Extracto
Una lista creciente de microARN (miARN) muestran patrones de expresión aberrantes en el carcinoma hepatocelular (HCC ), pero los mecanismos de regulación siguen siendo en gran medida poco clara. la edición de ARN catalizada por miembros de la adenosina desaminasa que actúa sobre la familia de ARN (ADAR) podría apuntar a los precursores miARN y afectar el proceso de biogénesis. Por lo tanto, investigamos si la edición del ARN podría ser un mecanismo que contribuye a la desregulación de miRNAs específicos en el CHC. Por la sobreexpresión de ADARs individuales en células de hepatoma, la edición del ARN en los precursores de 16 miRNAs frecuencia desregulados en HCC se proyectó por una plataforma de fusión sensible de alta resolución. Los resultados identificaron precursores de ARN de miR-214 y miR-122 como posibles objetivos editado por ADAR2. Un subconjunto de HCC que muestra elevada ADAR2 verificó las principales ediciones identificadas en ARAR2 sobreexpresa células de hepatoma, ya sea con la A a la I o cambios de U-a-C. La inusual de edición de U-a C en residuos específicos se demostró que se atribuyen a la A-to-I edición de las transcripciones de ARN complementarias a la pri-miRNAs. El evento de edición provocó una disminución de la transcripción de ARN complementaria a pri-miR-214, que dio lugar a la disminución de la pri-miR-214 y miR-214 y dio como resultado el aumento del nivel de proteína de su novela Rab15 gen diana. En conclusión, el presente estudio descubrió edición mediada por ADAR2 de las transcripciones antisentido complementarios como un nuevo mecanismo para la regulación de la biogénesis de miRNAs específicos durante hepatocarcinogénesis
Visto:. Liu WH, Chen CH, Yeh KH, Li CL, Wu YJ, Chen DS, et al. (2013) ADAR2 mediada Edición de miR-214 y miR-122 Precursor y ARN antisentido transcripciones de los cánceres de hígado. PLoS ONE 8 (12): e81922. doi: 10.1371 /journal.pone.0081922
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 31 de julio de 2013; Aceptado: 17 de octubre de 2013; Publicado: December 27, 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación para productos biofarmacéuticos, Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC102-2325-B-002-032-), y el Consejo Nacional de Investigación de la Salud Institutos, Taiwán (INDH-EX100-9832BI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son los ARN no codificantes endógenas identificados como reguladores de la expresión génica postranscripcional. Se encuentran con frecuencia creciente número de miRNAs a ser desregulado en el CHC, y algunos han participado en el proceso carcinogénico a través de la orientación de genes celulares específicos implicados en la proliferación del tumor, la apoptosis y la metástasis [1], [2].
se han reportado varios mecanismos que contribuyen a la expresión aberrante de miRNAs en los tumores. Además de los cambios genómicos o epigenéticos, defectos del proceso de biogénesis miARN se consideraron también implicado en la desregulación, ya sea transcripcionalmente por factores de transcripción específicos o posttranscriptionally por factores de procesamiento [3]. Aumento del número de factores que participan en los pasos biogénesis posttranscriptional han sido identificados, incluyendo los factores generales para todos los miRNAs (como Drosha, DGCR8, y Dicer) [4] y los factores específicos para un subconjunto de miRNAs (tales como P53, TRBP2, KSRP, p68 /p72, Lin28B, y otros) [5], [6]. Además de estos factores, se ha considerado que la edición de ARN podría ser otro mecanismo para regular el nivel posttranscriptionally miARN en los tumores.
resultados de la edición del ARN en un cambio de secuencia de ARN, que es diferente de la codificada por el genoma y contribuye a la diversidad de los productos de proteína [7]. En los seres humanos, este evento está mediado por enzimas de Adar, incluyendo ADAR1 y ADAR2, que catalizan la desaminación de la adenosina a inosina (A-a-I) en el ARN de doble cadena [8]. Se han identificado dos isoformas ADAR1 por el uso promotor alternativo que ADAR1S codificar y ADAR1L [7], [8].
Además de los genes que codifican las proteínas, los ADARs podrían también apuntar a los genes miARN precursores, ya sea la primaria o pre-miRNAs, que contienen las estructuras de tallo-bucle como sustratos favorables para la maquinaria de edición. Con la ayuda de análisis de secuenciación de alto rendimiento, se ha estimado que ~ 20% de los pri-miRNAs humanos se editan [9]. Tales eventos de edición tienen el potencial de afectar la función de miRNAs, incluyendo la estabilidad de los precursores, la eficacia de procesamiento durante la biogénesis, o incluso la selección de genes diana [10], [11]. Esta posibilidad ya ha sido bien demostrado en varios miRNAs específicos. Por ejemplo, pri-miR-142 se encontró editado por ADAR1 y ADAR2
in vitro
, lo que llevó a la supresión de su procesamiento por Drosha. Otro ejemplo proviene de la edición de pri-miR-151 por ADAR1, que inhibe la pre madurar-miR-151 de procesamiento mediante el bloqueo de su escisión por Dicer [12].
En el presente estudio, hemos tratado para investigar si la edición de ARN por ADARs se produce para la regulación del procesamiento de miRNAs relacionados con HCC. Como un estudio piloto, se espera que los resultados podrían ayudar a entender si los eventos de edición de ARN contribuyen a la expresión desregulada de miRNAs específicos en hepatocarcinogénesis.
Materiales y Métodos
Construcciones de plásmidos
los clones de cDNA para ADAR1L humana y ADAR2 se compraron de gene Collection mamíferos (MGC, NIH, EE.UU.), y el ADAR1S se subclonó a partir ADAR1L clon. Estos fragmentos de ADNc se convirtieron en pCMV.SPORT6 vector y luego procedieron además a clonar en el vector lentiviral de pLenti6 /V5-DEST utilizando System ™ Tecnología Gateway (Invitrogen Life Technologies Inc.).
El pLKO.1 -siLuc y pLKO-1-siGFP construcciones impulsadas por el promotor U6 se obtuvo del Fondo para el ARNi Core en la Academia Sinica, Taiwán (Taipei, Taiwán). Además, varios plásmidos vector basado en siRNA pLKO.1 se construyeron por inserción de la secuencia de siRNA en el vector pLKO.1-siLUC en los sitios de restricción de AgeI y EcoRI. Las secuencias para cada uno de los insertos siRNA contra las transcripciones sentido y antisentido de miR-214 y miR-122 se enumeran como sigue. siRNA para el miR-214: 5'-CCTTTGCTCATAGACAGATAC-3 '; siRNA para AS-miR-214: 5'-GTATCTGTCTATGAGCAAAGG-3 '; siRNA de miR-122: 5'-CCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ', siRNA para AS-miR-122: 5'-TGCCAAGACATTTATCGAGGG -3'. Los detalles para la preparación de los lentivirus que expresan ADARs o siRNAs específicos fueron como se describe anteriormente [13].
Para construir los plásmidos que expresan bien el sentido o las transcripciones antisentido complementarios de pri-pri-miR214 y miR122 en células de cultivo, hemos clonado los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico de células Huh-7 en el vector de pCMV.SPORT6. Los conjuntos de cebadores fueron diseñados para comprender el precursor de miARN con ~ 200 bases que se extiende a ambos 5 'y 3' que flanquean la secuencia de cada miRNA. Las mutaciones de los residuos específicos en estas construcciones, como A-34G y A-27G para la pri-AS-miR-214 y A-7G por pri-miR-122, fueron introducidos por mutagénesis dirigida al sitio usando el QuickChange II dirigida al sitio Mutagénesis Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX), siguiendo las instrucciones del fabricante.
la construcción informadora pGL3-Rab15-3'UTR, que contiene 3'UTR del gen Rab15, se construyó insertando el fragmento de ADN de cubierta Nuevo Testamento. 1~714 de 3'UTR del gen Rab15 (nt. 1 de 3'UTR como el primer nucleótido después del codón de parada de Rab15, en el nt. Posición 709 de Rab15 transcripción, NM_198686) en pGL3-Promotor vector (Promega, Madison, WISCONSIN). El inserto de ADN se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de las células Huh-7 con los cebadores de 5 'GGTCCGTCTAGACAGAGCTGGTGCTGCAGGCCCAT-3' y GGTTCTTC-3 5'-GAAGGCTCTAGACGAGGCAGGGTGGAG '.
de fusión de alta resolución Análisis (HRM)
HRM es una potente herramienta desarrollada para la detección sensible a la variante de la secuencia, utilizando la propiedad del ADN de la separación de calor en presencia de colorantes fluorescentes de saturación, tales como el tinte de fusión de alta resolución (Roche Diagnostics Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania) utilizado en este estudio. Los fragmentos de ADN heterodúplex se pueden distinguir de los homocigotos, mostrando una curva de fusión en forma diferente [14]. Esto permite la detección de cambios de pares de bases individuales en fragmentos de ADN de hasta 400 pb de la fusión de análisis de la curva. análisis de gestión de recursos humanos es, pues, conveniente para nuestra identificación de los cambios de nucleótidos provocadas por la modificación de los eventos pre-miRNAs (~ 100 pb en promedio) guía.
Los cebadores fueron diseñados para cada miARN utilizando el software de diseño de la sonda LightCycler, con las secuencias resumen en la tabla S1. Las longitudes de cada uno de amplificación eran ~ 200 bps, que cubren todo el pre-miRNAs con al menos 50 pb que se extiende a 5 'y extremos 3'. La amplificación y gestión de recursos humanos El análisis por PCR se llevó a cabo por el LightCycler® 480 (Roche Diagnostics Ciencias Aplicadas), con detalles como se describe [15].
Los productos de PCR que contienen los fragmentos de heterodúplex fueron identificados por la que muestra la diferencia relativa de la señal de las curvas de fusión en comparación con los amplificada por el ADN genómico de células Huh-7 (como el estándar sin edición), utilizando el software de exploración de genes (Roche Diagnostics Applied Science). Para evitar los resultados positivos falsos causados por las variaciones de ensayo, hemos establecido los valores de corte para cada uno de amplificación mediante el análisis de la diferencia relativa de la señal entre los productos de PCR a partir de 12 repeticiones de reacción de PCR con Hu-7 ADN genómico como molde, que era & lt ; 3,5 en todos los casos. Por lo tanto, los valores de corte para la diferencia relativa de la señal se establecieron como 5 en nuestro análisis.
Sujetos de estudio
Los tejidos del hígado de los varones relacionados con pacientes con CHC 20 VHB recogidos en el cáncer de hígado Taiwán red (TLCN) se incluyeron en este estudio. El ADN y el ARN de la de los tejidos hepáticos no tumorosas adyacentes de cada paciente tumoral y emparejado se utilizaron para la transcripción inversa y las reacciones de PCR. A continuación, el producto de PCR se procesó para el análisis de la secuencia, con el objetivo de identificar los residuos con edición de eventos putativos. Las muestras quirúrgicas fueron resecados rápidamente mantuvieron en nitrógeno líquido hasta la extracción de ADN y ARN. La Junta Institucional de la Universidad Nacional de Taiwán Hospital de Revisión aprobó el uso de estos tejidos archivados y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la inscripción.
La cuantificación de Pri-miARN maduro miRNAs y
El ARN total fue aislado de las células con el reactivo Trizol (Rezol C & amp; T, Protech, Taipei, Taiwán) y luego procesados para la transcripción inversa utilizando el One-Step RT-PCR System Superíndice III (Sistema de Síntesis de Superscript® III primer capítulo, Invitrogen, Carlsbad, CA), para la posterior cuantificación de los pri-miARN. Las mezclas de reacción de transcripción inversa contenía 1 g de ARN, 10 M de cebador específico, 5'-ATATCAGATGAACCTTCTTGCTC-3 'para el pri-miR122 y 5'-GGTTGTAGCTCTTGGTGTAGATG-3 para pri-miR-214, con los detalles de reacción como se describe [ ,,,0],13].
El qPCR se llevó a cabo por LightCycler FastStart DNA Maestro SYBR Green I Kit (Roche, Mannheim, Alemania) en la máquina LightCycler PCR con los detalles tal como se describe [13]. Los cebadores utilizados para la amplificación específica de pri-pri-miR214 y miR122 se enumeran como sigue. Pri-miR-214: 5'-GTATCTGTCTATGAGCAAAGGAAACC-3 'y 5'-GGTGTAGATGCTATGGTGTGAGGGC-3'; pri-miR-122: 5'-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 'y 5'-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3'
La cuantificación de la madurez de miR-214 y miR-122 se ha realizado mediante el miARN Kit de ensayo TaqMan (TaqMan® microARN. Transcripción inversa Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. U6 RNA se utilizó como control interno para la determinación del nivel de expresión de los genes miARN en relación con detalles como se describe [13].
Análisis capítulo específico QRT-PCR
El capítulo específico de QRT-PCR para la primaria transcripción de pri-miR-122 y miR-pri-214, así como sus transcripciones antisentido complementarios, se llevaron a cabo siguiendo el protocolo descrito por Ho
et al
[16]. En resumen, 2,5 ug de ARN extraído de células o tejidos se procesó para la reacción de transcripción inversa (RT) por cebador específico de hebra; y luego el producto específico RT hebra se utiliza para el análisis de qPCR. Los cebadores específicos diseñados para hebras pri-miR-122 y miR-pri-214 son miR-122S: 5'-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 'y miR-214S: 5'-GTCTGCCTGTCTACACTTGCTG-3'; y los diseñados para los transcritos complementarios son miR-122AS: 5'-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3 'y miR-214AS: 5'-AGGCTGGGTTGTCATGTGACTG-3'. Se utilizó el mismo conjunto de cebadores para la reacción de RT capítulo específico para el posterior análisis de qPCR con detalles como se describe [13].
TA Clonación y análisis de secuenciación
Los productos de RT-PCR de la Lenti células infectadas con -ADAR2 se purificaron mediante extracción en gel y se clonaron en el yT & amp; A vector (Yeastern Biotech Co. Ltd., Taipei, Taiwan) por clonación TA. Los clones positivos que contenían insertos fueron procesados para el análisis de secuenciación para detectar los cambios de nucleótidos, en comparación con la secuencia de las muestras de control sin ADAR2 sobreexpresión.
Cultura
Cell, transfección, Luciferase reportero de ensayo, y Análisis de transferencia Western
Dos líneas celulares de hepatoma HepG2 y células Huh-7, fueron adquiridos de BCRC (bio-Recogida y Centro de Investigación, Taiwán, http://www.bcrc.firdi.org.tw). El genotipo de estas dos líneas celulares ha sido autenticado por BCRC usando AmpFI STR Identifiler PCR kit de amplificación de Applied Biosystems para un amplio análisis de ADN STR PCR, con los perfiles idénticos con los datos de la ATCC. Los detalles para el mantenimiento de células, transfección, ensayo indicador de luciferasa, y el análisis de Western blot fueron como se describe anteriormente [17]. Los anticuerpos utilizados para el análisis de transferencia de Western incluyen anti-ADAR2, anti-GUTL1, anti-IGF-1R, y anti-Rab15 (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-ADAR1 (Abnova, Taoyuan), y anti-β-actina (Sigma, St. Louis, MO).
resultados
Edición de miR-214 y miR-122 Precursores en células Huh-7 por la sobreexpresión de ADAR2
Para examinar Si la edición de ARN contribuye a la expresión aberrante de miRNAs específicos en hepatocarcinogénesis, 16 miRNAs informaron reproducible como desregulado en el CHC (Tabla S1) fueron elegidos para nuestras pruebas si fueran sustratos editado por ADARs. Tomamos el enfoque mediante la sobreexpresión lenti-ADARs individuales en las células Huh-7, incluyendo ADAR1S, ADAR1L, y ADAR2, y luego se examina si la edición de ARN causó ningún cambio de nucleótidos en los precursores de estos miRNAs. La expresión de la proteína aumentado de ADARs individuales se verificó primero por análisis de transferencia Western (Fig. 1A). El ARN fue extraído a partir de células que sobreexpresan ADARs individuales para RT-PCR y análisis de HRM posterior.
(A) Las células fueron infectadas (mock), infectados con lenti-SH-luc (control negativo), o infectado con la lenti-ADAR1S, ADAR1L, y ADAR2 individualmente. Los lisados celulares se procesaron para la transferencia Western mediante el sondeo con el ABS, como se indica en la parte inferior de cada panel. Los resultados de gestión de recursos humanos para el miR-214 (B) y miR-122 (C). Los datos en bruto para las señales relativas se muestran en el panel superior; y la diferencia de la señal con respecto al comparar con la norma "sin edición" se muestran en el panel inferior. Las estructuras de bucle madre para la pre-miR-214 (D) y pre-miR-122 (E) se ilustran esquemáticamente, con los nucleótidos correspondientes a madurar miRs marcadas con verde. Las posiciones de los nucleótidos modificados por la sobreexpresión de ADAR2 están marcados en rojo, con los números que muestra sus posiciones con relación a la primera de nucleótidos de miRs maduras (como la posición no. 1). Los resultados resumidos de los cambios de nucleótidos en precursores de estos dos miRNAs se muestran en el panel de la derecha, por la secuenciación de 100 clones de clonación TA de los productos de RT-PCR amplificados por el ARN de las células infectadas por el ADAR2 Lenti.
el producto de PCR amplificado por el ADN genómico de células Huh-7, que al parecer no es el objetivo de ADARs, sirve como el estándar "sin edición" para el análisis de gestión de recursos humanos. Mediante la comparación con un estándar de este tipo, se calcularon las señales relativas puntuaciones para cada uno de los 16 miRNAs de las células infectadas con lenti-ADARs individuales, con los resultados que se resumen en la Tabla S2. Las curvas de fusión aberrantes, que muestra el score & gt relativa de la señal; 5, fueron identificados en los productos de RT-PCR amplificados por pri-miR-214 y miR 122 pri-ARN-precursoras extraído de células infectadas por el ADAR2 Lenti (figura 1B para MIR. -214 y la Fig. 1C de miR-122). Los resultados indicaron que la sobreexpresión ADAR2 puede introducir algunos desajustes en las transcripciones de pri-miR-214 y miR-pri-122, lo que sugiere que podría ser los precursores de los sustratos para ADAR2.
Para identificar además los residuos específicos en el transcritos primarios de estos dos miRNAs editado por ADAR2, los productos de RT-PCR a partir de las células infectadas con lenti-ADAR2 se procesaron para TA-clonación y el análisis posterior secuenciación se llevó a cabo en 100 clones para cada pri-miARN. Se identificaron varios cambios de nucleótidos recurrentes que ser diferente de la secuencia de muestras sin ADAR2 sobreexpresión. Higo. 1D (por pri-miR-214) y en la Fig. 1E (por pri-miR-122) ilustra esquemáticamente sus posiciones relativas a la miRs madura, que también resume el porcentaje de estos cambios de nucleótidos en los clones secuenciados. Los cambios más frecuentes se produjeron con el haplotipo de T-28C /U-37C para el pri-miR-214 (en ~ 50% de los clones) y con el haplotipo de A-7G por pri-miR-122 (en ~ 30% de clones).
ADAR2 Elevación correlacionada con los cambios de nucleótidos en los residuos específicos de Pri-miRNAs en HCC tejidos
a continuación, se examinó si las meditadas-ADAR2 cambios de nucleótidos recurrentes identificados en células Huh-7 también ocurrió en muestras clínicas. El ADNc a partir de 20 pares de HCC y sus correspondientes tejidos adyacentes nontumorous se analizaron por secuenciación directa de sus productos de RT-PCR de los transcritos primarios de pri-miR-122 y miR-pri-214. Tres HCC tejidos mostraron claros cambios de nucleótidos (Fig. 2,. Ninguno de los pacientes 11, 13 y 20), con los cambios de U-C a -37 a -28 y de pri-miR-214 (Fig. 2A, revelado como una -to-G cambios de secuenciación con el cebador inverso), y un cambio de la a a la G a -7 de pri-miR-122 (Fig. 2B, revelaron as-a-G a cambia por secuenciación con el cebador directo) . Tales cambios no se producen en el producto de PCR a partir de ADN genómico de los mismos tejidos HCC (datos no mostrados). Curiosamente, estos cambios de nucleótidos fueron los mismos que los más importantes identificados en los sobreexpresados-ADAR2 Huh-7 células (Fig. 1D, 1E), el apoyo a estos eventos de edición también podrían ocurrir en muestras clínicas. Es de destacar que estos cambios de nucleótidos específica se produjo principalmente en los tumores, pero poco en los tejidos adyacentes nontumorous de estos pacientes (Fig. 2A y 2B, NT vs. T), lo que sugiere esto como un evento ocurre preferentemente en los tumores.
los resultados de la secuenciación representativos de miR-214 (A) y miR-122 (B), con los productos de RT-PCR de cuatro pares de HCC tejidos como se indica. Los residuos de nucleótidos con los cambios en los tejidos tumorales (T), en comparación con los de los tejidos no tumorosas correspondientes (NT), están marcados con flechas rojas. Las posiciones relativas a la de los miRNAs maduros se indican por encima de las flechas. (C) Los niveles relativos de expresión de mRNA ADAR2 en estos tejidos HCC se determinaron por análisis de qPCR, con los resultados cuantitativos se muestran como en relación con el nivel de la parte NT de ningún paciente. 8. (D) La expresión de la proteína de ADAR2 y ADAR1 en estos cuatro pares de HCC tejidos fue examinado por Western Blot.
Desde nuestros
in vitro
estudios demostraron que estos cambios de nucleótidos podría ser causada por la sobreexpresión ADAR2, examinamos si ADAR2 fue elevada en HCC que muestra los cambios específicos de nucleótidos. Los niveles de expresión de ARN y la proteína de ADAR2 en estos tres pares de HCC fueron examinados por qPCR y de transferencia de Western, con un par de los HCC sin ningún cambio de nucleótidos como el control (paciente no. 8). Tanto el ARN y los niveles de proteína de ADAR2 fueron significativamente elevados en los tejidos HCC de estos tres pacientes, pero no en el caso de control (Fig. 2C, 2D). Los resultados sugieren que los eventos de edición de ARN mediada por ADAR2 también pueden ocurrir en un subconjunto de HCC, que se asocia bien con el aumento de la expresión de ADAR2.
Edición de ARN transcritos complementaria al ARN transcripciones de Pri-miR 214 y Pri-miR-122
está bien documentado que la edición de ARN por ADAR2 causa principalmente los cambios a-to-i /(G) [8]; Sin embargo la mayor parte de los cambios de nucleótidos que hemos identificado para la pri-miR-214 y precursores 122 pri-miR-en las células Huh-7-sobreexpresados ADAR2 eran cambios de U-a C, a excepción de uno en la posición -7 de miR-122 (Fig . 1D y 1E). Puesto que tales inusuales cambios de U-a C son complementarios a los cambios esperados de la A a G, hemos propuesto la posibilidad de que la edición mediada por ADAR2 A-to-I podría ocurrir en las transcripciones de ARN complementarias a estos dos pri-miRNAs.
Para probar esta posibilidad, se tomó el enfoque mediante la sobreexpresión o bien el pri-miR-214 /pri-miR-122 (sentido) o de sus transcritos de ARN complementarias (antisentido) en células Huh-7 de forma individual, en combinación con la sobreexpresión de ADAR2. Tal diseño puede ayudar a distinguir los eventos de edición en cualquiera de los pri-miRNAs o las transcripciones antisentido complementarios. Bajo la sobreexpresión de cualquiera de las transcripciones de los dos pri-miRNAs (& gt; 50 veces, revelada por el análisis qPCR), se encontró que ADAR2 podría inducir T-to-C cambia sólo en las células que sobreexpresan las transcripciones antisentido complementario (figura 3A,. -28 y -37 para AS de miR-214; Fig. 3B, 57 para AS de miR-122) .En contraste, se identificaron los cambios de la a a G sólo en las células que sobreexpresan el pri-miR-122 ( Fig. 3B, -7 de S de miR-122). Esto apoya que los cambios observados a-U-C podría ser debido a la mediada por ADAR2 A-to-I edición de las transcripciones de ARN complementarias tanto a pri-miRNAs. Estos cambios no se producen en las células infectadas con Lenti-ADAR1S o Lenti-ADAR1L, una vez más el apoyo a estos eventos de edición para estar mediados por ADAR2.
Las células Huh-7 fueron transfectadas con las construcciones de plásmidos que expresan bien el sentido (S) o el antisentido complementario (AS) transcripciones de pri-miR-214 (A) y pri-miR-122 (B), y después se infectaron con lenti-ADARs como se indica. El ARN fue extraído de cada preparación de células para la RT-PCR y análisis de secuenciación directa subsiguiente. Los resultados que se muestran aquí son representativos, centrándose en las regiones que abarcan los residuos identificados como los principales sitios de la edición (como se revela en la Figura 2), incluyendo -37 y -28 para el pri-miR-214 y -7 y 57 para los pri-mir -122 (marcados con flechas). Los residuos de nucleótidos que muestran eventos de edición están marcados con asteriscos rojos.
Desde general, el análisis de RT-PCR y secuenciación se utilizó anteriormente no puede distinguir los eventos de edición en sentido o antisentido transcripciones. por lo tanto tratamos de verificar el análisis específico A-to-I edición en antisentido transcripciones de pri-miR-214 por el capítulo específico de RT-PCR y secuenciación. ARN extraído de los tres HCC con ADAR2 elevada (Fig. 2, los pacientes 11, 13, y 20) fueron procesadas para la hebra específica RT-PCR, para amplificar los transcritos primarios de estos dos pri-miRNAs y también sus transcripciones antisentido complementarias, para el análisis de secuenciación. Es de destacar que, en células de neuroblastoma, Loebel et al. ya han informado de que el gen que codifica la miR-214 se encuentra dentro de un no codificante transcripción 7,9-kb complementaria a la región intrónica de dynamin-3 (DNM3), entre el exón 12 y 13 de este gen (Fig. 4A) [18]. Con la ayuda de las dos bases de datos, y GeneMark GENSCAN, una breve transcripción complementaria de miR-122 se ha predicho (Fig. 4B).
ilustración esquemática de las estructuras de genes de las transcripciones de ARN complementaria a (a) primaria miR-214 y (B) pri-miR-122. (C) Los resultados representativos para la secuenciación de los productos de RT-PCR específicos de cadena de HCC con la edición de eventos putativos en el sentido (S) y antisentido (AS) transcripciones de pri-miR-214 y pri-miR-122, centrándose en las regiones que cubren los sitios con posibles eventos de edición con la edición marcados con un asterisco rojo.
la secuenciación resultados mostraron que los eventos de edición se produjeron principalmente en las transcripciones complementarios a pri-miR-214, pero no en el transcripciones sentido en estas muestras de HCC (Fig. 4C, panel de la izquierda, -28 y -37 de pri-miR-214). Se apoyó que los cambios mediados por ADAR2-U a C se podrían atribuir a la A a la I edición de los transcritos complementarios de pri-miR-214 en muestras clínicas. Por el contrario, el caso de la edición en sitios con un patrón de la A a la G se produjo sobre todo en el sentido de transcripción en estos HCC (Fig. 4C, panel derecho, -7 de pri-miR-122).
ADAR2 mediada por la edición de la Transcripción del RNA complementario en Pri-miR-214 afecta funcionalmente el gen diana de miR-214
la siguiente cuestión es examinar el efecto funcional de la edición mediada por ADAR2 en la biogénesis de estos dos miRNAs. Para primero enfoque en miR-214, el efecto de la sobreexpresión ADAR2 en miR-214, así como sus precursores se analizó en células Huh-7, con las células que sobreexpresan ADAR1S y ADAR1L incluyeron como controles. El endógeno miR-214 se redujo significativamente por la sobreexpresión de ADAR2 pero no por ADAR1S y ADAR1L (Fig. 5A, panel izquierdo). Tanto pri-miR-214 y la antisentido complementario (AS) transcritos de ARN (endógeno) también se redujeron por la sobreexpresión de ADAR2 (Fig. 5A, medio y paneles de la derecha)
.
(A) El ARN extraído de Eh se utilizó -7 células infectadas con lenti-ADARs individuales tal como se indica para la evaluación de los niveles endógenos de miR-214 (izquierda), pri-miR-214 (en el centro), y la transcripción antisentido complementario de miR-214 (comp-AS-ARN ) (derecho). (B) Los lenti-ADARs individuales fueron infectadas a las células Huh-7, que ya fueron transfectadas con los plásmidos que expresan de forma exógena el pri-miR-214 o el transcrito antisentido complementario (comp-AS-ARN) como se indica. El ARN se extrajo para la cuantificación de los niveles de ambos transcritos en consecuencia. Las células (C) Huh-7 se transfectaron con el plásmido que expresa el tipo salvaje comp-AS-ARN, o los que la introducción de cualquiera de la única mutación como A (-37) G o mutaciones dobles como A (-37 /-28 )GRAMO. Los niveles de transcrito antisentido A continuación se determinaron mediante qRT-PCR. (D) Las células Huh-7 no estaban infectados (simulacro), infectados con el control Lenti-si-GFP (si-GFP), o infectados con Lenti-si-AS-214, que se dirige la transcripción de ARN complementaria a pri-mir -214, para evaluar los efectos sobre los niveles de expresión de los ARN-AS-(izquierda), pri-miR-214 (en el centro), y miR-214 (derecha). (E) Las células Huh-7 se transfectaron con el vector de control o el plásmido que expresa el comp-AS-ARN, para evaluar el efecto sobre los niveles de comp-AS-ARN (izquierda), pri-miR-214 (medio) y madurar el miR-214 (derecha). (F) Las proteínas extraídas de lisados Huh-7 células no infectadas o infectadas con Lenti-si-Luc o Lenti-pri-miR214 fueron analizados por análisis de Western Blot (izquierda). Las células Huh-7 transfectadas con pGL3-vector o pGL3-Rab15-3'UTR reportero construcciones fueron infectados con Lenti-si-GFP o Lenti-pri-miR214. El efecto sobre la actividad de reportero fue ilustrada en relación con la de las células pGL3-transfectadas con el vector infectadas con lenti-si-GFP (medio). Las proteínas extraídas de lisados de células Huh-7 o bien no infectadas o infectadas con diversos lentivirus que se describen fueron procesadas para el Western Blot, el sondeo con anticuerpos contra Rab15, ADAR1, ADAR2, y β-actina (derecha).
a fin de examinar los efectos de edición de cada transcrito de forma individual, el pri-miR-214 y transcripciones antisentido complementarios se sobreexpresa en células Huh-7 por separado, en combinación con ADARs individuales. Sólo el transcrito de ARN complementario se redujo en ADAR2 (Fig. 5B, panel izquierdo). Introducción de los cambios A-a-G en las posiciones -28 y -37 de la transcripción complementaria disminuyó su nivel de ARN, similar a la causada por la sobreexpresión de ADAR2 (Fig. 5C). Por lo tanto, demostró que ADAR2 podría provocar una reducción de la transcripción de ARN complementaria a pri-miR-214, a través de la A-to-I edición en sus residuos específicos de -28 y -37 posiciones.
Como señalamos , no hay un efecto directo de la ADAR2 en el sobreexpresada pri-miR-214 (Fig. 5B, panel derecho, carril 4), pero que causó una disminución del endógena-miR-214 pri (Fig. 5A, panel central, carril 4). Se planteó la posibilidad de que la edición de ADAR2 provocó una disminución de la transcripción complementaria, que a su vez disminuye la transcripción de ARN de pri-miR-214. Para hacer frente a esto, derribaron la transcripción de ARN complementaria a pri-miR-214 en células Huh-7 (Fig. 5D, panel izquierdo), lo que llevó a una disminución de la pri-miR-214 (Fig. 5D, panel central) . Un efecto regulador positivo de la transcripción complementaria en el nivel de pri-miR-214 fue por lo tanto implicado. En línea con esto, la sobreexpresión de ARN antisentido complementario aumentó tanto el pri-miR-214 y miR-214 madura (Fig. 5E).
A fin de examinar el efecto funcional del evento de edición mediada por ADAR2 en el gen diana de miR-214, se trató primero en identificar su gen putativo objetivo en los hepatocitos. Los algoritmos PicTar, TargetScan, y Miranda señalaron Rab15, un miembro de la familia del oncogén RAS, como un gen putativo objetivo de miR-214. Para probar esto, se sobreexpresa miR-214 en células Huh-7 por la infección con Lenti-pri-miR-214 lentivirus, lo que resultó en una disminución del nivel de proteína Rab15 (Fig. 5F, panel izquierdo). La infección de Lenti-pri-miR-214 también pudo reprimir la pGL3-Rab15-3'UTR la actividad de luciferasa (Fig. 5F, panel central), el apoyo que el miR-214 pudo reprimir la expresión de Rab15 través de la orientación de su 3'UTR. Por otra parte, la sobreexpresión de ADAR2, pero no ADAR1S y ADAR1L, causaron un aumento de Rab15 (Fig. 5F, panel derecho), lo que sugiere que el evento de edición mediada por ADAR2 tiene efecto funcional en el gen diana de miR-214.
la Transcripción del RNA complementario en Pri-miR-122 regula la expresión de nivel de miR-122
también se realizó un análisis similar para el miR-214 para hacer frente a los efectos de la edición mediada por ADAR2 de miR-122. En primer lugar, se evaluó el efecto de ADARs individuales sobre madura de miR-122 en células HepG2, pero no mostró efectos significativos (Fig. 6A). La introducción de la A a la G mutación en la posición -7 de la pri-miR-122 transcripción, el sitio editado importante, no provocó cambios significativos en el nivel de miR-122 (Fig. 6B). Por lo tanto, la edición mediada por ADAR2 en pri-miR-122 transcripción no afectó su proceso de biogénesis.