Extracto
Las células T reguladoras (Treg) juegan un papel esencial en el mantenimiento de la auto-tolerancia y la homeostasis inmune. A pesar de muchos estudios sobre la correlación entre la acumulación de células T reguladoras y la edad, o tumores malignos, el mecanismo relacionado no ha sido bien estudiado. Para averiguar el mecanismo de la acumulación de células T reguladoras en el cáncer de vejiga urinaria de edad, se analizó el nuevo gen de la senescencia celular
SENEX
y la expresión del ARNm del gen relevante en la apoptosis ordenados CD4 + CD25
hi células T reguladoras de donantes mayores de UBC, evaluada perfiles séricos de citoquinas relacionadas con la inmunopatología del tumor, y exploraron la relación entre el
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expresión, la expresión de genes de la apoptosis y la secreción de citoquinas. Después de haber silenciado por la expresión de genes SENEX con la interferencia de ARN, también se evaluó la apoptosis celular de células T reguladoras ordenados de pacientes mayores de UBC en respuesta a H
2O
2 mediada por el estrés. Nuestros datos indican que upregulated
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la expresión del ARNm en células T reguladoras de los pacientes mayores de UBC se correlacionó con la expresión de genes pro-apoptóticos y la concentración de citoquinas. Silenciando
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expresión génica aumento de la apoptosis celular y la expresión de genes pro-apoptótica de las células T reguladoras, en respuesta a H
2O
2 mediada por el estrés. Upregulated
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la expresión del ARNm junto con una disminución de la expresión de genes pro-apoptóticos y alteraciones en la síntesis de citoquinas puede contribuir a la proliferación de células T reguladoras y promover la tumorigénesis y metástasis. En general, la regulación positiva de genes senescencia celular
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, se asocia a la acumulación de células T reguladora en el cáncer de vejiga urinaria edad. Nuestro estudio proporciona una nueva visión de la comprensión de la acumulación de células T reguladoras periférica en tumores malignos de edad
Visto:. Chen T, H Wang, Zhang Z, Q Li, Yan K, Q Tao, et al. (2014) A Novel senescencia celular Gene,
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, está involucrado en Periférico Reguladora de las células T La acumulación en los envejecido cáncer de vejiga urinaria. PLoS ONE 9 (2): e87774. doi: 10.1371 /journal.pone.0087774
Editor: Pranela Rameshwar, Rutgers - Escuela de Medicina de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 3 de septiembre de 2013; Aceptado 30 de diciembre de 2013; Publicado: 5 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (artículo No. 81141104, Nº 81272259), y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Anhui (artículo No.11010402168). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
células T reguladoras (Treg) juegan un papel esencial en el mantenimiento de la auto-tolerancia y la homeostasis inmune mediante la supresión de una amplia variedad de respuestas inmunes fisiológicos y patológicos contra auto y no auto, así como antígenos tumorales cuasi auto [1 ], [2]. Reclutado a los tejidos tumorales, células T reguladoras expanda y se activa en los tejidos tumorales y en los ganglios linfáticos de drenaje, suprimir las respuestas inmunitarias antitumorales [3]. Se encuentra que la sangre periférica CD4 + CD25 + células T reguladoras se acumulan de manera espectacular en los seres humanos de edad sanos y roedores [4] - [5]. El aumento de la proporción Tregs contribuye a inmuno-supresión relacionada con la edad, aumenta la susceptibilidad a las enfermedades infecciosas y el cáncer [6]. Además, el aumento del número de células T reguladoras se han observado en pacientes con cáncer de vejiga urinaria (UBC), con la expresión de FoxP3 tumor, un marcador Tregs específicos, en correlación con el pronóstico clínico [7]. acumulación intratumoral de células T reguladoras también se han observado en el cáncer colorrectal, gliomas y carcinoma hepatocelular [8] - [10]. La supresión de la respuesta anti-tumor, se encuentran estos Tregs intratumorales acumulados estar relacionados con mal pronóstico [8] - [10]. A pesar de todos los esfuerzos de investigación anteriores, los mecanismos detallados no han sido bien dilucidado. Un estudio reciente acerca a la acumulación de células T reguladoras desde una nueva perspectiva, informando de que la apoptosis celular está implicado en la acumulación de células T reguladoras en el proceso de envejecimiento. Después de 24 horas en cultivo, las células T reguladoras de animales viejos murió significativamente menos en el transcurso de este ensayo que hizo Tregs de ratones jóvenes, lo que sugiere que las células T reguladoras de ratones de edad avanzada son más resistentes a la apoptosis [11]. Sin embargo, están aún por explorar los mecanismos que subyacen a su resistencia a la apoptosis en los seres humanos de edad avanzada, especialmente en pacientes con cáncer de edad avanzada.
Estudios recientes han puesto de manifiesto que regula positivamente la senescencia celular puede contribuir a la resistencia a la apoptosis de las células senescentes humanos. Una investigación ha realizado la identificación de un nuevo gen,
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, que regula la tensión inducida por vías de senescencia prematura (SIPS) en las células endoteliales (EC) [12]. Curiosamente, estas células senescentes inducidos por
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son resistentes a factor de necrosis tumoral (TNF-α) apoptosis inducida [12]. Además, bajo ciertas circunstancias, algunas células senescentes podría incluso cambiar sus fenotipos en linajes opuestas. mecanismo Novel revela que Tregs humanos podrían inducir la senescencia pero no la apoptosis en células T vírgenes y efectoras de respuesta [13]. Estas células T de respuesta senescentes células T reguladoras inducidas por cambiar sus fenotipos y los perfiles de citoquinas, y poseen una potente función de supresión. Gran atención se ha prestado recientemente a la senescencia celular, sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocido el papel potencial de la expresión génica en pacientes con cáncer senescencia de edad involucrados en la acumulación de células T reguladoras.
Para analizar la posible contribución de la senescencia y la apoptosis de genes de expresión para periférica Tregs acumulación en tumores malignos de edad, que en primer lugar ordenadas CD4 + CD25
hi células T reguladoras en los pacientes mayores de UBC, y luego examinó los niveles de transcripción de la expresión del ARNm de genes relevantes en ordenados CD4 + CD25
hi células T reguladoras. Además, se evaluaron los perfiles de citoquinas en suero relacionados con la inmunopatología tumor como evaluación indirecta de la función de células T. También se evaluó la relación entre el gen de senescencia
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la expresión del ARNm y la secreción de citoquinas. A continuación, se evaluó la apoptosis celular de células T reguladoras cultivadas a corto plazo de los pacientes con edades comprendidas entre UBC en respuesta a H
2O estrés mediada 2
después de
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la expresión génica fue silenciada con la interferencia de ARN. Nuestros datos proporcionado pruebas de que upregulated
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la expresión del ARNm en células T reguladoras de los pacientes mayores de UBC se correlacionaron con la concentración de citoquinas y la expresión de genes pro-apoptóticos. Silenciando
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expresión génica aumento de la apoptosis celular y la expresión de genes pro-apoptóticos en cultivos de células T reguladoras a corto plazo, en respuesta a H
2O
2 mediada por el estrés. Upregulated
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la expresión del ARNm junto con una disminución de la expresión de genes pro-apoptóticos y alteraciones en la síntesis de citoquinas puede dar cuenta de la proliferación de las células T reguladoras y promover la tumorigénesis y metástasis. En conclusión, nuestro estudio ofrece una nueva visión de la comprensión de la acumulación de células T reguladoras periférica en tumores malignos de edad.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los participantes firmaron una declaración escrita del informados consentimiento. Los procedimientos descritos en este estudio fueron aprobados por el comité de ética del Segundo Hospital de la Universidad Médica de Anhui.
Los pacientes y donantes sanos
La sangre periférica (PB) especímenes de 38 pacientes mayores de UBC (62 a 79 años de edad, con una media 70,13 años), 34 controles sanos de edad (60 a 74 años de edad, con una media 68,72 años) y 37 controles sanos jóvenes (22 a 56 años, con una media de 43,25 años) fueron examinados en el Segundo hospital de la Universidad médica de Anhui 2010-2013. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento contra el cáncer antes de ser inscrito. Concurrencia de enfermedad autoinmune, se excluyó virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sífilis para todas las personas inscritas. La estadificación clínica se realizó después de un examen radiológico preoperatorio y por parámetros clínicos en conjunción con el examen patológico de los especímenes de resección transuretral de acuerdo con la clasificación TNM de 1997 (Union Internationale Contre le Cancer).
Los anticuerpos y citometría de flujo
Los siguientes anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para antígenos de superficie humanos se adquirieron de Beckman Coulter-Immunotech (Marseille, Francia): ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpos anti-CD4 (13B8.2 clones); isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con anti-CD25 (clon B1.49.9); Peridinina clorofila Proteína-Cychrome5.5 (PERCP-Cy5.5) conjugado anti-CD127 (clon SK3); kit de reactivos tricolor para células T reguladoras que contienen de PE-conjugado anti-CD4, conjugado con FITC anti-CD25, y PERCP-Cy5.5-conjugado anti-127 (UCHT1, 13B8.2 y el clon B911); y su anticuerpo de control de isotipo. BU-Anexina V-FITC Kit Apoptosis Detección (Biouniquer Nanjing, China) se utilizaron para la evaluación de la apoptosis celular Treg. Las células fueron analizadas y clasificadas utilizando el flujo Coulter Epics XL (FCM) con el software del sistema II y COULTER EPICS ALTRA Sistema HyPerSortTM con Expo 32 multicomp Software (Beckman Coulter, Miami, FL, EE.UU.).
El examen de periféricos CD4 + CD25 + CD127
Las células bajas
Sobre se recogió 2-5 ml de PB. Todas las muestras se anticoagularon con heparina y se examinaron dentro de 4 h. Acerca de 100 l de sangre anticoagulada se incubó a 25 ° C durante 15 min con 5 ul conjugado con FITC-CD25 mAb específico, 5 ul conjugado con PE-CD4 mAb específico, 5 ul PerCP-Cy5.5-conjugado anti-127 mAB y sus correspondientes controles de isotipo. Después de la incubación, las células rojas de la sangre se lisaron y se lavaron en PBS dos veces. Las células teñidas se detectaron rápidamente mediante el sistema de FCM y analizados utilizando el software ii. Como se ha descrito anteriormente [14], la frecuencia de CD4 + CD25 + CD127
bajos Tregs se expresó como un porcentaje de células T CD4 + por gating secuencial sobre los linfocitos y las células T CD4 +.
Aislamiento de CD4 + CD25
se recogieron altos y CD4 + CD25 de las células
Acerca de 15-20 ml de PB para la clasificación de células. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron por separación de gradiente de densidad utilizando CAPPEL LSM de Separación de Linfocitos Medio (MP Biomedicals, Solon, OH). PBMCs aisladas se lavaron 3 veces con PBS. Aproximadamente 1 × 10
7 PBMCs eran superficie manchada con PE-conjugado anti-CD4 y conjugado con FITC anti-CD25. A continuación, se clasificaron las células CD4 + CD25
pilas de gran y CD4 + CD25 usando las puertas en un Becton-Contador de citometría de flujo de células clasificador (ALTRA HyPerSortTM del sistema). Como hemos descrito anteriormente [15], la pureza consistente de & gt; se obtuvo 93% para ambos CD4 + CD25
fracciones de células T y alta de células CD25 + CD4
Cultivo de células y tratamiento
La citometría de flujo ordenados CD4 + células t reguladoras y CD25high + CD25-CD4 Teffs se sembraron en placas de 24 pocillos (Wuxi Nido Biotecnología Co., Ltd, Wuxi, china), y se cultivaron en medio RPMI-1640 (Hyclone) que contiene 10% de SFB ( Gibco) y antibióticos durante 24 horas. Luego, las células se trataron con una concentración de subcytotoxic H
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2 (100 mM) durante 2 horas como un inductor de estrés. Todas las células se incubaron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera de la incubadora.
transfección siRNA
Ordenada CD4 + CD25
altas y CD4 + CD25 de las células de pacientes UBC de edad y donantes sanos fueron transfectadas con ARNsi utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La concentración final de ARNsi fue de 33 nM. Los dúplex de siRNA dirigidos a
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ARNm (las secuencias enumeradas en la Tabla 1) y el control de siRNA (secuencia codificada) fueron sintetizados por Invitrogen (Shanghai, China).
El examen de celular la apoptosis
la citometría de flujo ordenados CD4 + CD25
altos células t reguladoras CD4 + CD25 y Teffs fueron teñidas con anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC-anexina V) y yoduro de propidio (PI, Biouniquer, Nanjing, china) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron a continuación durante 15 min en la oscuridad antes de ser objeto de análisis en un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson).
cuantitativa en tiempo real el análisis de PCR
ARN total se aisló usando el kit RNeasy (Qiagen). El ADNc se sintetizó con el superíndice III (Invitrogen) kit de síntesis de la transcriptasa inversa. cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en las (Applied Biosystems) 7000 del sistema de PCR en tiempo real utilizando el Mesagreen qPCR Master Mix Plus para SYBR Ensayo (Takara). Los cebadores utilizados y sus secuencias se enumeran en la Tabla 1.
se recogieron
Suero Las citoquinas
Las muestras de suero de pacientes con UBC y controles sanos. La concentración de IL-2, IL-10, IL-17, se determinó el TNF-α y TGF-β usando kits de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (eBioscience) según las instrucciones del fabricante.
Estadística los análisis
el análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). La significación estadística de las diferencias se determinó mediante la no paramétrica de Mann-Whitney no apareado
T-test
y
t
test de Student paramétrica para muestras apareadas o no apareadas cuando sea apropiado. Las correlaciones se evaluaron mediante la prueba de coeficiente de Pearson. Las diferencias se consideraron significativas para valores de p inferior a 0,05.
Resultados y Discusión
aumentó notablemente CD4 + CD25 + CD127
Treg baja frecuencia y factor de transcripción FoxP3 mRNA expresión en pacientes de edad avanzada UBC
en vista del papel fundamental de la acumulación de células t reguladoras periférica en tumores malignos de edad, el CD4 + CD25 + CD127
de baja frecuencia Treg se examinó en la sangre periférica de pacientes con edades comprendidas entre UBC, controles sanos de edad y controles sanos jóvenes. De acuerdo con estudios previos, se observó un aumento en la frecuencia de Treg en ambos pacientes de UBC y controles sanos de edad, en comparación con los controles sanos jóvenes. Mientras tanto, la frecuencia de células T reguladoras fue significativamente mayor en los pacientes de edad UBC que en los controles de edad (Figura 1). Aumento de la frecuencia Tregs contribuye a la inmunosupresión relacionada con la edad, aumenta la incidencia de la infección y el cáncer, y hace que la morbilidad y la mortalidad en los ancianos [4] - [6]. Un estudio mostró un aclaramiento del tumor defectuoso dependiente de la edad, que se correlaciona con la elevación células T reguladoras [16]. Es importante destacar que, CD25-agotamiento llevó a aclaramiento del tumor, lo que sugiere que edad límite Tregs anti-tumor inmunidad [16].
frecuencia de Treg se detectó mediante citometría de flujo. Un aumento en las células CD4 + CD25 + 127
de baja frecuencia células T reguladoras (10,67 ± 0,58%) se observó en pacientes de edad avanzada UBC, en comparación con los controles sanos de edad avanzada (7,14 ± 0,41%) y controles sanos jóvenes (5,09 ± 0,37%). Expresado como la media ± desviación estándar, los datos se analizaron con la prueba t de Student paramétrico. ▴ vs. joven controles sanos, P & lt; 0,05; △ vs. Los controles sanos de edades, P & lt;.
0,05
El factor de transcripción FoxP3 juega un papel vital en el mantenimiento de la auto-tolerancia y la alta expresión de FoxP3 se requiere para la función supresora de las células T reguladoras CD4 + humano [17] - [19]. En este estudio, se examinó la expresión de FoxP3 mRNA en ambos pacientes de UBC e individuos sanos. Como era de esperar, los niveles de ARNm de FoxP3 aumentaron significativamente en las células CD4 + CD25
hi Tregs ordenados de pacientes de la UBC y controles sanos de edad, en comparación con los controles sanos jóvenes. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la expresión FoxP3 mRNA entre Tregs de pacientes de la UBC y controles sanos de edad (Figura 2). La discrepancia entre la frecuencia de células T reguladoras y la expresión de Foxp3 mRNA puede haber sido causado por las diferencias funcionales, ya que estudios previos que desmostrarse FoxP3 + células T en humanos son funcionalmente heterogéneas [1]. Aumentó la expresión de FoxP3 mRNA, junto con el aumento de la frecuencia células T reguladoras, puede aumentar tumores escapan, la supresión inmune y conducir a la remoción del tumor ineficaces en pacientes mayores de UBC.
Tregs fueron ordenados por FACS, nivel de FoxP3 mRNA se detectó mediante real PCR cuantitativa en tiempo. FoxP3 expresión de ARNm se incrementó en células T reguladoras tanto de los pacientes de edad avanzada (UBC 2
- △△ CT = 0,0272 ± 0,0081) y envejecido controles sanos (0,0184 ± 0,0059) en comparación con los controles sanos jóvenes (0,0097 ± 0,0039) (p = 0,035 , 0,021 respectivamente). No se detectaron diferencias en la expresión de FoxP3 Tregs ARNm entre los pacientes de edad avanzada UBC y controles sanos de edades. Expresado como la media ± desviación estándar, la fecha se analizaron con la prueba de Mann-Whitney
T-test
. ▴ vs células T reguladoras ordenados de controles sanos jóvenes, P & lt;. 0,05
Upregulated
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expresión de ARNm y regulación a la baja de la Expresión Génica de
P53
,
P16
,
P21
y
la caspasa-3 Hoteles en células CD4 + CD25
hi células t reguladoras de pacientes de edad avanzada UBC
para evaluar la contribución potencial a la acumulación de células t reguladoras periférica,
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la expresión de ARNm de células CD4 + CD25
hi células CD4 + CD25-T efectoras (células T reguladoras teff) y se examinó. Aumento significativo de la
se detectó SENEX
la expresión del ARNm en células CD4 + CD25
hi células T reguladoras en comparación con CD4 + CD25 Teffs en pacientes mayores de UBC, y este aumento no se observó en otros grupos. Mientras tanto,
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la expresión de ARNm de células T reguladoras en los pacientes de edad fue UBC signicativamente superiores a los de los controles sanos edad y jóvenes (Figura 3). Además, los niveles de ARNm de gen regulador de la apoptosis de la caspasa-3, P53, P16 y P21 (2
- △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 y 2415,85 ± 863,72, respectivamente) se redujeron significativamente en CD4 + CD25
hi células T reguladoras se separa de los pacientes mayores de UBC, en comparación con las células CD4 + CD25 Teffs (Figura 4). No se detectaron diferencias significativas de la expresión del gen regulador de la apoptosis en las células CD4 + CD25
hi células T reguladoras se separa de los controles sanos edad y jóvenes, en comparación con Teffs.
Tregs fueron ordenados por FACS,
SENEX
nivel de mRNA fue detectado por PCR en tiempo real cuantitativa. Un aumento significativo en
se detectó SENEX
la expresión del ARNm en células CD4 + CD25
hi células T reguladoras (2
- △△ CT = 0,8532 ± 0,1078) en comparación con las células CD4 + CD25 Teffs (0.1564 ± 0.0731 ) en pacientes de edad avanzada UBC (
p = 0,027
), y este aumento no se observó en los otros grupos. Tregs
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la expresión de ARNm en pacientes UBC años de edad fue signicativamente superiores a los de los controles sanos de edad avanzada (0,0923 ± 0,0519) y controles sanos jóvenes (0.1455 ± 0.0792) (P & lt; 0,05 para cada uno de Mann-Whitney
T
-test). Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. ▴ vs. Teffs ordenadas a partir de pacientes de edad avanzada UBC, P & lt; 0,05; △ vs. Tregs en controles sanos de edad avanzada y los controles sanos joven, p. & Lt; 0,05
Tregs fueron ordenados por FACS, los niveles de mRNA fueron detectados por PCR en tiempo real cuantitativa. En envejecidos Patiens UBC, genes reguladores de la apoptosis caspasa-3, P53, P16 y P21 expresión de ARNm (2
- △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 y 2415,85 ± 863,72, respectivamente) se redujeron en células T reguladoras UBC pacientes de edad avanzada (
p Hotel & lt; 0,05 para cada uno de Mann-Whitney U Test). Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. ▴ vs. Teffs ordenadas sobre pacientes de UBC, P & lt;.
0,05
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gen se ha demostrado para proporcionar una función de controlador de acceso único en la SIPS y vías de la apoptosis en los CE [12 ]. Más de expresión de
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gen podría causar ECs senescencia, y estos
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inducida por las células senescentes fueron resistentes a factor de necrosis tumoral (TNF-α) inducida por apoptosis cuando ECs fueron expuestos a concentraciones de subcytotoxic H
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2. Además,
SENEX
sobreexpresión induce un aumento tanto en el ARNm y los niveles de proteína de p16 y hubo una disminución en la expresión de la proteína de la hiperfosforilada Rb. Estos resultados indican que
SENEX
activado el p16 /pRb vía [12]. Aunque el papel crítico de
SENEX
gen en la protección de las CE contra la apoptosis celular ha sido bien demostrado, la expresión de
SENEX
de genes en células T reguladoras sigue siendo desconocida. En el presente estudio,
fue encontrado SENEX
la expresión de ARNm de genes que se upregulated significativamente en periférica CD4 + CD25
hi células T reguladoras se separa de los pacientes mayores de UBC, en comparación con Teffs. El hasta reguladas
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gen puede jugar un papel similar de inducción de células T reguladoras senescenc y protegerlos de la apoptosis celular. Estudios anteriores han demostrado que la detención del crecimiento senescente se establece y mantiene por la p53 /p21 y /o p16 /supresores de tumores pRB vías [20] - [22]. Se sabe que la proteína p53 de tipo salvaje puede inducir apoptosis de las células [23]. Caspasa 3 es una proteasa cisteína efector aguas abajo en la vía apoptótica, y es considerado como uno de los principales ejecutores de la apoptosis [24]. gen P16 y P21 del gen pueden inhibir las quinasas dependientes de ciclina (CDK) e inducir la detención del ciclo celular en la fase G0-G1 [25] - [26]. Estamos motivado que las moléculas reguladoras del ciclo celular, incluyendo p53, p21, p16 y podría estar implicado en la acumulación de células T reguladoras en los pacientes mayores de UBC. Nuestros resultados indican que la expresión del gen regulador de la apoptosis
P53
,
P16
,
P21
y
La caspasa-3
, lo que podría promover la apoptosis celular, descrito anteriormente [23] - [26], en downregulated células T reguladoras de los pacientes mayores de UBC. El hasta reguladas
SENEX
gen junto con el gen de la pro-apoptótica abajo regulado puede conducir a la disminución de la apoptosis en células T reguladoras, y la acumulación de células T reguladoras en el desarrollo y progresión del cáncer de vejiga urinaria edad.
Mayor Los niveles de TGF-β1, IL-10, IL-17 y TNF-α concentración sérica y disminución de los niveles de IL-2 suero Concentración en envejecidas UBC pacientes
sérica
para obtener una evaluación indirecta para la función de las células T, evaluamos los perfiles de citoquinas relacionadas con inmunopatología tumor. En comparación con los controles sanos de edad y controles sanos jóvenes (
p Hotel & lt; 0,05 para cada prueba de la t), se produjo un evidente aumento de la concentración de IL-10 (13,03 ± 2,16 pg /ml), IL-17 ( 18,29 ± 3,45 pg /ml), TGF-β1 (16,22 ± 3,35 ng /ml) y TNF-α (25,18 ± 5,74 pg /ml) en el suero de los pacientes de la UBC de edad. Mientras tanto, hubo una disminución en la concentración sérica de IL-2 tanto en pacientes de UBC (165,29 ± 26,45 pg /ml) y controles sanos de edad (196,69 ± 32,38 pg /ml), como, en comparación con los controles sanos jóvenes (409,24 ± 90,81) . Sin embargo, no se observó diferencia estadísticamente significativa en la concentración de IL-2 en suero entre los pacientes mayores de UBC y controles sanos de edad (p = 0,243) (Figura 5).
expresan como la media ± desviación estándar, los datos fueron analizados con el la prueba t de Student paramétrica. ▴ vs controles sanos de edades y controles sanos joven, P & lt; 0,05; △ vs. Controles sanos jóvenes, P & lt;
.
Como la principal fuente de TGF-β1 y, las células T reguladoras inhiben la IL-10 en el mantenimiento de la auto-tolerancia y la homeostasis de las células T células T efectoras 0,05 principalmente a través de la producción de citoquinas, tales como TGF-β1 y IL-10 [27]. Este estudio muestra que las concentraciones séricas de TGF-β1 e IL-10 aumentaron significativamente en los pacientes mayores de UBC. Los niveles elevados de TGF-β1 y IL-10 sugieren que el Tregs acumulado en los pacientes de edad UBC puede poseer alta capacidad supresora, inhibir las respuestas inmunes antitumorales y promover tumor escape inmune. TNF-α es la citoquina proinflamatoria prototípico. Aunque se muestra originalmente para ser tóxica para las células tumorales en altas dosis, TNF-α se ha demostrado que tiene la función de promotor de tumores [28]. Del mismo modo, la citoquina IL-17, secretada por las células Th17, es generalmente preferible en la generación de inmunidad de células T anti-tumor, pero estos efectos son eclipsados por sus papeles en el crecimiento de tumores [29]. En el presente estudio, los altos niveles de TNF-α e IL-17 en pacientes de edad UBC pueden promover la tumorigénesis, como el estudio anterior había demostrado que podían promover la angiogénesis tumoral.
La interleucina-2 es producida principalmente por células T CD4 + células auxiliares y células T CD8 + en los órganos linfoides secundarios, y la producción de IL-2 se induce fuertemente después de la activación por el antígeno [30]. Capaz de activar múltiples subconjuntos de células inmunes, incluyendo células T, la interleucina-2 es esencial para el desarrollo, supervivencia y función de las células Treg [30] - [31]. disminución sustancial de la IL-2 con la edad se ha descrito, basado principalmente en ensayos ex vivo, en los que la producción de células T de IL-2 parece ser deficiente [6]. IL-2 actúa sobre las células que expresan bien la alta afinidad de IL-2R trimérica o el de baja afinidad dimérica de IL-2R. Los altos niveles de la trimeric IL-2R se expresan transitoriamente por las células CD4 + y CD8 + T siguiente células whileTreg activación TCR constitutivamente expresan altos niveles de IL-2R rimeric [30]. En nuestro estudio, se observó una evidente disminución de la IL-2 de concentración sérica tanto en pacientes de la UBC y controles sanos de edad avanzada. Las bajas concentraciones de IL-2 puede estimular preferentemente la proliferación de las células Treg a través de la alta afinidad trimérica IL-2R, y contribuyen a la acumulación de células T reguladoras periférica en la población anciana.
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expresión se correlacionado con P53, el TGF-β1 e IL-2 expresión en pacientes de edad avanzada UBC
además, exploramos la relación potencial entre la senescencia gen
SENEX
ARNm y perfiles de nivel de citoquinas en suero o ARNm del gen regulador de la apoptosis expresión . Utilizando el análisis de correlación de Pearson, nuestros datos indican que
SENEX
expresión de ARNm se correlacionó negativamente con la expresión del ARNm de p53 (p = 0,012) y la concentración de IL-2 (p = 0,026), mientras que una correlación positiva entre la
SENEX
la expresión de ARNm de TGF-β1 y la concentración (p = 0,001) fue descubierto en pacientes de edad avanzada UBC.
SENEX
la expresión génica se correlacionó negativamente con el
La expresión de p53
ARNm (Figura 6A), lo que implica que
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gen puede proporcionar su función especial por abajo de la regulación de la pro-apoptótica gen
P53
expresión. Por otra parte,
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la expresión génica se correlacionó positivamente con el nivel de TGF-β1 (Figura 6B), lo que sugiere que la expresión regulada en marcha de
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gen puede explicar la alta capacidad supresora de las células T reguladoras acumulada en pacientes de edad UBC. Por último,
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gen se correlacionó negativamente con la IL-2 concentración en suero (Figura 6C). La proliferación de las células T reguladoras puede altamente suprimir las células auxiliares T CD4 + y CD8 + células T, e inhibir la secreción de IL-2 en pacientes mayores de UBC.
El uso de la prueba el coeficiente de Pearson,
SENEX
expresión era una correlación negativa con (a) la expresión de mRNA P53 (coeficiente de correlación de Pearson = -0,405, p = 0,012) y (B) la concentración de IL-2 (coeficiente de correlación de Pearson = -0,362, p = 0,026) en pacientes de edad avanzada UBC. (C) La correlación positiva entre el
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expresión y la concentración de TGF-β1 (coeficiente de correlación de Pearson = 0,507, p = 0,001) fue descubierto por la prueba de coeficiente de Pearson.
El silenciamiento de Down
SENEX
expresión génica el aumento de células t reguladoras apoptosis en respuesta a H
2O
2-Stress in vitro mediada
Nuestros datos anteriores sugirieron que la expresión de los genes upregulated SENEX se correlacionó negativamente con el
P53
mRNA expresión en las células CD4 + CD25
altos células T reguladoras, lo que implicaba que
SENEX
gen puede inhibir la apoptosis celular Tregs al desregular la expresión de genes pro-apoptóticos. Para investigar si las células T reguladoras de pacientes con edades comprendidas entre UBC tienen una relación más baja de la apoptosis celular, CD4 + CD25
+ altos células T reguladoras y Teffs CD25 de las células CD4 se ordenaron, seguido por el análisis de citometría de flujo después de haber sido teñido con anexina V-FITC y PI. Anexina V se une específicamente a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de las células apoptóticas, mientras que PI puede penetrar en las células muertas y se intercala con ácido nucleico [32]. Nuestros datos informado de que las células T reguladoras de pacientes UBC edad tenían menos células apoptóticas (0,84 ± 0,34%) en comparación con Teffs (9.27 ± 3.66%) (Figura S1) Anexina V +. Esto es consistente con el estudio anterior [11], lo que sugiere que las células T reguladoras de pacientes con edades comprendidas entre UBC son más resistentes a la apoptosis.
Para estudiar más a fondo el papel potencial de
SENEX
de genes en células T reguladoras apoptosis en edad pacientes UBC, que silenciados por
SENEX
la expresión de genes con la interferencia de ARN en las células T reguladoras cultivadas a corto plazo en respuesta a H
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2 inducida por el estrés oxidativo. H
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2 es un conocido inductor de estrés oxidativo cuando se entrega en una dosis subcytotoxic [33]. En el presente estudio, ordenados CD4 + CD25
+ altos células T reguladoras y Teffs CD25 de las células CD4 fueron expuestos a concentraciones de subcytotoxic H
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2 (100 mM) durante 2 horas. Nuestros resultados indican que 100 M H
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2 aumento del tratamiento Anexina V + células apoptóticas en ambos CD4 + CD25
Tregs altas (11,2 ± 2,6%) y CD4 + CD25 Teffs (13,1 ± 4,3%), y no se observó diferencia significativa en H
2O
2 inducida por apoptosis celular entre células T reguladoras y Teffs. Silenciando abajo
SENEX
gen de siRNA transfección de la piscina durante 24 horas, follwed por 100 M H
2O
2 de tratamiento durante 2 horas, el aumento de Anexina V + células apoptóticas en las células CD4 + CD25
altos células T reguladoras ( 21,5 ± 3,4%), pero sometidos a los mismos procedimientos, no se encontraron células apoptóticas Anexina V + para aumentar en las células CD4 + CD25-Teffs (13,9 ± 3,1%) (Figura 7). Por otra parte, no se observó diferencia significativa en la apoptosis celular, tanto en células T reguladoras y Teffs cuando las células se trataron solamente con siRNA transfección sin H
2O
2 de tratamiento (Figura 7). Por otra parte, silenciando por células T reguladoras
SENEX
la expresión de genes condujo a la regulación positiva de genes pro-apoptóticos
P53
,
P16
,
P21
y
caspasa -3 expresión mRNA
en respuesta al estrés (Figura 8). La eficiencia de la transfección fue de 45 ± 7,2%, lo que fue confirmado por marcado con fluorescencia FAM-siRNA. Los
SENEX
tasa de inhibición de la expresión de ARNm era más del 90% en comparación con el ARN no codificante (ncRNA) (Figura S2).
Ordenada CD4 + CD25
altos Tregs fueron teñidas con anexina V FITC antes del análisis de citometría de flujo. apoptosis de células se detectan como Anexina V + células apoptóticas. 100 M H
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2 tratamiento durante 2 horas aumentó en apoptosis tanto en células T reguladoras (11,2 ± 2,6%) y Teffs (13,1 ± 4,3%), sin diferencia significativa observada en H
2O
2 apoptosis inducida por las células T reguladoras y entre Teffs. Silenciando abajo
SENEX
gen con la interferencia de ARN (ARNi) durante 24 horas, por follwed H
2O
2 de tratamiento durante 2 horas, el aumento de células apoptóticas en células T reguladoras (21,5 ± 3,4%), pero sometidos a la mismos procedimientos, las células apoptóticas no se ha encontrado para aumentar en Teffs (13,9 ± 3,1%). No se observó ninguna diferencia en la apoptosis celular entre células T reguladoras y Teffs cuando las células fueron tratadas con siRNA transfección solo.
niveles de ARNm de genes fueron detectados por PCR en tiempo real cuantitativa. Después de
SENEX
gen enmudeció durante 24 horas, seguido de H
2O
2 de tratamiento durante 2 horas, genes reguladores de la apoptosis
La caspasa-3
,
P53
,
P1 página 6 y
P21 expresión de ARNm
(2
- △△ CT = 6705,73 ± 1124,07, 253,08 ± 16,01, 154,58 ± 35,12 y 5135,79 ± 985,47, respectivamente) upregulated en las células CD4 + CD25
hi células T reguladoras (
p Hotel & lt; 0,05 para cada uno de Mann-Whitney U Test). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. ▴ vs H
2O
2 tratados con las células, p. & Lt; 0,05
estudio anterior demostró que
SENEX
gen contribuyeron a la resistencia a la apoptosis de las CE humana [ ,,,0],12]. En el presente estudio, silenciando abajo
SENEX
aumentó la expresión de genes células T reguladoras de la apoptosis en respuesta a H
2O
2 inducida por el estrés oxidativo.