Extracto
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es muy agresivo y se caracteriza por la metástasis maligna . Aproximadamente el 90% de los pacientes mueren debido a la extensa metástasis. La matriz extracelular (ECM) es una barrera natural que puede evitar la invasión celular y la metástasis. Por lo tanto, la degradación de la MEC debe llevarse a cabo con el fin de metástasis extensa que se produzca. Una desintegrina y metaloproteasa (ADAM) es una proteasa multi-dominio que desempeña un papel importante en la tumorigénesis, así como el desarrollo tumoral, la invasión y la metástasis. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre la expresión y el papel de Adams en SCLC. En el estudio actual, la expresión y el papel de Adams en la proliferación de SCLC, se investigó la invasión y la metástasis. Un total de 150 muestras de tejido de SCLC se examinaron mediante inmunohistoquímica para la expresión Adams. ADAM-12 se encontró que se expresa abundantemente en 72.67% de las muestras y Otras ADAM se encontró que se expresa en 10% a 40% de las muestras. ADAM-12 niveles en suero y orina, procedentes de 70 pacientes con CPCP y 40 controles normales, también se midieron utilizando ELISA. ADAM-12 expresión fue significativamente mayor en los pacientes de SCLC que en los controles sanos y en pacientes con enfermedad extensa en comparación con aquellos con la enfermedad más limitada. Silenciamiento de la expresión de ADAM-12 en las células H1688 a través de la utilización de siRNA específico reducido significativamente celular proliferación, invasión y metástasis. Como complemento de la expresión de ADAM-12-L o -S en H345 células, mejora de forma significativa la proliferación celular, la invasión y la metástasis. Los modelos animales con metástasis SCLC también exhiben una mayor expresión de ADAM-12, junto con una mayor invasión y metástasis. En resumen, ADAM-12 es un factor pronóstico independiente y marcador de diagnóstico, y está implicado en la proliferación, invasión y metástasis de SCLC
Visto:. Shao S, Z Li, Gao W, G Yu, Liu D , Pan F (2014) ADAM-12 como marcador diagnóstico para la proliferación, migración y la invasión en pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 9 (1): e85936. doi: 10.1371 /journal.pone.0085936
Editor: Pan-Chyr Yang, Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 20 Septiembre, 2013; Aceptado: 3 de diciembre de 2013; Publicado: 21 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Shao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81302017). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es el más maligno de todos los cánceres de pulmón. La tasa de supervivencia a cinco años es sólo del 3-8% debido a la metástasis generalizada durante la fase inicial y las recaídas que se producen cuando la resistencia a los tratamientos desarrolla [1]. Anteriormente, la degradación de la matriz extracelular (ECM) ha sido el principal foco de estudios sobre la invasión y metástasis de SCLC [2], [3]. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) se han detectado en SCLC, y los altos niveles de expresión de MMP-11 y -14 se han identificado como factores de pronóstico negativo independientes en [4] SCLC. Los inhibidores de MMP se han utilizado clínicamente para pacientes con SCLC, pero resultó ser ineficaz y no mejoró la tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes [5]. Esto sugiere que la degradación de ECM es un proceso complejo y que las proteasas, distintos de los MMPs, se deben estudiar para determinar si otros factores juegan un papel en SCLC.
A desintegrina y metaloproteasa (ADAM) pertenece a la proteasa familia. ADAMs puede degradar ECM y arrojar los precursores unidos a la membrana que modulan la célula-célula y las interacciones célula-matriz [6]. ADAM se dividen en dos grupos: anclada a la membrana y secretada ADAM tipo ADAM. Tipo secretada ADAM contiene motivos de trombospondina y también se llama desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina (ADAMTS). Adams y ADAMTS pueden degradar el ECM y arrojar precursores, promoviendo así la invasión y metástasis. El aumento de expresión de Adams y ADAMTS se ha detectado en numerosos tumores. ADAM-8, -12, -15 y -28 son altamente expresado en el cáncer no microcítico de pulmón de células [7], [8], [9], [10], ADAM-9, -12, -17 y -23 son altamente expresado en el cáncer de mama [11], [12], [13], [14] y ADAM-9, -12 y -17 son altamente expresado en el cáncer de hígado [15], [16], [17]. ADAMTS4 y ADAMTS5 se ha informado para participar en el proceso metastásico escindiendo brevican en glioblastomas [18]. Curiosamente, se encontró que de longitud completa ADAMTS1 para promover la invasión y metástasis por el derramamiento de factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) y anfirregulina, sin embargo, el fragmento de ADAMTS1 muestra una función de anti-metastásico [19]. SCLC es un tumor muy agresivo. Aproximadamente el 90% de los pacientes mueren como consecuencia de metástasis extensa. Por lo tanto, es esencial que se identifica un marcador de diagnóstico, y un factor pronóstico evaluarse para los pacientes de SCLC. Actualmente, no hay ningún marcador de diagnóstico eficaz para SCLC. Se han realizado pocos estudios que examinan el papel de la expresión Adams en SCLC, con la excepción de ADAM-15 [8]. Sobre la base de las posibilidades que brinda el papel de Adams en la promoción de la proliferación, metástasis y angiogénesis, que tuvo como objetivo evaluar los niveles de expresión de Adams y su relación con el pronóstico clínico en SCLC con el fin de identificar un marcador de diagnóstico eficaz.
en este estudio, se encontró que la expresión de ADAM-12 fue mayor en SCLC que otros ADAM mediante inmunohistoquímica (IHC). análisis de supervivencia univariante y multivariante indicó que ADAM-12 fue un factor pronóstico independiente para pacientes con CPCP. El nivel de expresión de ADAM-12 en el suero y en la orina fue mayor en los pacientes de SCLC en comparación con los controles sanos, así como en pacientes con enfermedad extensa en comparación con aquellos con enfermedad limitada. Los modelos animales que demuestran alta metástasis de SCLC también había una mayor expresión de ADAM-12 y la invasión y la metástasis mejorada. Nuestros resultados apoyan la conclusión de que presenta altamente ADAM-12 como un factor pronóstico independiente y marcador de diagnóstico estuvo implicado en la proliferación, invasión y metástasis en pacientes con SCLC.
Materiales y Métodos
Pacientes y celular líneas
muestras de tejidos tumorales fijadas con formalina de 150 pacientes que sufren de SCLC se obtuvieron del hospital de la Universidad médica de Binzhou, china, entre enero de 2008 y diciembre de 2011. de las muestras de tejido, 140 se obtuvieron mediante biopsia y se obtuvieron 10 durante la cirugía. información básica del paciente se obtuvo de los archivos del paciente y se muestra en la Tabla 1.
muestras de suero y orina frescas se obtuvieron de 70 pacientes con CPCP del departamento de oncología en el Hospital de la Universidad Médica de Binzhou, China (48 varones y 22 mujeres con una edad media de 52,3 ± 11,3 años). Un total de 45 pacientes tenían enfermedad extensa definida como la enfermedad que se ha extendido al pulmón contralateral o que tiene metástasis a distancia) y 25 pacientes tenían enfermedad limitada definida como la enfermedad que se limita a un solo pulmón, mediastino, y /o los ganglios linfáticos regionales . Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado de manera voluntaria. Todos los pacientes fueron diagnosticados con SCLC por las muestras de biopsias patológicas y se habían sometido a quimioterapia y radioterapia. También se estudiaron un total de 40 voluntarios sanos (20 hombres y 20 mujeres con una edad media de 38,7 ± 12,1 años). controles sanos no tenían cambios anormales en las funciones de la sangre, hígado, corazón, pulmón o riñón. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la Universidad Médica de Binzhou, China (Permiso Número: BY2010008).
CEP líneas celulares humano, incluyendo H1688, H446 y H345, fueron adquiridos de la Shanghai Biblioteca de células de los chinos Academia de Ciencias. Las células se cultivaron en 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.
Inmunohistoquímica
Las muestras incluidas en parafina fueron desparafinados en dimetilbenceno y hidratados en alcohol gradiente. Las secciones se trataron de acuerdo con los siguientes protocolos: peroxidasa endógena eliminado (incubación en 3% H
2O
2 para 30 min), el antígeno recuperado (alrededor de 95 ° C durante 45 min), el bloqueo con suero de cabra 10% (a temperatura ambiente durante 30 min), durante la noche de incubación anticuerpo primario a 4 ° C, conjugado con HRP anticuerpos de incubación secundaria durante 30 min a 37 ° C, reacción de color DAB, tinción con hematoxilina, la diferenciación, la deshidratación y la transparencia. La dilución de anticuerpos primarios fue 1:50 para ADAM-8, ADAM-10, ADAM-11 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.), 1:200 para ADAM-12 (Abgent, Suzhou, China), Adam- 15 y ADAM-17 (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Dos patólogos que desconocían el diagnóstico clínico realizado las puntuaciones de tinción. En el caso de un controvertido resultado, se logró consenso por discusión. Un sistema de puntuación semicuantitativa fue utilizado para evaluar las muestras de acuerdo con el porcentaje de tinción positiva: grado 0 (negativo), grado 1 (débil, la expresión positiva positiva fue inferior al 10%), grado 2 (expresión positiva, positiva moderada fue entre 10% y 60%) y de grado 3 (fuerte expresión positiva, positiva fue mayor que 60%) [20].
ELISA
suero y la primera orina de la mañana (mediados corriente) se obtuvieron de pacientes con SCLC, se centrifugó (1000 g, 30 min) para recoger el sobrenadante y se almacena a -80 ° C [21]. Los niveles en suero y orina de ADAM-12 se midieron usando un kit de ADAM-12 específica ELISA (R & amp; D Systems). Se añadió un volumen de 50 l de muestras diluidas 2 veces a una placa de 96 pocillos cubierta con ADAM-12 anticuerpo monoclonal específico y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de aspirar y lavar cada pocillo cuatro veces, se añadieron 200 l de ADAM-12 conjugado y los pocillos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Cada pocillo se lavó cuatro veces adicionales para eliminar el líquido residual y se añadieron 200 l de solución de sustrato a cada pocillo y los pocillos se incubaron durante 30 min en la oscuridad. tampón de detención fue añadido para terminar la reacción y la intensidad de absorción se leyó a 450 nm.
ARN pequeño de interferencia (siRNA) de tratamiento
siRNAs de genes diana fueron sintetizados y modificados (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La secuencia del siRNA dirigidos ADAM-12 fue de 5 'GGA AGA GCU GAU GAA GUU GTT 3' [22] y la lucha siRNA fue 5 'NVND UCC GAA UGE GUC ACG UTT 3'. células H1688 se cultivaron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 75 pmol de ARNsi y 7,5 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se añadió a cada pozo cuando la densidad celular fue de aproximadamente 30% -50%. Después de 4 h, la Opti-medios se sustituyeron por medios normales y se recogieron las proteínas a las 48 h después de la interferencia.
La transfección de ADAM-12-L y ADAM-12-S en células H345
H345 células fueron transfectadas transitoriamente con ADAM-12-L y ADAM-12-S vectores de expresión (plásmidos pcDNA3.1 que contienen toda la longitud humana ADNc de ADAM-12-L o -S fueron regalos de Ulla M. Wewer en la Universidad de Copenhague ) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células transfectadas con ADAM-12-L fueron nombrados H345-L y las células transfectadas con ADAM-12-S fueron nombrados H345-S.
PCR en tiempo real
El ARN total fue extraído por medio de un kit de Trizol (Takara, Dalian, china). Se preparó ADNc usando un kit de síntesis de ADNc (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). PCR en tiempo real se realizó con SYBR Green (Thermo Scientific). Los cebadores de los genes diana fueron los siguientes:
F: 5'-GCAGTTTCACGGAAACCCAC-3 ', España
R: 5'-ACACGTGCTGAGACTGACTG-3' para ADAM-12;
F: 5'-TCCTGTGTCTTCTTGCTGCC-3 ', España
R: 5'-GCGCACACACCTTAGTTTTTC-3' para ADAM-12-L;
F: 5'-CCACCCATTCCATCTCCATC-3 '
R: 5'-TTCTGCAAACCCTCAAACC-3'for ADAM-12-S
F: 5'-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3 '
R: 5'-CGCGGCGATATCATCATCCA-3' para la beta-actina.
Western Blot
Las células se lisaron con tampón de lisis SDS que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasa. Las proteínas cuantitativos se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a los miembros NC. El miembro fue bloqueada con 5% de leche descremada durante 1 h con una ligera sacudida y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C (1:500 para ADAM-12, Abgent, Suzhou, China; 1: 3000 para la beta-actina, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EE.UU.), después se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 40 min a temperatura ambiente. inmunoblot bandas se visualizaron utilizando el sistema ECL (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y la película de rayos X.
Transwell experimentos se llevaron a cabo
Transwell experimentos de acuerdo con la guía del fabricante (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). El Matrigel se diluyó con medios sin suero (1: 2). Un volumen de 60 l de gel se colocaron en la cámara superior y se solidifica mediante la incubación a 37 ° C durante 3 h. 1 × 10
4 células se sembraron en la cámara, filtrada en la cámara inferior y se introduce en el suero. A continuación, las células se tiñeron con Giemsa utilizando colorante, y el número de células en 3 campos se contó con un microscopio óptico.
Análisis del ciclo celular
Las células se mantuvieron en ayunas durante 24 h por la retirada del suero. Se trataron las células H1688 y H345. Las células se recogieron, se fijaron y se incubaron con RNasa A (Thermo Scientific) durante 30 min a 4 ° C. Luego, las células se incubaron a continuación con yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 30 min. No se detectó contenido de ADN mediante citometría de flujo [23].
Los experimentos con animales
H1688 células (una línea clásica pulmón de células pequeñas de las células cancerosas) se cultivaron en 1640 y 10
6 células fueron administrado por vía subcutánea en ratones desnudos. El tamaño del tumor se monitorizó cada semana. Cuando el diámetro del tumor alcanzó aproximadamente 1 cm, los ratones fueron sacrificados bajo anestesia y se extirparon los tumores. tumores extirpados (llamadas células de los padres) se redujeron a la mitad. Una mitad se almacenó a -80 ° C, y el otro se cortó en piezas, se digirió (0,25% de tripsina de incubación durante 15 min) y se filtró. células filtradas se cultivaron de nuevo en medio normal. Tres días más tarde, se inyectaron las células en ratones inmunodeficientes a través de la vena de la cola. Diez semanas después, los ratones fueron sacrificados bajo anestesia. De los 10 ratones que fueron inyectados, 5 ratones tenían tumores visibles (diámetro & gt; 0,5 cm) en el pulmón y el hígado abdomen y la otra 5 ratones no tenían tumores visibles. En comparación con los tumores resultantes de la inyección subcutánea, los tumores resultantes de la inyección en vena de cola tenían niveles más altos de la infiltración y la invasión [24]. Por lo tanto, un modelo animal de la metástasis tumoral que simula altamente metastásico en pacientes que se construyó con éxito. El Comité de Ética Médica de la Universidad Médica de Binzhou aprobó este estudio (número de permiso: BY2013001).
El análisis estadístico
Todos los datos fueron analizados utilizando el software SPSS 17.0. El método de Kaplan-Meier y log-rank test se utilizaron para evaluar la tasa de supervivencia univariante. regresión de Cox se utilizó para realizar el análisis de supervivencia multivariante. Se realizó un análisis de curvas de características operativas del receptor (ROC) para evaluar el valor de corte para los niveles en suero y orina de ADAM-12 en pacientes con SCLC y voluntarios sanos. Se evaluó el área bajo la curva (AUC) y los valores de p. Se analizaron las diferencias de expresión entre diferentes grupos usando emparejado
t
prueba.
P Hotel & lt;
0,05
se consideró estadísticamente significativa
Resultados
La expresión de Adams en muestras de SCLC por IHC
La expresión de ADAM-8,. - 10, -11, -12, -15 y -17 se evaluó por IHC en 150 muestras de SCLC. El nivel de expresión positiva (decenas de grados 2 y 3) de ADAM-8, -10, -11, -15 y -17 fue 31.33% (47/150), 34,66% (52/150), 19,33% (29 /150), 39,33% (59/150) y 10% (15/150), respectivamente (Figura S1). La expresión positiva de ADAM-12 fue la más alta en 72,67% (109/150) y la fuerte expresión positiva (grado 3) de ADAM-12 fue significativamente mayor en comparación con la otra Adams (
P
& lt; 0,001 ). Como se muestra en la Figura 1, se encontró que ADAM-12 se expresó en SCLC y se encuentra en el citoplasma, pero no el núcleo. Tinción HE indica que el tipo de tejido tumoral tenía características típicas de SCLC clinicopatológicas (núcleos más grandes y casi sin citoplasma). Las muestras de tejido que se incubaron durante la noche con PBS, en lugar de anticuerpo primario, se utilizaron como controles negativos. ADAM-12 se expresó significativamente más en muestras de tejido de SCLC en comparación con la expresión de otros Adams (
P
& lt; 0,001), indicando que ADAM-12 puede jugar un papel importante en el proceso de la proliferación, invasión y metástasis en SCLC
.
ADAM-12 se detectó en tejido pequeño cáncer de pulmón de células por tinción inmunohistoquímica. La relación de dilución de anticuerpo primario fue de 1: 200 para ADAM-12. (A) el tejido pulmonar normal; (B) tinción HE en el tejido SCLC; (C) Control negativo (se incubaron con PBS en lugar de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C); (D) La tinción para ADAM-12 en el tejido SCLC.
ADAM-12 es un factor pronóstico independiente en pacientes con CPCP
Desde ADAM-12 fue altamente expresado en el CPCP, investigamos la relación entre ADAM-12 y pronóstico de la enfermedad. Todos los pacientes habían aceptado la terapia sistémica y 15 de 150 pacientes todavía estaban vivos en enero de 2013 (fecha de cierre del estudio). El tiempo medio de supervivencia de los pacientes fue de 12,59 meses y la tasa de supervivencia a los 2 años fue del 16%. De acuerdo con las puntuaciones de tinción IHC, los que tienen grados 0 y 1 se consideraron en el grupo negativo y aquellos con los grados 2 y 3 fueron considerados en el grupo positivo. análisis de supervivencia univariante mostró que los factores clínicos significativos que afecten a la supervivencia fueron enfermedad extensa (
P Hotel & lt; 0,001). Ni fumar (
P = 0,882
), género (
P = 0,396
) fue un factor pronóstico significativo ni entre los niveles de ADAM-8 (
P = 0,903
), ADAM-10 (
P = 0,075
), ADAM-11 (
P = 0,317
), ADAM-15 (
P = 0,349
) o ADAM-17 (
P = 0,427
). Sin embargo, ADAM-12 (
P = 0,022
) fue un factor pronóstico negativo significativo (Figura 2). Se realizó un análisis multivariado de la supervivencia para evaluar la influencia de diversos factores de pronóstico. Los resultados fueron consistentes con el análisis de supervivencia univariante. El estadio clínico (
P = 0,001
, HR = 2,003; IC del 95%: 1,330-3,015) y el nivel de expresión de ADAM-12 (
P = 0,049
, HR = 0,443; IC del 95% : 0,197-0,995) fueron importantes factores pronósticos independientes (Tabla 2) y ADAM-12 estaba estrechamente asociado con la etapa clínica (
P Hotel & lt; 0,001). Características clínicas de los pacientes que fueron positivos para ADAM-12 se compararon con aquellos que fueron negativos para ADAM-12 con el fin de aclarar aún más el papel de ADAM-12 como un factor pronóstico independiente en el CPCP. Los resultados mostraron que el estadio patológico fue estadísticamente significativa (
P = 0,037
), mientras que otros factores como la edad (& lt; 65 en comparación con ≥ 65,
P = 0,325
), género (
P = 0,975
), el tabaquismo (
P = 0,743
) y el tamaño tumoral (
P = 0,511
) no fueron significativas.
tiempo de supervivencia de los pacientes se obtenido por el seguimiento. Se realizó un análisis univariante de supervivencia para evaluar si ADAM-8, -10, -11, -12, -15 y -17 podrían ser considerados como factores pronósticos independientes. El resultado mostró ADAM-12 sea un factor independiente y adversos (
P = 0,022
).
suero y orina de ADAM-12 niveles en pacientes con CPCP
IHC tinción demostró ADAM-12 para ser altamente expresado en las secreciones mucosas, a excepción de las células de SCLC (Figura 3A). A continuación, inferimos que ADAM-12 probablemente fue secretada en la sangre y se excreta a través de la orina. Por lo tanto, hemos investigado los niveles de ADAM-12 en el suero y la orina de los pacientes con SCLC. El suero y la orina de 70 pacientes de SCLC y 40 voluntarios sanos se recogieron, se centrifugaron y se almacenaron a -80 ° C. Un kit de ELISA se utilizó para detectar la expresión de ADAM-12. Las curvas ROC produjeron un mayor AUC de 0,899 (
P Hotel & lt; 0,001; IC del 95%: 0,842-0,956) de 346 pg /ml en suero de ADAM-12 nivel de pacientes de SCLC (Figura 3B) que en los controles normales (una AUC de 0,847 a 105 pg /ml), y un aumento de la AUC de 0,979 (
P Hotel & lt; 0,001; IC del 95%: 0,959-0,999) de 258 pg /ml en la orina ADAM-12 de nivel pacientes de SCLC (Figura 3C) que los controles normales (un AUC de 0,869 para 92 pg /ml). El nivel sérico de ADAM-12 fue significativamente mayor en los pacientes con SCLC que en voluntarios sanos (502 ± 234
vs
180 ± 92 pg /ml,
P Hotel & lt; 0,001) y en aquellos con amplia enfermedad en comparación con aquellos con enfermedad limitada (586 ± 205
vs
317 ± 185 pg /ml) (Figura 3D). La orina nivel ADAM 12 fue coherente con el nivel en suero y fue mayor en los pacientes con SCLC que en voluntarios sanos (404 ± 247
vs
128 ± 50 pg /ml) y en pacientes con enfermedad extensa en comparación con los pacientes con limitada enfermedad (477 ± 201
vs
303 ± 152 pg /ml) (Figura 3E). Esto indica que ADAM-12 niveles en suero y orina se correlacionan con la progresión de SCLC y que ADAM-12 puede ser considerado como un marcador de diagnóstico para la enfermedad de SCLC ya que la expresión de ADAM-12 aumentó con el desarrollo y la progresión de la enfermedad.
tinción (a) ADAM-12 fue fuertemente positiva en las secreciones de moco (la región se indica por la flecha). (B, C) Una curva ROC se realizó para evaluar el valor de corte para los pacientes con SCLC y voluntarios sanos; ROC = características de funcionamiento del receptor. (D, E) Los niveles de expresión de ADAM-12 en suero y orina de pacientes con SCLC y los controles normales fueron detectados utilizando un kit ELISA. **
P Hotel & lt; 0,01, pacientes con CPCP
vs
controles normales, los pacientes con CPCP con enfermedad extensa
vs
enfermedad limitada
ADAM-12 metástasis afectada y la proliferación de las células H1688
Como muestran las figuras mostradas. 1, 2 y 3, ADAM-12 es un factor pronóstico independiente que podría ser útil como marcador de diagnóstico en SCLC. Posteriormente, se analizó el papel de ADAM-12 en la proliferación, invasión y metástasis en el CPCP. En primer lugar, se detectó la expresión de ADAM-12 en líneas celulares de SCLC (H1688, H446 y H345) y encontramos que ADAM-12 fue más altamente expresado en células H1688 y H446 en comparación con la línea celular H345 (Figura 4A). En un estudio sobre el cáncer de mama, se ha informado de ADAM-12 para tener dos formas de transcripción (anclada a la membrana ADAM-12-L y tipo secretada ADAM-12-S) que juegan papeles diferentes [22]. Debido a la similitud de secuencias, diferentes siRNAs dirigidos contra ADAM-12-L y ADAM-12-S, respectivamente, no podrían diseñarse de modo siRNA se utiliza para apuntar ADAM-12. La expresión de ADAM-12 se redujo significativamente en el grupo de siRNA específico en comparación con el de los grupos siRNA revueltos (Figura 4B) y sin tratar. Cuando no había interferencia a la expresión de ADAM-12 en las células H1688, las células inducidas por el suero filtrado de la membrana de la cámara se redujo significativamente (Figura 4C) y el ciclo celular se detuvieron en la fase G0-G1 (Figura 4D). Roy
et al
informó que ADAM-12-L promovió la proliferación celular y que ADAM-12-S promovió la migración celular en el cáncer de mama [22]. En nuestra investigación, la proliferación celular y la migración se inhibieron significativamente después de silenciar la expresión de ADAM-12 por siRNA en la línea celular H1688, lo que demuestra que ADAM-12 se asocia con la proliferación celular, invasión y metástasis. Para aclarar las funciones de ADAM-12-L y -S en la proliferación celular y la migración, un experimento se diseñó y llevó a cabo que se detalla a continuación.
(A) La expresión de ADAM-12 fue mayor en H1688 y las células H446 H345 compararon con las células por transferencia Western. (B) La expresión del ARNm y la proteína de ADAM-12 se redujo significativamente cuando ADAM-12 expresión fue silenciado por un siRNA dirigido ADAM-12 (ADAM-12i) en comparación con los no tratados (Mock) y revueltos siRNA (NCI) en H1688 células **
P Hotel & lt; 0,01. (C) Las células inducidas por la membrana cámara de filtración de suero se redujeron significativamente en el grupo de ADAM-12i en comparación con los grupos Mock y NCI en las células H1688, **
P Hotel & lt; 0,01. (D) El ciclo celular fue detenido de manera significativa en la fase G0-G1 en el grupo ADAM-12i. Mock: células no tratadas; NCi: las células fueron tratadas con siRNA revueltos. ADAM-12i:. Las células fueron tratadas con siRNA dirigidos ADAM-12
ADAM-12-L promueve la proliferación y ADAM-12-S promueve la invasión
Como se muestra en la Figura 4, cuando se silencia la expresión de ADAM-12, la proliferación celular y la migración se inhibió significativamente en células H1688. ADAM-12 expresión fue menor en células H345 comparado con H1688 y las células H446 (Figura 3A). células H345 fueron luego transfectadas transitoriamente con el vector de expresión de ADAM-12-L (H345-L) o -S (H345-S). La eficiencia de la transfección se evaluó mediante PCR en tiempo real ya que no había anticuerpo específico de orientación ADAM-12-L o -S. La expresión del ARNm de ADAM-12-L y S se incrementaron significativamente después de la transfección (Figura 5A). No hubo diferencia significativa entre las células H345-L inducidos por filtración a través de la membrana y la cámara (control normal) mock o controles negativos (pcDNA3.1). Sin embargo, se encontró que los resultados contradictorios en las células H345-S. Después de la transfección con ADAM-12-S, H345 células inducidas por el suero de filtrar a través de la membrana cámara se incrementaron significativamente, lo que indica que ADAM-12-S, no ADAM-12-L, juega un papel importante en la invasión SCLC y la metástasis (Figura 5B ). Mientras tanto, el análisis del ciclo celular demostró que las células H345-L entraron en fases S, pero que las células H345-S no fueron significativamente diferentes en comparación con las células de control negativo (Figura 5C). Esto indicó que ADAM-12-L podría promover la proliferación celular y ADAM 12-S-podría promover la invasión de células y la metástasis, que es coherente con el resultado de Roopali [22].
(A) Las expresiones de ARNm de Adam- 12-L y -S fueron detectados por PCR en tiempo real en células H345 transfectadas con el vector de expresión de ADAM-12-L y -S, **
P
& lt; 0,01. Mock: grupo no tratado; pcDNA3.1: Grupo negativo. 12-L: transfectadas con pcDNA3.1-ADAM-12-L; 12-S: transfectadas con pcDNA3.1-ADAM-12-S. (B) Las células inducidas por la membrana cámara de filtración no fueron significativamente diferentes en las células H345 transfectadas con pcDNA3.1-ADAM-12-L (llamado H345-L), sin embargo, las células se aumentaron de manera significativa en células H345 transfectadas con pcDNA3. 1-ADAM-12-S (nombre H345-S), *
P Hotel & lt; 0,05. (C) ADAM-12-L de las células para pasar de la fase G0-G1 a la fase S inducida, pero ADAM-12-S no influyó en la proliferación celular en células H345.
La expresión de ADAM-12 se incrementa cuando la invasión tumoral y la metástasis se mejoró
la investigación anterior [22] ha informado de que ADAM-12-L promovió la proliferación celular y ADAM-12-S promovieron la invasión celular y la metástasis en un modelo animal; nos confirmó esta conclusión en un nivel celular. Sin embargo, no ha habido informes sobre si la expresión de ADAM-12 se incrementa cuando la invasión tumoral y la metástasis se han mejorado. Como se muestra en la Figura 3, suero y orina ADAM-12 niveles fueron significativamente superiores en pacientes con enfermedad extensa, en comparación con aquellos con enfermedad limitada, lo que sugiere que la expresión de ADAM-12 se incrementa con el desarrollo de la enfermedad. Con el fin de confirmar esta conclusión, la metástasis tumoral modelo animal que simula altamente metastásico se construyó como se describe en los métodos (Figura 6A). Hubo un mayor cambio en la morfología de las células metastásicas en comparación con las células parentales de este modelo. tamaño de la célula metastásica era más pequeña, la mancha citoplasma se shoaled, la tinción nuclear se profundizó, la densidad celular adelgazada y la célula compacta debilitado (Figura 6B). Se detectó la expresión de ADAM-12 en las células parentales y metastásicos. La expresión de mRNA de ADAM-12-L no fue diferente entre las células parentales y metastásicos, pero ADAM-12-S mRNA fue significativamente mayor en las células metastásicas (Figura 6C). Esto indica que ADAM-12-S, no ADAM-12-L, juega un papel importante en la invasión y la metástasis. La proteína ADAM-12 se detectó mediante IHC y transferencia de Western. El resultado mostró que ADAM-12 era obviamente mayor en las células metastásicas en comparación con células parentales (Figura 6D).
(A) Un modelo animal altamente metastásico se construyó, 1 × 10 subcutáneamente
se administraron 6 células y los tumores subcutáneos (células parentales) se inyectaron en ratones desnudos a través de vena de la cola para formar tumores metastásicos (células metastásicas). No se observaron (B) Las diferencias morfológicas entre las células parentales y células metastásicas a través de hematoxilina y eosina (HE) tinción. En comparación con las células parentales, las células metastásicas eran más pequeñas, habían shoaled tinción citoplasma, más profundo tinción nuclear, la densidad celular más delgado y más débil compacta celular. (C) No hubo diferencias en la expresión de ARNm de ADAM-12-L entre las células parentales y metastásicos, sin embargo ADAM-12-S mRNA fue significativamente mayor en las células metastásicas, *
P
& lt; 0,05. (D) ADAM-12 expresión de la proteína fue significativamente mayor en las células metastásicas por IHC y Western Blot. P1-P5 indica los cinco tumores subcutáneos y M1-M5 indica los cinco tumores metastásicos.
Discusión
Hay más de 30 ADAM que pertenece a la familia de las metaloproteinasas. Ellos interactúan con las integrinas mediar célula-célula y las interacciones célula-matriz extracelular [25], arrojan un gran número de proteínas transmembrana, degradan la MEC y activan las vías de Notch y EGFR para promover la proliferación celular, invasión y metástasis [6].
las principales características de SCLC son el rápido crecimiento y metástasis extensa en la primera etapa. En la actualidad, no existe un marcador de diagnóstico eficaz para ayudar en el diagnóstico de SCLC, especialmente durante la etapa temprana. Este estudio fue diseñado para evaluar la expresión de Adams en SCLC y con el fin de encontrar un marcador de diagnóstico útil. Hasta ahora, sólo la expresión de ADAM-15 había sido detectado y la expresión de otra Adams había sido reportado solamente raramente en el CPCP [8]. En nuestra investigación, hemos detectado ADAM-8, -10, -11, -12 y -17 y encontramos que ADAM-12 fue más altamente expresado en comparación con otros Adams en muestras clínicas de SCLC.
ADAM-12 es altamente expresado en numerosos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama [12], [14], [26], cáncer de hígado [16], cáncer de estómago [26], [27], cáncer de colon [26] y el cáncer del sistema nervioso [28]. En este estudio, el análisis de supervivencia univariante y multivariante indicó que ADAM-12 es probablemente un factor pronóstico independiente indica una peor supervivencia en pacientes con CPCP. Aunque ADAM-12 se sobreexpresa en numerosos tumores, ADAM-12 como marcador diagnóstico específico sólo se ha utilizado para el cáncer de mama [22].