Extracto
Antecedentes
KRAS, BRAF
y
PIK3CA
mutaciones se observan con frecuencia en el cáncer colorrectal (CCR). En particular,
KRAS
mutaciones son fuertes predictores de los resultados clínicos de tratamientos EGFR como cetuximab y panitumumab en cáncer colorrectal metastásico (CCRm). Para el análisis de mutación, los métodos actuales son mucho tiempo, y no fácilmente disponible para todos los oncólogos y patólogos. Hemos desarrollado un novedoso sistema simple, sensible y totalmente automatizado de diagnóstico molecular (AMDS) para el punto de atención de los ensayos (POCT). Aquí mostramos los resultados de un estudio de comparación entre AMDS y secuenciación directa (DS) en la detección de
KRAS, BRAF
y
PI3KCA
mutaciones somáticas.
Metodología /Principales Encontrar
ADN se extrajo de una rebanada de bien congelado (n = 89) o fijado con formalina y embebido en parafina de tejido (FFPE) CRC (n = 70), y luego se usa para el análisis de mutación por AMDS y DS . Todas las mutaciones (n = 41 entre congelado y 27 entre las muestras FFPE) detectados por DS fueron también con éxito (100%) detectados por el AMDS. Sin embargo, 8 muestras congeladas y 6 FFPE detectados como de tipo salvaje en el análisis DS se muestran como los mutantes en el análisis AMDS. Por ensayos de clonación de secuenciación, estas muestras discordantes se confirmaron como verdaderos mutantes. Una muestra tenía "punto caliente" mutaciones simultáneas de
KRAS
y
PIK3CA
, y el ensayo de clonación comfirmed que E542K y E545K no estaban en el mismo alelo. tarifas de llamadas de genotipado para DS fueron 100,0% (89/89) y 74,3% (52/70) de las muestras congeladas y FFPE, respectivamente, para el primer intento; mientras que la de AMDS fue 100,0% para ambos conjuntos de muestras. Para la extracción automatizada de ADN y detección de mutaciones por AMDS, tejidos congelados (n = 41) fueron detectados con éxito todas las mutaciones dentro de los 70 minutos.
Conclusiones /Importancia
AMDS tiene una sensibilidad superior y precisión sobre DS, y es mucho más fácil de ejecutar que mano de obra análisis de la mutación manual convencional. AMDS tiene un gran potencial para el equipo POCT para el análisis de la mutación
Visto:. Kitano S, Myers J, J Nakamura, Yamane A, Yamashita M, Nakayama H, et al. (2013) una novela completamente automática del sistema de diagnóstico molecular (AMDS) para el cáncer colorrectal Detección de la mutación. PLoS ONE 8 (5): e62989. doi: 10.1371 /journal.pone.0062989
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 8 de Enero, 2013; Aceptado: March 27, 2013; Publicado: 9 Mayo 2013
Derechos de Autor © 2013 Kitano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por la compañía de los autores (Toppan Printing CO., LTD.). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Esta investigación fue financiada por la compañía de los autores (IMPRESIÓN TOPPAN CO., LTD. ). Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El humano
KRAS
oncogén está mutado en más del 30% de CRC, y más de 3.000 mutaciones puntuales se han notificado hasta la fecha [1]. Las alteraciones más frecuentes se detectan en el codón 12 (~82% de todo el reportado
KRAS
mutaciones) y en el codón 13 (~ 17%), que son a la vez en el exón 2 de la
KRAS
gen [2] y parece jugar un papel importante en la progresión de la CRC [3].
BRAF
codifica una quinasa serina /thereonine que activa la vía RAS-MAPK, y su mutación se han encontrado en 4-15% de CRC.
PIK3CA
codifica la subunidad catalítica de p110 de PI3K alfa [4], y PIK3CA mutado estimula la vía de AKT y promueve el crecimiento celular en varios tipos de cáncer, incluyendo CRC [5].
PIK3CA
Se han descrito mutaciones en el 10% -30% de los CCR [6], y están asociados con
KRAS
mutación. Ha habido un informe que la presencia de mutaciones en
PIK3CA
,
KRAS
, o
Hoteles en BRAF CRC mostró peor resultado de los pacientes [7], y entre los pacientes que se someten a una resección curativa del CRC,
PIK3CA
mutación se asocia con una supervivencia específica del cáncer más corta [8]. Sin embargo, el efecto adverso de
PIK3CA
mutación puede ser potencialmente limitado a pacientes con
KRAS
tumores de tipo salvaje [8].
El cetuximab y panitumumab son factor de crecimiento epidérmico efectiva receptor (EGFR) dirigido agentes para el cáncer colorrectal metastásico (CCRm), pero los pacientes cuyos tumores tienen
KRAS mutaciones
excepto G13D generalmente se cree que no se benefician de estos agentes [10], [11] [9]. Por otra parte, las mutaciones en
BRAF
y
PIK3CA
también han sido reportados a afectar a la eficacia de los agentes EGFR [12], [13]. Teniendo en cuenta el importante valor de estas mutaciones en la predicción del resultado clínico en pacientes con CCRm, una técnica rápida, fiable y sensible detección simultánea de ellos sería esencial para la farmacoterapia informado. Hasta la fecha, aunque se han desarrollado muchas tecnologías, que están limitados por el procedimiento complicado, el alto costo, baja el rendimiento u otros problemas. Por ejemplo, la secuenciación de Sanger directa (DS) está actualmente siendo considerado como un estándar de oro para la detección de estas mutaciones. Sin embargo, el método de DS requiere múltiples pasos, que carece de una capacidad para el análisis automatizado. También tiene un largo alrededor de los tiempos vuelta y es en general relativamente caro en comparación con otros métodos. Otros métodos desarrollados recientemente, incluyendo las tecnologías relacionadas con la PCR [14] - [17], plataformas de secuenciación [18], [19] y otros métodos como la gestión de recursos humanos (análisis de fusión de alta resolución) [20] El análisis son más sensibles y convenientes que DS , sin embargo también son tiempo y laborioso [21], y no están disponibles para la mayoría de los médicos, a menudo requieren que la muestra de tumor se enviará a un laboratorio de referencia, resultando potencialmente retrasos en el tratamiento.
Hemos desarrollado un analizador genético totalmente automatizado AMDS que incluye procesos para la extracción de ADN /purificación, amplificación de ADN (PCR), detección de mutaciones por Invader® química [22], [23], y la interpretación del genotipo. AMDS puede llamar a un estado de mutación de forma automática en 70 minutos después de la adición de una muestra (
por ejemplo.,
Extrajo ADN o muestra de tejido homogeneizado genómico) para el cartucho. Aquí, se presenta un estudio de viabilidad de AMDS para detectar somática
KRAS
,
BRAF
y
PI3KCA
mutaciones en los tejidos de CRC en comparación con DS de forma doble ciego. En primer lugar, se evaluó la sensibilidad de la AMDS usando un ensayo de titulación con ADN plásmido construido artificialmente. a continuación, se llevó a cabo un estudio de rendimiento clínico para evaluar aún más la precisión, especificidad y sensibilidad del sistema en comparación con DS. Además, el análisis de clonación-secuenciación se llevó a cabo con el fin de validar el estado mutacional discordante entre AMDS y DS. La versatilidad del sistema en la detección de mutaciones a partir de tejidos con diferentes fijadores (fresco congelado y FFPE) también se evaluó. Además, hemos probado la capacidad del sistema en un modo totalmente automatizado: a partir de la extracción de ADN para la detección de mutaciones, utilizando una cantidad mínima (& gt; 1 mg) de tejido congelado CRC
Materiales y Métodos
.
plásmido ADN
las mutaciones dirigidas eran 7 mutaciones puntuales no sinónimas (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V y G13D) en el exón 2 de la
KRAS
gen, un sinónimo mutación puntual (V600E) en el exón 15 del
BRAF
gen y 5 mutaciones puntuales no sinónimas en el dominio helicoidal exón 9 (E542K, E545K, E545G) y el exón 20 dominio quinasa (H1047L, H1047R) del
PIK3CA
gen, todas las mutaciones comunes en CRC humano. Estos mutantes y tipos silvestres se amplificaron por PCR y se clonaron en el plásmido pCR®2.1 (Invitrogen, CA, EE.UU.), y las plantillas de mutantes y de tipo salvaje sintetizados se verificaron por secuenciación. La longitud de todo el ADN plásmido que incluye la secuencia diana 300 pb fue de 4,2 kb. Los ADN de plásmido sintetizados se suspendieron en tampón TE y se almacenaron a -20 ° C antes de su uso.
CRC Espécimen Sección
tejidos de CRC de secciones congeladas de muestras (n = 89) y secciones de muestras FFPE ( n = 70) utilizado en este estudio eran de la Human Tissue Resource Center de la Universidad de Chicago. Todas las muestras fueron diagnosticados como cáncer de colon o de recto por hematoxilina y eosina. Todos los tejidos fueron tejido primario CRC extirpado quirúrgicamente antes de otros tratamientos clínicos. Los tejidos se cortaron a un tamaño aproximado de 1.0 cm
2 × 10 micras por microtomo. Las muestras de sección en rodajas utilizadas para este estudio no se realizaron por microdisección manual (MMD). se requiere ninguna otra información, incluyendo datos demográficos y clínicos para estas muestras. El estudio ha sido revisado y aprobado por el Consejo de la Universidad de Chicago de Revisión Institucional.
AMDS
AMDS es un sistema de análisis genético totalmente automatizado basado en un chip de ADN que tiene 23 pocillos de reacción que contienen reactivos para ensayos de PCR y Invader® (Figura 1A y 1B). Cuando un usuario añade una muestra (sangre entera, el ADN purificado o homogeneizado de tejido) para el cartucho de purificación de ADN y se inicia el software adjunto, AMDS realiza la extracción de ADN, el ADN transfiere al chip, lleva a cabo la PCR y el ensayo Invader®, lee los resultados , y muestra a juzgar resultado en unos 70 minutos. flujo Ensayo de detección de la mutación se muestra en la Figura 1C. En el paso 1, el ADN se extrae y purifica mediante el cartucho de purificación de ADN; en el paso 2, la muestra de fluido ADN purificado se transfiere a la DNA-Chip; en el paso 3, InvaderPlus® (PCR y Invader® reacción continuamente en el mismo tubo) se lleva a cabo; en el último paso, AMDS informa de un resultado de genotipado de la muestra. InvaderPlus® se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalizar durante 2 min a 93 ° C, seguido de 30 o 35 ciclos de 31 segundos a 93 ° C y 16 segundos a 66 ° C, y la desactivación de la polimerasa Taq durante 2 minutos a 97 ° C , seguido de 10 minutos de detección de la señal a 61 ° C. La señal de fluorescencia de FAM (fluorescencia aminohexil) se controló en el canal F1 a 520 nm con una excitación de 490 nm, y la señal de fluorescencia de RED (Red Redmond) se controló en F2 canal a 595 nm con excitación de 580 nm.
(A), (B) sistema de AMDS (DNA-chip, cartucho de purificación de ADN y concebir) (C) Ensayo de flujo de AMDS. (D) Principio de la química algoritmo Invader® (E) genotipado de AMDS. el tiempo del punto final, JP:: PE tiempo del punto de juzgar, FNT: Resistencia a la fluorescencia de umbral negativo, F (EP): intensidad de fluorescencia en el PE, F (JP): intensidad de fluorescencia de JP, SR: Cociente de la señal, RPT: umbral de relación positiva .
DNA-chip de ADN y purificación de cartucho
Todos los chips de ADN y cartuchos de purificación de ADN se fabrican en una habitación limpia a nivel de la norma ISO mezcla de clase 8. se requiere reactivos (1,99 l ) para un chip de ADN que contiene 0,1 l de tampón de 1 M de MOPS (pH 7,7) (DOJINDO LABORATORIES, Kumamoto, Japón), 0,05 l de 10 mM cada trifosfato de desoxirribonucleósido (Roche, CA, EE.UU.), 0,96 l de 1 M de trehalosa (Hayashibara , Okayama, Japón) solución acuosa, 0,60 l de 20 × mezcla de oligo, 0,22 l de 5,0 U /l Hawk Taq polimerasa (Roche, CA, USA), 0,04 l de 15.000 U /l Cleavase (Hologic, WI, EE.UU.) fueron dispensado y se secó en pocillos de un chip de ADN. 20 × mezcla de oligo fue preparada con 0,06 l de cebador directo 100 M, 0,06 l de 100 mM cebador inverso, 0,06 l de 50 mM de FAM-FRET (fluorescencia la transferencia de energía de resonancia) casete (Hologic, WI, EE.UU.), 0,06 l de 50 M de casete RED-FRET (Hologic, WI, EE.UU.), 0,06 l de DW (Agua destilada: Lonza, Basilea-Ciudad, Suiza), y un conjunto de 0,06 l de 10 mM invasores oligonucleótido más el 0,06 l de sonda alelo 100 micras para tanto de tipo salvaje y el tipo mutante. Las secuencias de oligonucleótidos utilizados en este estudio se muestran en la Tabla S1
.
El ácido nucleico se purificó usando un cartucho de purificación de ADN que contiene un filtro de vidrio. ADN se adsorbe a sílice en presencia de una sal caotrópica [24], [25]. Después de que el proceso de purificación, 270 l de muestra de ADN que contiene MgCl
se inyectó 2 (6,25 mM) y NaCl (15 mM) en el ADN-chip.
El principio de InvaderPlus® ensayo para la detección de mutaciones
InvaderPlus® es Invader® ensayo basado en la química (Figura 1D) la detección de mutaciones, en el que la PCR y la reacción Invader se llevan a cabo de forma consecutiva en un solo tubo. Después de la etapa de amplificación PCR, la ADN polimerasa se inactiva de calor, y la reacción Invader® detecta la mutación en el producto de PCR. La invasión de nucleótidos oligo y se unen sonda alelo para el producto de PCR de formación de estructura de escisión invasiva (1). Si la secuencia de la sonda alelo está completamente emparejado con el producto de PCR, Cleavase® corta la sonda causando la liberación de brazo. El brazo liberado se une a la secuencia complementaria de la casete de FRET. Finalmente, Cleavase® corta un casete de FRET, y separa colorante fluorescente nucleótido modificado (F) desde el cassette residual FRET que contiene inhibidor (Q) en el extremo 3 '. Estas reacciones son reciclados, y la amplificación de la señal causa. Por el contrario, cuando la secuencia de la sonda tiene falta de coincidencia de una sola base con el producto de PCR en su extremo 5 ', donde la invasión de nucleótidos oligo y la sonda alelo tienen una base de estructura de superposición, Cleavase® no puede cortar la sonda alelo. Como resultado, la consiguiente reacción no tiene lugar, y el casete FRET está intacto (2). Dos casetes FRET se distinguen por el uso de diferentes tintes fluorescentes.
Algoritmo de la tipificación genética
El principio y el diagrama de flujo de genotipado por AMDS se muestra en la Figura 1E. Cuando el ensayo Invader® ha completado, el software de genotipado compara la intensidad de fluorescencia de la señal en el documento EP (tiempo de punto final) se describe como F (EP), y FNT (fuerza fluorescente de umbral negativo). Si F (EP) es inferior a FNT, la muestra se considera como negativo (
e, g
, Muestra D) para la mutación. Si F (EP) no es inferior a FNT, a continuación, se calcula su relación de señal (SR), que se indica por la siguiente ecuación,.
SR representa un rendimiento de la reacción de ensayo Invader®. Si SR de una muestra es mayor que RPT (Relación de umbral positivo), la muestra se considera como positiva para la mutación específica (
por ejemplo
. La muestra A y B), pero si no, la muestra se considera como negativo (
por ejemplo
muestra C). Cada RPT para todas las mutaciones detectadas en este estudio clínico se definió con el mutante de tipo salvaje plásmido mezcla de ADN del 95% al 5% (Tabla S2.).
Secuenciación directa (DS)
En la DS , se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar el
KRAS gen
: 5'-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 '(F: cebador directo), 5'-GTGTGACATGTTCTAATATA GTCA-3' (R: cebador inverso),
BRAF
gen: 5'-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 '(F), 5'-AGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3' (R) y
PIK3CA
gen: 5'-ATGATGCTTGGCTCTGG AAT-3 '(F), 5 '-GGTCTTTGCCTGCTGAGAGT-3' (R). La longitud de cada producto de PCR fue
KRAS
: 214 pb,
BRAF
: 228 pb,
PIK3CA
EX9: 269 pb y
PIK3CA
EX20: 273 pb. Los productos de PCR fueron ciclo de secuenciado utilizando el kit de secuenciación Big Dye Terminator v1.1 Ciclo /3.0 (Life Technologies, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuencia se sometieron a electroforesis en un Applied Biosystems 3730 × l analizador de ADN (Life Technologies, CA, USA).
Estudio de titulación utilizando el ADN plásmido y el ADN genómico
Para evaluar la detección de mutaciones sensibilidad de AMDS, se realizó un estudio de titulación de plásmido de ADN. muestras de titulación (cantidad de ADN de plásmido: 1 fg /pocillo, 10 fg /pocillo y 100 fg /pocillo) se prepararon como se muestra en la Figura 2A. Las mezclas de muestras contenían 30 l de ADN plásmido, 12 l de NaCl 500 mM, 18 mM MgCl l de 100
2, y 240 l de D. W. Cada muestra de ADN de plásmido contiene 100 ng /pocillo de testículos de salmón ADN monocatenario (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.). Además, la contribución de la señal de tierra de nuevo se comprobó con ADN genómico humano femenino Novagen® (Biosiences EMD, CA, USA) (1 ng /pocillo, 10 ng /pocillo y 100 ng /pocillo).
(A ) estudio de la titulación de ADN plásmido. El ADN del plásmido se construyó para un total de 13 mutantes diferentes y 6 de tipo salvaje (
KRAS
: 1,
BRAF
: 1,
PIK3CA
: 2). (B) Estudio de Rendimiento clínico. 70 tejidos FFPE en rodajas y 89 tejidos rodajas congeladas se pusieron a prueba. ADN genómico fue extraído a partir de tejido FFPE en rodajas por Epicentre® QuickExtract ™. El ADN genómico se purificó a partir de tejido congelado en rodajas con el kit de ADN QIAamp® Micro. También, como rodeada por líneas de puntos, se homogeneizó aproximadamente 1 mg de tejido en rodajas congeladas y se utiliza para el análisis de mutación totalmente automatizado. (C) La titulación de estudio
KRAS mutación G13D
detección por DS. Se tomaron la electropherograms para diferentes mutante mezcla salvaje de ADN plásmido (10 fg /reacción). (D) Estudio de Titulación para
KRAS mutación G13D
detección por AMDS. La gráfica muestra los datos de reacción InvaderPlus® fusionadas (n = 3) para diferentes mezcla mutante-salvaje por
KRAS
detección G13D por AMDS (◊; MT 100%, ○; mt 50%, △; Mt 25% , Υ; MT 5%, *; MT 1%, +; 0,5% y ×; MT 0%). Cantidad de ADN plásmido fue de 10 fg /pocillo. (E) electroferograma de delantero y análisis de la misma muestra (ID = 56754) revertir. reacción (F) InvaderPlus® de una muestra (ID = 56754) por AMDS.
Rendimiento clínico Estudio
El diseño experimental para el estudio de rendimiento clínico de AMDS se muestra en la Figura 2B . El ADN genómico a partir de secciones congeladas de muestras (n = 89) se extrajo y se purificó mediante el kit DNA QIAmp® Micro (Qiagen, CA, EE.UU.), y se ajustó a 10 ng /l. La muestra se carga en el chip de ADN contenía 30 l de ADN genómico de 10 ng /l, 12 l de NaCl 500 mM y 18 l de MgCl 100 mM
2, y 240 l de D.W. El ADN genómico a partir de secciones FFPE (n = 70) fue extraído utilizando el QuickExtract ™ DNA Extraction Kit FFPE [Epicentre® (una compañía de Illumina®), WI, EE.UU.] de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se preparó como una muestra × 50 de dilución. Carga de la muestra para el chip de ADN contenía 30 l de ADN extraído (50 × dilución), 12 l de NaCl 500 mM, 18 mM MgCl l de 100
2, 240 l de DW
Análisis Clonación
análisis clonación se llevó a cabo para las muestras (n = 14) que tenía el estado mutacional discordante entre AMDS y DS. Insertar longitudes de los productos de PCR fueron 214 pb (
KRAS
), 228 pb (
BRAF
), 269 pb (
PIK3CA
EX9) y 273 pb (
PIK3CA
EX20). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S3. Los productos de PCR se prepararon mediante el uso de ADN polimerasa y ADN GoTaq® GXL PrimeSTAR® polimerasa. Productos de PCR fueron digeridos por enzima de restricción, y los fragmentos se insertaron a pUC118 /HincII y pMD19 /EcoRV. clones insertados fueron reconocidos por el cribado azul-blanco. El ADN plasmídico se amplificó por illustra TempliPhi Amplificación de ADN Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Inglaterra). DS fue realizado por Applied Biosystems 3730 × l analizador de ADN.
completamente automatizado de detección de mutaciones somáticas por se homogeneizaron durante 20 segundos por vidrio AMDS
Aproximadamente 1 mg de secciones congeladas de muestras (n = 41) homogeneizador, y 200 l de DW fue añadido. El homogeneizado se transfiere al cartucho de purificación de ADN de AMDS, y totalmente automatizado proceso de detección de la mutación para
KRAS
y
se llevaron a cabo PIK3CA
mutaciones. Las muestras congeladas, que albergaban
BRAF V600E
mutación no se incluyeron en este estudio debido a la limitada cantidad de ADN.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo por el poder estadístico y las pruebas de coeficiente κ [26], que se utiliza para comparar la incidencia y el grado de concordancia en la detección de
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
entre DS y AMDS.
Resultados
la comparación de sensibilidad de detección de la mutación entre AMDS y DS en el estudio de ADN plásmido Titulación
ADN de plásmidos Para evaluar la sensibilidad del AMDS, hemos utilizado diluido en serie que contienen diferentes proporciones de tipo mutante y salvaje de
KRAS
,
BRAF Opiniones y
PIK3CA
genes. Cuando la muestra contenía menos de 25% de ADN mutante, el pico de mutación en el electroferograma DS no fue capaz de ser distinguida de la de fondo (Figura 2C). Por el contrario, AMDS claramente detectado
KRAS mutaciones
G13D a un nivel de 5% (máximo 0,5%) como muestra la figura 2D.
La comparación de sensibilidad de la detección de mutaciones entre AMDS y DS en el estudio sobre los resultados clínicos
El rendimiento de detección de mutaciones se comparó entre AMDS y DS con dos juegos de muestras; tejidos frescos congelados (n = 89) y FFPE muestras (n = 70) de pacientes (n = 153) con el CRC. muestras congeladas y FFPE apareadas estaban disponibles para seis pacientes, y el resto de las muestras eran de pacientes independientes. La comparación se realiza de una manera doble ciego. Como se muestra en la Tabla 1-3, todos los
KRAS
,
BRAF
y
PI3KCA
mutaciones detectadas por DS en bien congelado (número total de mutación, n = 41, 46,0 %) o FFPE (n = 27, 38,5%) muestras fueron también con éxito (100%) detectados por AMDS. No hubo muestras que se determinaron como mutantes en DS mientras detectado como de tipo salvaje en AMDS. En las muestras detectadas como tipos silvestres de DS, sin embargo, AMDS fue capaz de detectar mutantes adicionales en las muestras congeladas (n = 8, 9,0%) y FFPE (n = 6, 8,6%). Como se muestra en la Tabla 4, las mutaciones en ambos
KRAS
y
PIK3CA
fueron detectados por AMDS en 6 pacientes (6/153, 3,9%). Cabe destacar que, entre estas mutaciones coexistentes, todos los
PI3KCA
mutaciones eran específicamente E545K, mientras que
KRAS
mutaciones variadas.
Resultados de DS y AMDS para un ejemplo discordantes se muestra en la Figura 2E y 2F. Esta muestra se determinó plausiblemente como un mutante de acuerdo al DS solamente con el análisis de cebador directo. Debido a la señal de secuenciación pobres en el análisis de cebador inverso, esta muestra fue considerada como una de tipo salvaje. Por el contrario, AMDS tenía una señal clara mutación. Todos los demás resultados discordantes (8 en el tejido congelado, 6 en los tejidos FFPE) tenían patrones muy similares (datos no mostrados).
Validación de discordante de datos por Clonación y secuenciación
Todas las muestras que tenían discordante estado mutacional entre AMDS y DS fueron validados por análisis de clonación (Figura 3A, B). La precisión de la clonación también se evaluó con tasa de error (ER) se define como la frecuencia de las alteraciones de bases de la región insertada entre las colonias escogidas como siguiente ecuación; ER = el número de alteraciones /[(longitud de inserto) x (número de secuencia de clon exitoso)] x 100. Las regiones clonadas analizadas no tienen un punto caliente para la mutación distinta de los puntos específicos. Por lo tanto las alteraciones de bases de secuencia de consenso fueron consideradas como errores de lectura de la ADN polimerasa. ER de PrimeSTAR® GXL (0,03 a 0,06%), que tiene 3 '→ 5' actividad exo-nucleasa, fue considerablemente menor que la de GoTaq® (0,16-0,29%). La frecuencia de todas las mutaciones de interés (Figura 3A, B) fue mucho mayor que ER (
p
= 1,04 × 10
-6), que indica que las mutaciones en estas muestras eran verdaderas mutaciones y el discordancia entre los dos métodos se atribuyó a la menor sensibilidad de DS. En este estudio, el tamaño de la muestra fue lo suficientemente bueno ya alto grado de poder en el
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
detección de mutaciones (
P =
0,96, 0,97 y 0,94, respectivamente) por AMDS (Tabla 1-3). kappa pruebas de coeficiente de
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA gratis (κ = 0,91, 0,67 y 0,70, respectivamente) mutaciones indicadas bajo grado de coincidencia entre AMDS y DS.
(A) Clonación resultado del análisis de los tejidos congelados. (B) La clonación resultado del análisis de los tejidos FFPE .; PCR se realizó durante congelado ID = 56756, ID = 63440 y FFPE ID = 41947, ID = 7053306 muestras con ADN GXL PrimeSTAR® polimerasa. Otras muestras se realizaron PCR con la ADN polimerasa GoTaq®. frecuencia de mutación potencial en una muestra = (número de secuencia mutante) /(número de secuencia de éxito). Si la frecuencia fue mayor que ER, la muestra se consideró como mutación positiva. Nota: No se confirmó si la tasa de mutación de una muestra pudo ser cuantificada mediante el análisis de clonación. (C) Diagrama de Venn del
KRAS
,
BRAF Opiniones y
PIK3CA
mutaciones. En este gráfico, estas frecuencias de mutación no se calculan para muestras, pero para los pacientes. 6 muestras se tomaron de mismos tejidos y se prepararon para tanto rebanada congelado y FFPE. El AMDS análisis de estas 6 muestras mostraron mismos resultados tanto para congelado y la rebanada FFPE.
Figura 3C se resumen las frecuencias de mutaciones en todos los pacientes (n = 153) en base a la detección AMDS. Las tasas de mutación de
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
eran el 28,7% (44/153), 2,5% (4/153) y el 10,1% (16/153) , respectivamente. La frecuencia de la coexistencia de las mutaciones en
KRAS
o
PIK3CA
fue del 3,9% (6/153).
AMDS y DS se compararon por su robustez en la detección de mutaciones de ADN a partir de muestras preparado utilizando diferentes métodos. El comercial de ADN kit de purificación de Qiagen (QIAmp® ADN Micro Kit) se utilizó con los tejidos congelados, y otro kit de extracción de ADN comercial (Quick Extract ™) se utiliza con los tejidos FFPE. tarifas de llamadas de genotipado para DS fueron 100,0% (89/89) y 74,3% (52/70) de las muestras congeladas y FFPE, respectivamente, para el primer intento; mientras que la de AMDS fue 100,0% para ambos conjuntos de muestras. La Figura 4A muestra un caso de detección de la mutación G13D, en el que la muestra fue tomada del mismo paciente y se procesa en ambos rodajas congeladas y FFPE. Mientras que la muestra congelada tiene un electroferograma clara, la muestra FFPE mostró señales ruidosas. Dieciocho muestras se ensayaron de nuevo para DS, y 10 de ellas tuvieron éxito. Sin embargo, 8 muestras no fueron capaces de ser analizados tanto en la direcciones de avance y después de múltiples intentos de revertir. Fuera de estas 8 muestras, 7 muestras no pudieron ser analizados para el
BRAF
mutaciones, y 1 muestra no pudieron ser analizados tanto para
KRAS Opiniones y
PIK3CA
mutaciones. Por el contrario, AMDS perfectamente llamó a estas muestras como de tipo salvaje para el
KRAS
,
BRAF Opiniones y
PIK3CA
genes.
tejidos de CRC se prepararon para ambos formato congelado y FFPE. Estas muestras se analizaron por tanto DS y AMDS. DS no llamar el genotipo del tejido FFPE debido a electrophenogram ruidoso. La misma muestra fue re-secuenciado, y llamó como
KRAS
de tipo salvaje. análisis de resultados (B) AMDS con diferente cantidad total de ADN plásmido. símbolos sólidos (•; 100 fg /pocillo, ▪; 10 fg /pocillo, ▴; 1 fg /pocillo) indican la señal de las muestras que contienen 5% mutante, y los símbolos vacíos (○; 100 fg /pocillo, □; 10 fg /pocillo, △; 1 fg /pocillo) indican g de ADN plásmido contiene aproximadamente 210 copias. análisis de resultados (C) AMDS con diferente cantidad de ADN genómico de tipo salvaje. (○; 100 ng /pocillo, □; 10 ng /pocillo, △; 1 ng /pocillo).
La robustez de la detección de mutaciones para una amplia gama de concentraciones de la muestra fue también la prueba de AMDS. La Figura 4B muestra el resultado del experimento de plásmido de ADN. 5% de la señal de ADN mutante tenía clara separación de fondos para la gama de 1 fg /pocillo a 100 fg /pocillo de ADN plasmídico total, que corresponde a 10 copias a 1000 copias de la diana de ADN mutante por reacción. número de copias de 1 fg /pocillo de ADN plásmido (210 copias) es equivalente a 0,63 ng /pocillo de ADN genómico. La cantidad de ADN genómico (extraído de tejido congelado) utilizado en el estudio rendimiento clínico fue de 10 ng /pocillo, y que cae en el rango del experimento anterior. Sin embargo, con el fin de comprobar el nivel de señal de fondo, se llevaron a cabo experimentos adicionales con varias cantidades de ADN genómico humano. Figura 4C indica que las señales de fondo son estables y casi idéntica a la del experimento de ADN de plásmido (figura 4B) para la gama de 1 ng a 100 ng por pocillo.
Estudio de Viabilidad de un sistema totalmente automatizado
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
Detección de mutaciones por AMDS
En este experimento, la extracción de crudo de las muestras de tejido congelado (n = 41) se realizó por trituración manual de , y se usó el homogeneizado bruto después como una muestra para el análisis de mutación totalmente automatizado por AMDS
.
los resultados del análisis de la mutación totalmente automatizado eran perfectamente concordante con los estudios clínicos previos de rendimiento (Tabla 5). Además, AMDS fue capaz de detectar todos los mutantes (3/41) que DS no pudo detectar. Por lo tanto, AMDS podría detectar todos los
KRAS gratis (14/41, 34,1%) y
PIK3CA gratis (8/41, 19,5%), incluso mutaciones de estas muestras de homogeneizado (~ 1 mg de tejido).
Discusión
Este estudio evaluó AMDS en dos series (Congelados y FFPE) de los tejidos CRC primarias por un total de 159 muestras. Nuestros datos sugieren AMDS tiene mayor sensibilidad y versatilidad de DS. La capacidad superior de nuestro sistema puede ser atribuible a la alta sensibilidad (& gt; 0,5%) y la fidelidad de la química Invader® que contienen la señal de amplificación de la capacidad de [22], [23]. Esto es de particular importancia para la detección de mutaciones cuando el nivel del mutante es extremadamente bajo. Los resultados mostrados en la Figura 4B y 4C sugieren AMDS puede mantener una sensibilidad de detección de mutación 5% con un rango muy amplio (100 bodegas) de la concentración de la muestra. Por otra parte, Kotoura
et al
. informado anteriormente que la eficiencia PCR de DS y el ensayo basado en la PCR en tiempo real en muestras de FFPE de ADN son sufridos por la fragmentación del ADN [27]. Como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4A, los resultados de análisis de la mutación a través de AMDS fueron apoyados por los resultados de clonación, y la AMDS mostraron una superioridad significativa de DS en su sensibilidad sobre la amplia gama de la cantidad de ADN y la variedad de condiciones de fijación.
Además, el sistema AMDS lograron una detección totalmente automatizado de
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA mutaciones
con CRC muestras congeladas homogeneizados, lo cual es ventajoso para el análisis muestras de valor, tales como tejidos de biopsia. El procedimiento de detección de mutaciones de AMDS es muy simple y no requiere de técnica experimental y experiencia.
Una de las cosas más importantes es que, en el análisis de la clonación, se observó que se usa comúnmente ADN polimerasa Taq comercial tiene un no- por lo bajo ER, mientras que el ADN polimerasa PrimeSTAR® GXL con un '→ 5' 3 actividad exo-nucleasa (corrección) tiene menos ER. Por lo tanto, cuando se requiere de ultra alta sensibilidad para un ensayo tal como la detección de mutaciones de ADN libre de células en muestras de sangre (suero o plasma), de alta fidelidad de la polimerasa de ADN debe ser utilizado.
Como resultado de la evaluación para el clínico tejidos de CRC (n = 159) mediante el uso de AMDS, patrones de mutación detectados en nuestras muestras son muy consistentes con lo que se ha informado anteriormente [28] - [30]. Hemos observado muy interesante co-existencia de múltiples mutaciones en los tres genes. Por ejemplo, el 6 de 153 muestras (3,9%) poseían doble (uno para las mutaciones triples), que apoya la hipótesis de la tumorigénesis sinérgica entre
KRAS
y
PIK3CA
[29], [31] . Además, hubo dos muestras que poseían ambos
KRAS
G13D y
PIK3CA mutaciones
(E542K E545K y /o).