) Las dos construcciones se transfectaron transitoriamente en las células AGS y BGC-823, respectivamente. La actividad de la luciferasa de cada construcción se normalizó contra el control interno de la luciferasa de Renilla. Columnas significan partir de tres experimentos independientes; bares, Dakota del Sur. *, P & lt; 0,01 en comparación con la contraparte constructo
El rs7560488 T & gt;. C Variant Atenúa factor de transcripción Affinity
A la vista de rs7560488 tagSNP se encuentra en el
DNMT3A1
región promotora; la hipótesis de que podría alterar la unión del factor de transcripción (TF). De hecho, utilizando el algoritmo de búsqueda TF-(www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), predijo que rs7560488 T crea un sitio de unión para TF AP-1. Para determinar si este polimorfismo tiene un efecto en la capacidad del factor de transcripción vinculante, se realizó el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) para analizar la unión de sondas de oligonucleótidos que contienen T o C alelo a las proteínas nucleares extraídos de la célula AGS. Como se muestra en la Fig. 4A, una específica cambió de ADN /banda de complejo de proteína nuclear fue generada por ambos C y T sondas alelo (Fig. 4 A carriles 2, 5). Sin embargo, el alelo T todavía no han sido completamente inhibida competitivamente (Fig. Carril 4A 4), aunque la banda cambió fue abolida por 50 veces sondas C no marcados (Fig. 4A carril 1), lo que sugiere que la actividad de unión de la secuencia que contiene rs7560488 T alelo era más fuerte en comparación con el alelo C y el factor de transcripción preferentemente podría unirse al alelo T en lugar de C alelo. Por otra parte, super-EMSA usando AP-1 anticuerpo no causó un supershift de la sonda /proteína nuclear marcado con biotina (Fig. 4 B carril 2, 5), indicando que el AP-1 no puede el factor de transcripción que se une a la región promotora que contiene el alelo T o C. Estos resultados indicaron que rs7560488 C alelo podría disminuir la actividad de unión de proteína nuclear aunque el impacto no se ve afectada por el factor de transcripción AP-1.
(A) las proteínas nucleares actividad de unión de los diferentes alelos del polimorfismo rs7560488 DNMT3A1. sondas con biotina (60 fmol) se incubaron con extractos nucleares de células BGC-823. En experimentos de competición, el exceso molar de 50 veces de sondas T o C no marcados se utilizaron para demostrar la especificidad de cada reacción de unión. (B) El ensayo súper turno llevó a cabo utilizando 20 ng de anti-AP-1 anticuerpo (carril 2, 5).
Asociación entre DNMT3A1rs7560488 polimorfismo y los niveles de expresión de
DNMT3A1
ARNm
Cuarenta y cuatro tejidos de cáncer gástrico con diferentes genotipos de rs7560488 DNMT3A1 estaban disponibles en nuestro presente estudio. Debido a la baja frecuencia del genotipo CC, hemos añadido en las muestras con genotipo TC para el análisis. Como se muestra en la Fig. 5, los niveles de expresión de ARNm DNMT3A1 fue menor en los individuos con el genotipo CT o CC que en aquellos con el genotipo TT (P & lt; 0,05).
TT en comparación con los genotipos CT /CC
Discusión
todo el genoma hipometilación y la hipermetilación del promotor son características de una gran variedad de tipos de cáncer que contribuyen a la tumorigénesis y la metilación del ADN juega un papel clave en la regulación de la expresión génica y el mantenimiento de la estabilidad genómica [21], [22]. La metilación del ADN es realizada por metiltransferasas de ADN (DNMTs)
DNMT1
,
DNMT3B
y
DNMT3A
[23], [24]. El
de novo methyltransferases
DNMT3A ¿Cuáles son altamente expresado durante el desarrollo embrionario temprano y las reguladas en las células somáticas diferenciadas más [25]. El papel de los
DNMT3A
en el cáncer humano se destacó por los informes de
DNMT3A
mutaciones en aproximadamente el 20% de los pacientes con leucemia mieloide aguda [26], [27]. La aparición de estas mutaciones correlacionadas con una reducción de la actividad enzimática y regiones genómicas con una disminución de la metilación.
DNMT3A
mutaciones se identificaron también en el 8% de los pacientes con síndrome mielodisplásico [28].
DNMT3A
también juega un papel fundamental en el silenciamiento epigenético de células madre hematopoyéticas (HSC) genes reguladores y permitiendo la diferenciación eficiente [29].
El
DNMT3A
locus genómico produce dos transcripciones que dan lugar a dos proteínas, la más larga
DNMT3A1
y la más corta
DNMT3A2
, que se diferencian en que un amino-219 aminoácidos (N) -terminal cola está presente sólo en
DNMT3A1
[30], [31]. El dominio N-terminal de
DNMT3A1
se llama un dominio "regulador", ya que no posee actividad ADN metiltransferasa enzimática. Este dominio no comparte homología significativa con ninguna otra proteína conocida.
DNMT3A1
se concentra en la heterocromatina, que se considera que es transcripcionalmente silencioso, y funciona principalmente como una represión transcripcional [30]. Sin embargo, otra investigación mostró que
DNMT3A1
fue reclutado de manera eficiente a la Oct3 /4 y activado silenciados vitronectina (VTN) promotores de genes a través de su dominio único N-terminal [32].
Se ha reportado que las variaciones genéticas en el
DNMT3A
gen contribuyen a la carcinogénesis asociada especialmente con GC [15], [33] - [36]. A continuación, se propone una mayor exploración de la relación entre los SNPs y la regulación de traducción de sus genes diana. Pero, la determinación de la función biológica para cada SNP requiere a menudo, los experimentos de biología molecular que requieren mucho tiempo. Por lo tanto, el análisis de los grandes números de SNPs vinculados a cualquier locus determinado en la práctica requiere una evaluación sistemática de la bioinformática y la priorización de reducir el conjunto de candidatos probables variantes funcionales. Dado que la mayoría de los SNPs están en LD, se consideran los estudios de asociación basados en haplotipos más potente que el único análisis de SNP para identificar variantes genéticas causales que subyacen a la etiología de las enfermedades complejas como el cáncer [37], por otra parte, el uso de tagSNPs que captura la mayor parte de la diversidad haplotypic en estudios de asociación se ha sugerido [38]. Aunque GWAS ha producido numerosos SNPs o tagSNPs significativamente asociados con el cáncer, la mayoría de los tagSNPs se encuentran en regiones no codificante de proteínas (regiones intrón y intergénicas), la identificación de sus variantes funcionales y /o causales tiene una importante limitación de la interpretación de los datos GWAS a pesar de la asignación de funciones putativo a muchos otros GWAS tagSNPs sólo ha tenido éxito cuando mapeo fino alrededor de una región de riesgo conocido se realizó [39] - [41].
En el presente estudio, se seleccionaron un putativo rs7560488 tagSNP funcional que puede representan SNPs de la
DNMT3A1
promotor con alto desequilibrio de ligamiento, es posible identificar la variación genética sin genotipado de SNP en todos los
DNMT3A1
región promotora y mejorar la eficiencia de la asociación. Se observó que los sujetos que llevan tagSNP genotipos rs7560488 TT expuestas reducen significativamente el riesgo de cáncer gástrico en comparación con los individuos con TC o genotipo CC, lo que indica que el alelo T es un efecto protector potencialmente exhibida por esta tagSNP. Por otra parte, los ensayos que hemos realizado siempre una prueba más que demuestra que el TC y CC genotipo asociado con la disminución de los niveles de expresión de
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ARNm en tejidos de cáncer gástrico, los resultados sugieren que el
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tagSNP rs7560488 T & gt ; C polimorfismo puede regular la expresión de
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y con ello contribuir a la susceptibilidad GC. Estos datos también indicaron que DNMT3A1 puede jugar un papel en la progresión del cáncer gástrico, pero este hallazgo deben ser confirmadas por un estudio de población más grande. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe y demuestra que el
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la transcripción está influenciada directamente por rs7560488 tagSNP funcionales de
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región promotora y la tagSNP rs7560488T & gt; C se asoció con un aumento significativo riesgo de GC. A continuación, se realizó un experimento EMSA para analizar las consecuencias biológicas del polimorfismo rs7560488 tagSNP en las células BGC-823. Tanto el alelo T y las sondas alelo C mostraron dos bandas de gel de desplazamiento de, pero los experimentos de competición mostraron la afinidad de unión a las proteínas nucleares de la variante de sonda alelo T fue mayor que la observada con la contraparte sonda alelo C. Así la capacidad de alelo T de unión a ADN de proteína mejorada puede ser responsable de la mayor
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la actividad del promotor que hemos observado en nuestros ensayos de promotor. experimento Super-EMSA utiliza anticuerpos AP-1 no consiguieron un cambio super-gel indicó que factores de transcripción AP-1 no puede implicar en la formación de complejos de transcripción en el sitio de rs7560488 tagSNP. Otro resultado novedoso viene de la asociación entre la edad y rs7560488 T & gt; C polimorfismo en el análisis estratificado a entender que menos de 60 años de edad eran más susceptibles al cáncer gástrico con rs7560488 tagSNP T & gt; C. Es probable que
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afecta a la transcripción de genes específicos especialmente y cambios en ciertos genes aumentan el riesgo de GC. Esos resultados también muestran que el factor de riesgo más fuerte para GC es rs7560488 tagSNP T & gt; C, especialmente en edad temprana
En su conjunto, este estudio proporciona la primera visión mecanicista de cómo esta novela funcionales rs7560488 tagSNP T & gt;. Variante C se asocia significativamente con el riesgo de cáncer gástrico en una población china. Se encontró que la T al cambio C altera sustancialmente la actividad transcripcional de
Se debe determinar aún DNMT3A1
genes a través de influir en la unión de algunos factores de transcripción y por lo tanto a cambiar el nivel de expresión DNMT3A1, aunque unos factores de transcripción definidas. Nuestros resultados proporcionan una idea de que
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promotor rs7560488 T & gt;. Variante C es un prometedor biomarcador para evaluar la población susceptible de GC y proporcionar información valiosa a la investigación futura en la patogénesis del cáncer gástrico
Agradecimientos
agradecemos al profesor Wang Yaping, el Dr. Cai Zhenming, Lili Cao (Universidad de Nanjing, Nanjing, china) y Zhenghao Zhang (Universidad del Sureste, Nanjing, china) para el genotipado gestión de recursos humanos.