Extracto
Propósito
NCIC Clinical Trials Group PA.3 fue un ensayo controlado aleatorizado que demuestra la mejora de la supervivencia global (SG) en pacientes que recibieron erlotinib, además de gemcitabina para localmente avanzado o metastásico cáncer de páncreas. Antes de la terapia, los pacientes habían dibujado las muestras de plasma para estudios futuros. Hemos tratado de identificar biomarcadores dentro de estas muestras.
Diseño Experimental
Usando el ensayo de ligamiento por proximidad (PLA), un panel de la sonda se construyó a partir de anticuerpos disponibles comercialmente durante 35 proteínas claves seleccionadas de una genética mundial análisis de los cánceres de páncreas, y se usa para cuantificar los niveles de proteína en 20 uL de plasma del paciente. Para determinar si se utilizaron cualquiera de estos niveles de proteínas asociadas de forma independiente con el sistema operativo, y modelos de Cox univariante mulitbaraible. Además, se examinaron las asociaciones entre la expresión de biomarcadores y el estadio de la enfermedad al momento del diagnóstico mediante la prueba exacta de Fisher. La correlación entre la sensibilidad a erlotinib y cada uno de los biomarcadores se evaluó mediante una prueba de interacción entre el tratamiento y biomarcadores.
Resultados y Conclusiones
De los 569 pacientes elegibles, 480 tuvieron muestras disponibles para el estudio. Las muestras fueron asignados al azar en la formación (251) y conjuntos de validación (229). Entre todos los pacientes, los niveles elevados de interleucina-8 (IL-8), antígeno carcinoembrionario (CEA), el factor inducible por hipoxia 1-alfa (HIF-1 alfa), y la interleucina-6 se asociaron de forma independiente con el OS inferior, mientras que la IL 8, CEA, derivado de plaquetas receptor alfa del factor de crecimiento y mucina-1 se asociaron con la enfermedad metastásica. Los pacientes con niveles elevados de receptor de la tirosina-quinasa de proteína erbB-2 expresión (HER2) habían mejorado OS cuando son tratados con erlotinib en comparación con placebo. En conclusión, el PLA es una herramienta poderosa para la identificación de biomarcadores de suero, muestras de pequeño volumen archivados. Estos datos pueden ser útiles para estratificar los resultados de los pacientes, independientemente de la intervención terapéutica
Registro de prueba gratis
ClinicalTrials.gov NCT00040183
Visto:. Shultz DB, Pai J, W Chiu, Ng K, Hellendag MG, Heestand G, et al. (2016) Un panel de biomarcadores novela El examen de la respuesta a la gemcitabina con o sin erlotinib para la terapia del cáncer pancreático en el NCIC Clinical Trials Group PA.3. PLoS ONE 11 (1): e0147995. doi: 10.1371 /journal.pone.0147995
Editor: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
Recibido: 24 Septiembre, 2015; Aceptado 10 de enero de 2016; Publicado: 25 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Shultz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante están disponibles en el apoyo de sus archivos de información en papel y los datos
Financiación:. los fondos para este estudio fue proporcionado por Mis puntos azules y el Fondo Memorial Ng Sydney. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y los autores de este manuscrito han de competir el siguiente intereses: GH ha servido como consultor de Bayer, Merrimack, y Genomic Health. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDCA) es una neoplasia agresiva con un mal pronóstico. Los pacientes diagnosticados con tumores resecables son potencialmente curable, sin embargo localmente avanzado (LA) o metastásico PDCA es siempre mortal. [1, 2] Se necesitan biomarcadores mejoradas para perfeccionar el manejo terapéutico de PDCA avanzada y mejorar los resultados.
Validado biomarcadores de pronóstico para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDCA) son limitados. CA 19-9, el biomarcador más establecido para PDCA, tiene una sensibilidad y especificidad para el cáncer de páncreas de aproximadamente 80% y 90%, respectivamente [3] y en algunos escenarios niveles son predictivos de quimioterapia o radiación respuestas [4, 5]. Sin embargo, CA 19-9 puede ser falsamente elevada en pacientes con enfermedad obstructiva del hígado o pancreatitis, y falsamente negativa en los pacientes que carecen de Lewis-antígeno glicosiltransferasa (5-10% de la población). Además, los niveles de CA 19-9 proporcionan visión limitada de las funciones biológicas de PDCA que podrían dirigir la terapia sistémica. Por lo tanto, se necesitan mejores biomarcadores para guiar la atención al paciente.
PA.3 fue un ensayo aleatorizado de fase III realizado por el Grupo de Ensayos Clínicos del NCIC que demostró una mejor supervivencia en los pacientes tratados con erlotinib más gemcitabina frente a gemcitabina sola, en que, la expresión de EGFR no fue predictivo de una respuesta a erlotinib [6]. En este estudio, en el pre-tratamiento de muestras de plasma de pacientes inscritos en PA.3, hemos tratado de identificar biomarcadores que estaban pronóstico de supervivencia, así como predictivo de respuesta a erlotinib.
Métodos
Las muestras de plasma se obtuvieron de 480 de 569 pacientes incluidos en los ensayos clínicos del NCIC grupo (CTG) PA.3 (Clinical.Trials.gov identificador NCT00040183), una doble ciego internacional, ensayo de fase III de erlotinib (235) versus placebo más gemcitabina (245) pacientes con adenocarcinoma de páncreas localmente avanzado o metastásico [6]. Las muestras fueron obtenidas en el momento de la inscripción. El punto final primario de este ensayo fue la SG. El estudio descrito en este manuscrito fue aprobado por la Oficina de Cumplimiento de Investigación de Stanford: IRB#5136 (protocolo 27492). En el momento de la inscripción en un PA.3, se obtuvo el consentimiento informado por escrito del paciente y, en virtud de la aprobación de nuestra propia oficina de cumplimiento de la investigación, no obtuvimos independiente informado por escrito o el consentimiento verbal de los pacientes de nuestro estudio.
Antes para análisis de laboratorio, las muestras fueron asignados aleatoriamente a una formación (251 total 129 erlotinib recibido) o una validación (229 total 106 erlotinib recibidos) cohorte. El ensayo de ligamiento por proximidad (PLA) [7] se utilizó para medir la concentración relativa de 35 proteínas de biomarcadores (Tabla 1). En resumen, se añadieron PLA sonda fija al suero bloqueado y se incubaron a 37 ° C durante dos horas. A continuación, se añadieron férulas ssDNA con ligasa robóticamente (Velocity11, Agilent Technologies) y se incubaron a 30 ° C durante 15 minutos. Finalmente, se añadió uracilo-ADN Escisión Mix (Epicentre), y el ADN resultante se amplificó utilizando PCR con Platinum Taq (Invitrogen) y el producto de la PCR entonces fue amplificado con iTaq con SYBR (Bio-Rad) utilizando PCR cuantitativa (Modelo 7500, Applied Biosystems) para determinar las concentraciones relativas de cada biomarcador potencial.
sondas de biomarcadores fueron desarrollados para los estudios anteriores y otros adicionales fueron sintetizados para este estudio. [7, 8] se identificaron biomarcadores potenciales a través de un mundial análisis genético [9] y consistió en una búsqueda bibliográfica exhaustiva para identificar conjuntos de datos publicados, seguido de una evaluación de si los biomarcadores potenciales fueron expresados ya sea en la superficie de la célula o en el plasma, y por último, si los biomarcadores fueron elevados específicamente en el cáncer de páncreas en comparación con pancreatitis crónica . De los candidatos potenciales identificados en esa publicación, 320 fueron confirmados para ser excretados y presente en niveles elevados en el suero de los pacientes. A continuación, se obtuvo un conjunto de datos de análisis de expresión génica en el adenocarcinoma ductal pancreático de la expresión de genes de Omnibus [10, 11] y después de la identificación de los niveles de expresión génica de los 320 supuestos biomarcadores de cáncer de páncreas descritos anteriormente, se utilizó una k-means clustering de identificar separadas 13 subcategorías. De cada uno de estos, se seleccionaron 5 biomarcadores para ser incluido en nuestro panel, para un total de 65 sondas. Varios biomarcadores adicionales fueron identificados por búsqueda en la literatura directa. Debido a que los anticuerpos disponibles comercialmente para muchos de los biomarcadores identificados no estaban disponibles, menos de la mitad de las sondas potenciales PLA fueron construidos (Tabla 1).
niveles de biomarcadores se dicotomizaron en categorías altas y bajas en función de si eran mayores que la mediana. A continuación se probó para una asociación estadísticamente significativa con la supervivencia global (SG), tanto en la formación y las cohortes de validación utilizando modelos de regresión de Cox. Edad (& lt; 70 vs ≥70), el sexo (femenino versus masculino), raza (blanca frente a no-blanco), el estado funcional ECOG (0-1 vs 2), la intensidad del dolor (≤20 vs. & gt; 20), y el estadio de la enfermedad (III vs IV) fueron otras variables incluidas en los modelos de regresión multivariable. Cada biomarcador se analizó de forma individual utilizando los modelos de Cox que incluye el mismo conjunto de covariables mencionadas anteriormente. En un análisis separado, se examinó si la expresión de biomarcadores (por encima o no por encima de la mediana) se asoció con la etapa de la enfermedad. Los biomarcadores cuya expresión se asoció significativamente con el estadio se determinó mediante la prueba exacta de Fisher. Por último, para cada biomarcador, hemos probado su efecto en la predicción de la supervivencia mejorada debido a erlotinib utilizando un modelo de Cox multivariable que incluye un término adicional de la interacción entre el tratamiento (erlotinib frente a placebo) y el nivel de expresión de biomarcador binario.
resultados
las proteínas cuyas concentraciones, después dicotómico basado en ser mayor que la mediana, asociado de forma significativa (p & lt; 0,05) con sistema operativo, tanto en la formación y la validación de cohorte en el análisis univariable o multivariable se presentan en la figura 1A y 1B, respectivamente . Los resultados mostrados son para los pacientes en la cohorte de validación. Como se muestra, en el análisis multivariable, alta interleucina 8 niveles (IL-8) se asocia a peor supervivencia en ambos grupos de tratamiento, mientras que una mayor antígeno carcinoembrionario (CEA) y la hipoxia inducida por el factor 1 alfa niveles (HIF-1 alfa) se asociaron con una peor supervivencia en los pacientes tratados con erlotinib. Los resultados completos están disponibles en los cuadros S1 y S2
Las razones de riesgo (HR) (de mayor a menor concentración de biomarcadores) y los valores de p se muestran para los biomarcadores que se asociaron significativamente (p & lt; 0,05). con la supervivencia. Los resultados mostrados son de las cohortes de validación.
El veinticuatro por ciento de los pacientes incluidos en PA.3 en estadio III (localmente avanzado) en lugar de la enfermedad metastásica (estadio IV). En un análisis separado, se examinó si o no la concentración de biomarcadores (mayor que la mediana) se asoció con la etapa (III vs IV). Significativamente más pacientes con alta IL-8, CEA, derivado de plaquetas factor de crecimiento alfa (PFGFRalpha), y la mucina 1 (MUC-1) los niveles tenían la enfermedad en estadio IV metastásico. (Fig 2). Los resultados mostrados son de la cohorte de validación
RUP y los valores de p se muestran para los biomarcadores que se asociaron significativamente (p & lt; 0,05).. Los resultados mostrados son de la cohorte de validación.
Por último, hemos tratado de identificar biomarcadores que predicen una respuesta a la terapia midiendo el efecto de la interacción entre el tratamiento con erlotinib, el nivel de biomarcador, y OS. En un análisis multivariable, donde los niveles de biomarcadores se analizaron por ser mayor o menor que la mediana, ninguno se asociaron significativamente con la respuesta erlotinib tanto en la formación y conjuntos de validación. Sin embargo, cuando el nivel de cada marcador se examinó como una variable continua y las limitaciones estadísticas fueron relajados a p & lt; 0,1 para el conjunto de entrenamiento y p & lt; 0,05 en el conjunto de validación, el receptor de la tirosina-proteína quinasa erbB-2 (HER2) por sí sola era identificado como teniendo un efecto de interacción significativa con la respuesta erlotinib (HR para la interacción 0,95; IC del 95%: 0,72 a 1,26; p = 0,08 en la cohorte de formación y 0,7; IC 95% 0,5 a 0,99, p = 0,004 en el grupo de validación). En la cohorte de validación, los pacientes con HER2 encima de la mediana de supervivencia han mejorado durante el tratamiento con erlotinib (mediana de SG 8.2 vs. 5 meses, HR 0,36, IC del 95%: 0,21-0,63, p & lt; 0,0001), mientras que no hubo diferencias significativas entre erlotinib y placebo fue de encontrado de pacientes con HER2 2 niveles inferiores a la mediana (mediana de SG 6,0 frente a 8,3 meses, CRI 1,28; IC del 95%: 0,8 a 2,1; p = 0,3) (figura 3).
la supervivencia global media (con 95 CI%) se mejoró con el tratamiento erlotnib en pacientes con niveles más altos de la mediana de HER2 plasma (8.2 vs. 5.0 meses) pero no en pacientes con plasma inferior HER2 (6.0 vs. 8.3 meses).
discusión
NCIC CTG PA.3 probó su hipótesis de que erlotinib más gemcitabina resultado una mejora en la SG en comparación con la gemcitabina sola para PDCA localmente avanzado o metastásico, sin embargo, la mediana de SG en el grupo experimental y el control de armas difieren por sólo 0,3 meses (con un 6,2 frente a 5,9). Los objetivos de este estudio fueron identificar biomarcadores que estaban pronóstico en cualquiera de los brazos, correlativo al metastásico en comparación con enfermedad localmente avanzada o predictivo para la mejora de la supervivencia en los pacientes tratados con erlotinib frente a placebo cuando se añade a la gemcitabina.
El plasma proteínas cuyos niveles se asociaron con la supervivencia en nuestro estudio, la IL-6 [12], IL-8 [13], CEA [14], y HIF-1 alfa [15, 16], se han identificado previamente como pronóstico en localmente avanzado o cáncer de páncreas metastásico. HIF-1 alfa, un factor de transcripción esencial para la señalización de la hipoxia, no se secreta y es presumiblemente detectable en el plasma debido a la lisis tumoral. IL-6 [17] y la IL-8 [18], que puede ser secretada a partir de tejidos tumorales o del estroma, son proteínas de hipoxia inducida, lo que sugiere que el cáncer de páncreas puede propagarse a través de la señalización a través de HIF-1 alfa hipoxia, aunque su papel en la promoción de la enfermedad progresión no está claro. IL-8 y CEA también eran más propensos a ser elevados en pacientes con enfermedad metastásica, como lo fueron, MUC-1 y PDGFRalpha. Tales biomarcadores se podrían utilizar para identificar la enfermedad metastásica oculta en pacientes que entonces ser tratado de manera óptima con quimioterapia sistémica, omitiendo la terapia local agresiva. MUC-1 se sobreexpresa en los cánceres de páncreas y se ha demostrado asociarse con HIF-1 alfa para dirigir la expresión de oncogenes hipoxia inducida, incluyendo PDGF [19, 20], cuyos receptores, PDGFRalpha y PDGFRbeta regulan la migración celular PDCA y la metástasis [ ,,,0],21, 22].
HER2 fue identificado como un potencial predictivo de la capacidad de respuesta de erlotinib en nuestro estudio. Este es el primer ejemplo clínico para enlazar respuesta de la enfermedad a erlotinib con un biomarcador de la sangre. Recientemente,
HER2
ha demostrado ser amplificado en el 2% de los tumores de 469 PDCA no tratados previamente [23]. HER2 señalización, que es inhibida por erlotinib [24], ha sido blanco de HER2 + PDCA, evaluada por inmunohistoquímica, usando trastuzumab, en al menos 2 ensayos previos de fase II [25, 26], ninguno de los cuales mostraron resultados favorables en comparación con los resultados históricos . Se ha reconocido que la amplificación de HER2 debe ser verificada mediante FISH u otros métodos a diferencia de IHC por sí sola [27], lo que puede haber llevado a los ensayos negativos anteriores. Nuestra hipótesis es que el beneficio de supervivencia modesta de añadir erlotinib a la gemcitabina en el ensayo PA.3 puede haber sido mejorada mediante el uso de biomarcadores tales como HER2 para seleccionar a los pacientes con más probabilidades de responder a erlotinib.
CA 19-9 fue no identificado como un biomarcador de pronóstico en este estudio, a diferencia de los informes anteriores [28-31]. Una posibilidad para este resultado es que en el estudio actual, PLA se utilizó sólo para informar cantidades relativas de proteínas en este ensayo altamente multi-plexed. El análisis de CA 19-9 por un valor de la mediana de corte en lugar de una concentración de proteína absoluta puede haber afectado los resultados. Un estudio anterior utilizando PLA encontró que aunque los niveles de CA 19-9 eran 16 veces mayor en los pacientes pancreáticos en comparación con los controles normales, dentro de esta población de pacientes localmente avanzados, CA 19-9 tampoco no era pronóstico de los resultados. [8].
Nuestro estudio tiene varias limitaciones. Medimos un relativamente pequeño número de proteínas, y, no está claro que todas las sondas de PLA fueron capaces de detectar su objetivo con un rango dinámico suficiente. Debido a las muestras de tejido limitadas, nosotros no fuimos capaces de confirmar si los marcadores identificados fueron también expresaron sobre-en el tejido y, del mismo modo, debido a la disponibilidad limitada de muestras de plasma, no podemos verificar los resultados por otro método, como ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, la exactitud de PLA se ha verificado a través de ELISA en estudios previos, y los marcadores que fueron identificados en el presente estudio han sido implicados por otros como pronóstico para los resultados PDCA. Por último, el recientemente informó gran ensayo aleatorizado en cáncer de páncreas (LAP07 estudio) l no pudo confirmar el beneficio de erlotinib para PDCA, [32] destaca la necesidad de biomarcadores predictivos de erlotinib y otras terapias para el tratamiento de esta enfermedad maligna desafiante.
Conclusiones
se identificaron varios marcadores biológicos que se asociaron con la supervivencia y el estadio de la enfermedad en PDCA. Her2 también puede ser predictivo de la respuesta a erlotinib. son necesarios para confirmar estos resultados en un conjunto de datos independiente de estudios adicionales.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Los resultados de los análisis univariados y multivariados, para gemcitabina más placebo y gemcitabina más erlotinib cohortes, incluyendo validación y formación conjuntos, de la asociación entre los niveles de biomarcadores y la supervivencia
doi: 10.1371. /Journal.pone.0147995.s001 gratis ( DOCX)
Tabla S2. . Los detalles del análisis multivariable de los biomarcadores identificados como correlacionaron significativamente (P & lt; 0,05) para la supervivencia global (datos de muestras de validación) guía resultados mostrados indican la correlación de cada variable para la supervivencia: HR (IC) y el valor de p
doi: 10.1371 /journal.pone.0147995.s002 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Justin Bui para la revisión y el formato de este manuscrito. A.C. también reconoce el apoyo de mis puntos azules.