Extracto
Antecedentes
Las anexinas son calcio y fosfolípidos de unión a proteínas que forman una familia de múltiples genes conservados evolutivo. Una considerable evidencia indica que la anexina A10 (ANXA10) está implicado en la progresión tumoral, aunque se sabe poco sobre su papel en la carcinogénesis oral humana. En este estudio, se investigó la participación de ANXA10 en el carcinoma oral de células escamosas (COCE).
Metodología /Principales conclusiones
ARNm y proteínas ANXA10 expresiones fueron evaluados por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa y inmunotransferencia, y se realizó un ensayo de proliferación y el análisis del ciclo celular en células ANXA10 desmontables
in vitro
. Se evaluó la correlación entre el estado de expresión ANXA10 en 100 OSCCs primaria y las características clinicopatológicas por inmunohistoquímica. ANXA10 mRNA y los niveles de expresión de proteínas fueron reguladas en todas las líneas celulares examinadas (n = 7,
p Hotel & lt; 0,05). desmontables células ANXA10 mostraron que la proliferación celular disminuida por la inactivación de la quinasa regulada extracelular (ERK) (
p Hotel & lt; 0,05), y la detención del ciclo celular en la fase G1 resultado de la sobre regulación de los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina . expresión de la proteína en ANXA10 OSCCs primarios también fue significativamente mayor que en contrapartes normales (
p
& lt; 0,05)., y mayor expresión se correlaciona con el tamaño tumoral (
p
= 0,027)
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados propuestos para la primera vez que ANXA10 es un indicador de la proliferación celular en OSCCs. Nuestros resultados sugieren que la expresión ANXA10 podría indicar la proliferación celular y ANXA10 podría ser una diana terapéutica potencial para el desarrollo de nuevos tratamientos para OSCCs
Visto:. Shimizu T, Kasamatsu A, Yamamoto A, Koike K, S Ishige, Takatori H, et al. (2012) A10 Anexina en el cáncer oral humana: biomarcador para el crecimiento tumoral a través de G1 /S de transición por la orientación de MAPK vías de señalización. PLoS ONE 7 (9): e45510. doi: 10.1371 /journal.pone.0045510
Editor: Qiming Jane Wang, de la Universidad de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Marzo, 2012; Aceptado 21 de agosto de 2012; De publicación: septiembre 17 de, 2012
Copyright: © Shimizu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las anexinas son calcio y proteínas de unión a fosfolípidos que forman una evolutivo familia multigénica conservado. La desregulación de miembros de la familia de anexina se ha informado en numerosos tipos de cáncer y afecta a los patrones de comportamientos celulares, tales como la proliferación, invasividad, y vías de señalización relacionadas con el cáncer, lo que sugiere que las anexinas pueden desempeñar papeles importantes en el desarrollo tumoral y la progresión [1] - [10] . Anexina A10 (ANXA10), un gen sobreexpresado en los carcinomas orales de células escamosas (COCE) -derivado líneas celulares en nuestros datos de microarrays anteriores [11], ha sido implicado en la función celular en la endocitosis y exocitosis; actividad anticoagulante; interacción con el citoesqueleto; diferenciación; y la proliferación celular [12], [13]; y la relevancia de la malignidad en el esófago de Barrett, cáncer gástrico, y cáncer de vejiga [14] - [16].
proliferación de las células de cáncer humano se controla en gran medida en la fase G1 del ciclo celular. La proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) cascadas de señalización han adquirido gran importancia en la proliferación de diversas células del cáncer [17]. Estudios previos han informado de que varias anexinas modulan específicamente la quinasa regulada extracelular (ERK) /MAPK cascada de señalización aguas arriba [18], [19]. la activación de ERK juega un papel fundamental en la transición G1 /S [20], [21]. Los miembros de la ciclina
-
quinasa dependiente de ciclinas (CDK) que interactúan las proteínas /proteína inhibidora de quinasa (Cip /Kip) se unen a la familia de los complejos ciclina-CDK e inhibir su actividad, lo que lleva a la detención del ciclo celular G1. Ciclina D1, ciclina E, p21
Kip1 y p27
niveles Kip1 se ven afectados por múltiples vías de señalización, incluyendo el /MAPK vía ERK señalización [22] - [25]. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales estos ANXA10 modula las respuestas celulares no han sido completamente aclarada en OSCCs.
Se presentan los resultados de un análisis global de la expresión aberrante de ANXA10 en OSCCs que están funcionalmente y clínicamente vinculados a la progresión tumoral .
líneas celulares
resultados
Evaluación de ANXA10 ARNm y la expresión de proteínas en COCE derivados de
Para investigar el estado de la expresión de ANXA10 identificado como un gen relacionado con el cáncer por nuestro anterior microarrays de datos [11], hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa (QRT-PCR) y análisis de inmunotransferencia utilizando siete líneas celulares derivadas de CCCA y queratinocitos orales normales humanos (HNOKs). ANXA10 ARNm y el estado de expresión de la proteína fueron significativamente hasta reguladas en todas las líneas celulares CCCA comparación con la de los HNOKs (Figura 1A, B; *
p Hotel & lt; 0,05). El análisis de expresión indica que ambos productos de transcripción y traducción de esta molécula fueron altamente expresado en líneas celulares derivadas de COCE.
(A) Cuantificación de los
ANXA10
niveles de mRNA en líneas celulares derivadas de CCCA por QRT -PCR análisis. Importantes sobre regulación de
ANXA10
ARNm se ve en las siete líneas celulares derivadas de CCCA comparación con la de los HNOKs. Los datos se expresan como la media ± SEM de los valores a partir de tres ensayos (*
p
& lt; 0,05; prueba de Mann-Whitney U). (B) Análisis de inmunotransferencia de proteínas ANXA10 en las líneas celulares derivadas y HNOKs-CCCA. ANXA10 expresión de proteínas (peso molecular, 37 kDa) es hasta reguladas en las líneas celulares derivadas de CCCA comparación con la de los HNOKs. de datos de proteínas densitométrico ANXA10 se normalizan para alfa-tubulina niveles de proteína. Los valores se expresan como un porcentaje de los HNOKs.
Establecimiento de desmontables células ANXA10
Dado que la expresión ANXA10 fue hasta reguladas en las líneas celulares CCCA, se asumió que podría desempeñar ANXA10 un papel importante en OSCCs. Para evaluar la ANXA10 funciones
in vitro
, un experimento shRNA se llevó a cabo usando las células Sa3 y HO-1-u-1. Expresiones de ANXA10 ARNm y proteínas en las células transfectadas con shANXA10 fueron significativamente más bajos que en las células transfectadas shMock (Sa 3 y Ho-1-derivados-u-1 células transfectantes, Figura 2A, B; *
p
& lt;. 0.05)
(a) QRT-PCR muestra que la expresión ANXA10 mRNA en las células transfectadas con shANXA10 (Sa3- y transfectantes HO-1 derivadas de-u-1, 2 clones cada uno) son significativamente más bajos que en las células transfectadas con shMock (*
p Hotel & lt; 0,05; Mann-Whitney U test). (B) Análisis de inmunotransferencia muestra que los niveles ANXA10 proteína en las células transfectadas con shANXA10 (Sa3- y HO-1 derivadas de-u-1 transfectantes; 2 clones cada uno) también han disminuido notablemente en comparación con la de las células transfectadas con shMock
análisis funcional de las células desmontables ANXA10
Para evaluar el efecto de ANXA10 caída en el crecimiento celular, se realizó un ensayo de proliferación celular. Transfectadas con el ANXA10 shRNA (shANXA10) - y el control shRNA (shMock) células transfectadas fueron sembradas en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables /pocillo contaba con 7 días consecutivos. Hubo una disminución significativa en el crecimiento celular de las células transfectadas con shANXA10 en comparación con las células transfectadas shMock (Sa3 o HO-1 derivadas de-u-1 células transfectantes, la Figura 3; *
p
& lt; 0,05 ).
Para determinar el efecto de shANXA10 sobre la proliferación celular, shANXA10- y las células transfectadas con shMock se siembran en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables /pocillo. Ambos transfectantes se contaron en 7 días consecutivos. El crecimiento celular de las células transfectadas con shANXA10 (Sa3- y transfectantes HO-1-derivados-u-1; 2 clones cada uno) se inhibió significativamente en comparación con las células transfectadas con shMock después de 7 días (168 horas). Los resultados se expresan como la media ± SEM de los valores a partir de tres ensayos. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las células transfectadas con shMock shANXA10- y (*
p Hotel & lt; 0,05; Mann-Whitney U test).
Para investigar un posible mecanismo subyacente que que explicaría la proliferación celular reducida en las células transfectadas con shANXA10, evaluamos las vías ERK, que son con frecuencia hasta reguladas en el endometrio y otros tipos de cáncer [26] - [29]. ERK proteínas (pERK) fosforilado disminuyó significativamente en las células transfectadas con shANXA10 comparación con las células transfectadas con shMock (Figura 4). Estos resultados sugieren que la vía de señalización de ERK frecuencia se atenúa en las células transfectadas con shANXA10
.
ANXA10 causas desmontables disminución de los niveles de ERK fosforilada (Perk) en comparación con las células transfectadas (shMock Sa3- y Ho-1-u -1 derivados de transfectantes; 2 clones cada uno); el nivel de ERK es sin cambios. densitométrico de datos de proteínas Perk /ERK se normalizan a-tubulina niveles de proteína.
Para investigar el mecanismo de la progresión del ciclo celular en las células transfectadas con shANXA10, se realizó un análisis de citometría de flujo de células transfectadas con shANXA10. El porcentaje de la fase G1 en las células transfectadas con shANXA10 fue significativamente (
p
& lt; 0,05) más alta que la de las células falsamente transfectadas (Figura 5A, B). También se evaluó el nivel de expresión de ciclina dependientes de los inhibidores de quinasa (CDKIs: p21
Cip1 y p27
Kip1), ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, y CDK6. Como era de esperar, mientras que los CDKIs fueron reguladas, se detectó una significativa baja regulación de la ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6 y en las células transfectadas con shANXA10 (Figura 5C). Estos resultados indican que la baja regulación de la proliferación celular ANXA10 inhibida por la detención de la fase G1.
Para investigar la progresión del ciclo celular, analizamos la determinación de citometría de flujo del contenido de ADN mediante un citómetro en el G0-G1, S, y, las fases G2-M. Se determinó el nivel de expresión de CDKIs (p21
Cip1and p27
Kip1), ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6 y para identificar el mecanismo por el cual ANXA10 inhibe la progresión del ciclo celular en la fase G1. (A) Después de sincronizar en fase G0 /G1 con privación de suero, se realizó un análisis de citometría de flujo para investigar el ciclo celular en las células transfectadas con shMock shANXA10- y. El porcentaje de la fase G1 en las células transfectadas con shANXA10 (Sa3- y transfectantes HO-1-derivados-u-1, 2 clones cada uno) se ha incrementado notablemente en comparación con las células transfectadas de manera simulada (
p & lt
; 0,05,
T
la prueba de Mann-Whitney). (B) Después de sincronizar en fase G2 /M a tratados con nocodazol, análisis citométrico de flujo se realizó para investigar el ciclo celular en las células transfectadas con shMock shANXA10- y. El porcentaje de la fase G1 en las células transfectadas con shANXA10 (Sa3- y transfectantes HO-1-derivados-u-1, 2 clones cada uno) también ha aumentado notablemente en comparación con las células transfectadas de manera simulada (
p
& lt; 0,05,
T
la prueba de Mann-Whitney). análisis (C) La inmunotransferencia muestra sobre regulación de p21
Cip1and p27
Kip1 y la baja regulación de la ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6 y en las células transfectadas con shANXA10 (Sa3- y Ho-1 transfectantes -u-1-derivados;. 2 clones cada uno) en comparación con las células transfectadas shMock
Evaluación de la expresión ANXA10 en OSCCs primarias
) resultados de inmunohistoquímica (IHC Representante para ANXA10 proteína en el tejido oral normal y COCE primaria se muestran en la Figura 6A-D. Las puntuaciones ANXA10 IHC del citoplasma de OSCCs primarios fueron significativamente (Figura 6E; *
p
& lt; 0,001) mayor que en los tejidos normales, en el que los resultados de IHC tejidos orales normales y OSCCs oscilaron desde 27,5 hasta 132,4 (mediana, 93,5) 60,5 230,4 a la (mediana, 150,6), respectivamente. La Tabla 1 muestra las correlaciones entre las características clínico-patológicas de los pacientes con COCE y el estado de expresión de la proteína ANXA10 utilizando el sistema de puntuación de IHC. Entre las clasificaciones clínicas, OSCCs ANXA10-positivos se correlacionaron con el tamaño tumoral (
p = 0,027
) y el estadio TNM de los OSCCs (
p = 0,041
).
representante resultados de IHC para la proteína en el tejido normal ANXA10 oral (A, B) y primaria COCE (C, D) (A, C) Aumento original, x100. Las barras de escala, 50 m. (B, D) Aumento original, × 400. Barras de escala, 10 m). inmunoreactividad ANXA10 fuerte se detecta en OSCCs primarias; tejidos orales normales muestran inmunotinción casi negativo. (E) El estado de expresión de la proteína en ANXA10 OSCCs primarios (n = 100) y las contrapartes normales. Las puntuaciones ANXA10 IHC se calculan de la siguiente manera: la puntuación de IHC = 1 × (número de células débilmente teñidas en el campo) + 2 x (número de células moderadamente teñidas en el campo) + 3 x (número de células intensamente teñidas en el campo) . Los ANXA10 IHC resultados para los tejidos orales normales y OSCCs oscilaron desde 27,5 hasta 132,4 (mediana, 93,5) 60,5 230,4 a la (mediana, 150,6), respectivamente. ANXA10 niveles de expresión de proteínas en OSCCs son significativamente (*
p Hotel & lt; 0,001,
T
la prueba de Mann-Whitney). Mayor que en los tejidos orales normales
Discusión
en el estudio actual, ANXA10 era frecuentemente sobreexpresado en líneas celulares derivadas de COCE, y la baja regulación produjo una disminución de la proliferación celular mediante la inactivación de ERK. El análisis del ciclo celular también mostró que se produjo la detención de G1 en las células ANXA10 desmontables mediante la disminución CDKI (p21
Cip1 y p27
Kip1) expresión. Además, con frecuencia ANXA10 fue hasta reguladas en OSCCs primaria y una mayor expresión ANXA10 se asoció con el tamaño tumoral (
p = 0,027
). Estos resultados indicaron que ANXA10 está vinculada a la regulación del ciclo celular en la fase G1 y juega un papel importante en la progresión tumoral en OSCCs
.
Desde la carcinogénesis oral y otros tipos de cáncer se cree que son los procesos de varios pasos interrupción progresiva de la proliferación de células epiteliales, los mecanismos de proliferación celular en las células tumorales son un importante campo de estudio para el tratamiento del cáncer tumoral y la biología molecular [30], [31]. Anexinas, incluyendo ANXA10, han jugado un papel importante en el desarrollo y progresión tumoral [14] - [16], [18], [19]. Sin embargo, no hay evidencia directa ha demostrado que ANXA10 se requiere para la proliferación celular. Para determinar si la función ANXA10 es relevante para la progresión OSCC, hemos realizado estudios funcionales utilizando shRNA y encontramos que la supresión de ANXA10 disminuyó significativamente la proliferación celular como resultado de inhibió vía con baja regulación de pERK de señalización MAPK. La vía de señalización de ERK /MAPK está relacionada con muchos procesos celulares, tales como la proliferación, la diferenciación, la homeostasis, y la supervivencia celular [17], [32]. La activación de la vía de señalización de ERK /MAPK promueve el crecimiento celular anormal y la tumorigénesis en múltiples tipos de tumores. Nuestros resultados indican que la expresión ANXA10 era relevante para la fosforilación de ERK y la activación de la vía de señalización ERK /MAPK. La vía de ERK /MAPK está estrechamente controlada por mecanismos de señales extracelulares. Esto incluye el control intracelular de Ca
2 + concentraciones, lo que permite Ca
2 + para servir como un segundo mensajero [33]. Ca
2 + -effector proteínas puede mediar en las respuestas celulares a los cambios en intracelulares de Ca
2 + niveles. Las anexinas, una familia de tales Ca altamente conservada
2 + proteínas -regulated, se caracterizan por su capacidad para unirse a los fosfolípidos en un Ca
2 + -dependiente y la mayoría de las funciones de anexina están relacionados con su capacidad de interactuar con las membranas celulares de una manera regulada [12], [13]. En base a estas evidencias combinadas con nuestros resultados, sugerimos que ANXA10 puede afectar intracelular de Ca
2 + homeostasis interactúa y directa o indirectamente con la activación de vías de señalización de ERK /MAPK.
Además de la señalización de MAPK vía, las células CCCA con shANXA10 revelaron la detención del ciclo celular en la fase G1 con la sobre regulación de p21
Cip1 y p27
Kip1 y la baja regulación de la ciclina D1 y ciclina E. los dos últimos son también reguladores críticos de la la progresión de G1 y G1-S transición. La inhibición de su expresión bloques G1-S transición en el ciclo celular. Las actividades de los complejos ciclina-CDK son moduladas por dos tipos de CDKIs, Cip /Kip (p21
Cip1and p27
Kip1), que regula la progresión del ciclo celular. Los miembros de la familia se unen Cip /Kip a complejos ciclina-CDK e inhibir su actividad, lo que lleva a la detención del ciclo celular G1. Ciclina D1, ciclina E, p21
Kip1 y p27
niveles Kip1 se ven afectados por múltiples vías de señalización, incluyendo la señalización /MAPK vía ERK [25], [34]. Ciclina D1 y ciclina E son con frecuencia hasta reguladas en los cánceres humanos [35], [36]. El mecanismo de la activación de ERK en fibroblastos no adherentes se ha reportado que afecta a la ciclina D1 [37]. En otros informes, la activación de ERK conduce a la sobre regulación de la ciclina D1 [38]. El CDKIs, p21
Kip1 y p27
Kip1, con frecuencia son las reguladas en los cánceres humanos [39], [40]. El mecanismo de regulación de ERK de p21
Kip1 y p27
Kip1 sigue sin estar clara. ERK pueden fosforilar directamente p21
Kip1 y p27
Kip1 [41] - [43]. Estos datos sugirieron que ANXA10 activa la vía de señalización mediante la fosforilación de ERK MAPK y promueve el ciclo celular G1 por CDKIs abajo de la regulación de la progresión del COCE.
Hasta la fecha, la expresión de ANXA10 en los tejidos CCCA y su correlación con las características clínico-patológicas no se han dilucidado. En nuestro estudio, aunque las tasas positivas de ANXA10 en tumores en fase inicial fueron significativamente baja, las tasas positivas en tumores avanzados-se incrementaron de manera significativa; esto implica firmemente que ANXA10 puede jugar un papel importante en la progresión del cáncer. Teniendo en cuenta que ANXA10 sobreexpresión puede predecir la malignidad, la estratificación del paciente mediante ANXA10 estado puede proporcionar un enfoque más personalizado a la terapia del cáncer oral humana.
En conclusión, nuestros resultados indicaron que ANXA10 se sobreexpresa frecuentemente en OSCCs y que esta puede ser la sobreexpresión asociado con la progresión tumoral mediante la promoción de la progresión del ciclo celular en la fase G1 a través de la activación de la vía de señalización de ERK /MAPK, lo que lleva a la disminución de la expresión de CDKIs. Si bien se necesitan más estudios para estudiar la interacción de ANXA10 y la vía de señalización de ERK /MAPK, estos datos sugieren que ANXA10 juega un papel importante en la proliferación celular y la expresión es probable que sea un biomarcador de la progresión y una diana terapéutica potencial para el desarrollo de cáncer drogas en OSCCs primarias.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Facultad de Medicina, Universidad de Chiba (el número de homologación, 236) y se llevó a cabo de acuerdo con las normas éticas establecidas en la Declaración de Helsinki. consentimiento informado por escrito se recibió de todos los pacientes.
CCCA líneas celulares y muestras de tejidos
Las líneas celulares humanas CCCA (HSC-2, HSC-3, 4-HSC, Kon, HO-1 -u-1, y Ca9-22) fueron adquiridos de la investigación de la ciencia Banco de Recursos Humanos, Osaka, Japón. SA3 fue proporcionado amablemente por el Dr. S. Fujita en la Universidad de Medicina de Wakayama, Wakayama, Japón [44]. HNOKs cultivo primario sirvieron como controles normales [45] - [49]. Todas las células se mantuvieron en Dulbecco modificado medio /F-12 HAM de Eagle (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Sigma) y 50 unidades /ml de penicilina y estreptomicina (Sigma) en un humidificado 5 % de CO
2 /atmósfera de aire a 37 ° C.
se obtuvieron cien pares de muestras primarias CCCA y los correspondientes tejidos epiteliales orales normales durante las cirugías en el hospital de la Universidad de Chiba, Chiba, Japón. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para la utilización del protocolo, que la junta de revisión institucional de la Universidad de Chiba revisado y aprobado. Los tejidos resecados se dividieron en dos partes; uno se congeló inmediatamente y se almacenaron a -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN, y el segundo se fijó en una solución de formaldehído tamponado al 20% para el diagnóstico patológico y IHC. El diagnóstico histopatológico de cada tejido se realizó de acuerdo a los criterios de la Organización Mundial de la Salud por el Departamento de Patología, Hospital de la Universidad de Chiba. estadiaje clínico-patológico se determinó de acuerdo con la clasificación de tumores de nodo metástasis de la Unión Internacional contra el Cáncer. Todas las muestras fueron confirmados histológicamente CCCA y evaluados para verificar la presencia de tumoral en más del 80% de las muestras.
Cuantitativo en tiempo real PCR con transcripción inversa
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol ( Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. cDNA se generó a partir de 5 g de ARN total usando Ready-To-Go Usted-Prime primer capítulo de los granos (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y oligo (dT) (Ciencia del Sistema de Hokkaido, Sapporo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . QRT-PCR se realizó para evaluar el nivel de expresión de
ANXA10
ARNm en las líneas celulares derivadas y HNOKs-CCCA. Los niveles de expresión se determinaron utilizando cebadores y sondas que fueron diseñados utilizando la biblioteca universal de la sonda (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores utilizados para QRT-PCR fueron:
ANXA10
, hacia adelante 5'GCATCCATTATGGGATTGAAA-3 ', 5'-revertir CAAAATGTTTTGTGGAGACTATGTG-3', y la sonda universal de#24. Todos qRT-PCR se realizó con un sistema de PCR LightCycler® 480 (Roche). Las amplificaciones fueron iniciados por una pre-incubación de 10 minutos a 95 ° C, seguido por 45 ciclos de 10 segundos a 95 ° C para la desnaturalización plantilla, 30 segundos a 55 ° C para el cebador de recocido /extensión y la refrigeración durante 30 segundos a 40 ° DO. La cantidad de transcripción para el
ANXA10
fue estimada a partir de las respectivas curvas de calibración y normalizado a la
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa gratis (
GAPDH
) (adelante 5'-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA -3'cell, revertir 5'-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ', y la sonda#cantidad 60) transcripción universales determinados en muestras correspondientes.
análisis de inmunotransferencia
Las células se lavaron dos veces con fosfato fría solución salina tamponada (PBS) y se centrifugó brevemente. Los pellets celulares se incubaron a 4 ° C durante 30 minutos en un tampón de lisis (7 M urea, tiourea 2 M, 4% w /v de CHAPS, y Tris 10 mM [pH 7,4]) con el cóctel inhibidor de proteinasa (Roche). La concentración de proteína se midió con una proteína Bio-Rad de ensayo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Los extractos de proteína (20 mg) se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio en gel de 4 a 12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en el bloqueo de uno (Nacalai Tesque, Tokio, Japón). Las membranas fueron incubadas con conejo anti-ANXA10 anticuerpo policlonal (Abnova, Taipei, Taiwán), anti-ratón
α-tubulina
anticuerpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. EE.UU.), ratón anti-ERK 1/2 anticuerpo monoclonal (R & amp; D Systems, Abingdon, Reino Unido), de conejo anti-fosforilados ERK 1/2 anticuerpo monoclonal (pERK, R & amp; D Systems), ratón anti-p21
anticuerpo monoclonal Cip1, conejo anti-p27 anticuerpo policlonal, ratón anti-ciclina D1 anticuerpo monoclonal (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-ciclina E anticuerpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology), anti CDK2-anticuerpo monoclonal, anticuerpo
Kip1 ratón de conejo de ratón anti-CDK4 monoclonal , o anticuerpo monoclonal anti-CDK6 ratón (Cell Signaling Technology) durante 4 horas a temperatura ambiente. La membrana se lavó con 0,1% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris, se incubaron con anticuerpo secundario y acoplado a peroxidasa de rábano conjugada anti-conejo o anti-IgG de ratón (Promega, Madison, WI, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente . Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia sustrato SuperSignal (Thermo, Waltham, MA, EE.UU.). Por último, los resultados del análisis de inmunotransferencia se visualizaron mediante la exposición de la membrana para un sistema de cámara CCD enfriada (ATTO, Tokio, Japón). intensidad de la señal se cuantificaron utilizando la versión 3.0 del analizador CS (ATTO).
La transfección con el plásmido shRNA
Las líneas celulares CCCA, Sa3 y HO-1-u-1, en el que la expresión de proteínas ANXA10 fue mayor que en las otras líneas celulares, se transfectaron de forma estable con el ANXA10 shRNA (shANXA10) o el control shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology) usando Lipofectamine LTX y Reactivos Plus (Invitrogen). Los transfectantes estables se aislaron por el medio de cultivo que contiene 2 mg /ml puromicina (Invitrogen). Dos a 3 semanas después de la transfección, las colonias viables fueron recogidos y trasladados a nuevos platos. shANXA10- y las células transfectadas con shMock fueron utilizados para experimentos adicionales.
Ensayos de proliferación
Para investigar el efecto de la caída ANXA10 sobre la proliferación celular, shANXA10- y las células transfectadas con shMock fueron sembradas en seis pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables /pocillo. En los puntos de tiempo indicados, las células se tripsinizaron y se contaron por triplicado utilizando un hemocitómetro.
Cell-ciclo de análisis
Con el fin de sincronizar las células en la fase G0 /G1 o G2 /M transición, las células fueron privadas de suero durante 48 horas o se trataron con 200 ng /ml nocodazole (Sigma) durante 20 horas [50], [51]. Para determinar la distribución del ciclo celular, las células se recogieron, se lavaron con PBS, y se sondaron con el kit de reactivo de ADN CycleTEST Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se concentran a 5 × 10
5 células se centrifugaron /ml a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Hemos añadido 250 ml de solución A (tampón de tripsina), y se incubó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añade 200 ml de solución B (inhibidor de la tripsina y RNasa en un tampón), y se incubó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 200 ml de solución C (solución de propidio tinción de yoduro), y se incubó la mezcla durante 10 minutos en la oscuridad en hielo. determinación de citometría de flujo del contenido de ADN se analizó por FACScalibur (Becton-Dickinson). Las fracciones de las células en el G0-G1, fases S y G2-M fueron analizados utilizando el software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón, EE.UU.).
La inmunohistoquímica
IHC se realizó en secciones de 4 micras de muestras incluidas en parafina utilizando conejo anti-ANXA10 anticuerpo policlonal (Abnova). En pocas palabras, después de la desparafinación y la hidratación, la actividad de peroxidasa endógena se inactivó mediante una incubación de 30 minutos en una mezcla de solución de peróxido de hidrógeno 0,3% en metanol al 100%. Las secciones se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con 1,5% de suero de bloqueo (Santa Cruz Biotechnology) en PBS antes de reaccionar con el anticuerpo anti-ANXA10 (1:1000 dilución) a 4 ° C en una cámara húmeda durante la noche. Tras la incubación con el anticuerpo primario, las muestras se lavaron tres veces en PBS y se trataron con Histofine Simplestain Max-PO (G) (Nichirei, Tokio, Japón), seguido por el desarrollo de color en tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAKO, Carpinteria, CA, EE.UU.). Por último, los portaobjetos se contratiñeron ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron con etanol, limpiadas con xileno, y se montaron. No específica de unión del anticuerpo a las proteínas que no sean a veces se produjo el antígeno. Como control negativo, las secciones se inmunotiñeron triplicado sin exposición a anticuerpo primario, que confirmó la especificidad de la tinción. Para cuantificar el nivel de expresión de proteínas ANXA10 en esos componentes, utilizamos sistemas de puntuación de IHC descritas anteriormente [48], [52] - [55]. La intensidad de la inmunorreacción ANXA10 se puntuó como sigue: 1+, débil; 2+, moderada; y 3+, intenso. Los números de celulares y la intensidad de la tinción y luego se multiplicaron para producir la puntuación ANXA10 IHC. Los casos con una puntuación superior a 132,0 ANXA10 IHC (3 desviación estándar (SD) para la puntuación de tejido normal) se definieron como ANXA10-positivo. El punto de corte ± SD 3, que estadísticamente es sólo el 0,2% de la medición y se espera que caiga fuera de este rango, se utilizó porque era poco probable que sea afectado por un error experimental aleatorio producido por la manipulación de la muestra [56]. Dos patólogos independientes, ninguno de los cuales tenía conocimiento del estado clínico de los pacientes, emitieron estas opiniones.
El análisis estadístico
El significado de los niveles de expresión ANXA10 se evaluó mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de Mann -Whitney U test.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM).
Reconocimientos
Agradecemos a la Sra Lynda C Charters para la edición de este manuscrito.