Extracto
El neuroblastoma (NB) patogénesis ha informado que estar estrechamente asociado a numerosas alteraciones genéticas. Sin embargo, los patrones de metilación del ADN subyacentes no han sido ampliamente estudiados en esta malignidad de desarrollo. A continuación, se generaron perfiles de metilación del ADN basada en microarrays de tumores primarios neuroblastic. Los análisis de metilación diferencial estricto supervisado nos permitió identificar los cambios epigenéticos característicos de los tumores NB así como para los subtipos clínicos y biológicos de NB. Hemos observado que la pérdida de genes específicos de metilación del ADN es más frecuente que la hipermetilación del promotor. Notablemente, tales hipometilación afectada funciones biológicas y los genes relacionados con el cáncer relacionados con la patogénesis NB como
CCND1
,
SPRR3
,
BTC
,
Opiniones y EGF
FGF6
. En particular, la metilación diferencial de
CCND1
afectó principalmente a una región evolutiva conservada funcionalmente relevante 3 'no traducida, lo que sugiere que la hipometilación fuera de regiones promotoras pueden desempeñar un papel en la patogénesis NB. La hipermetilación de genes objetivo implicados en el desarrollo celular y la proliferación, como
RASSF1A
,
POU2F2
o
HOXD3
, entre otros. Los resultados derivados de este estudio aportan nuevos biomarcadores candidato epigenéticos asociados con NB, así como conocimientos sobre la patogénesis molecular de este tumor, lo que implica una hipometilación de genes específicos de marcado
Visto:. Mayol G, Martín-Subero JI , Ríos J, Queiros A, Kulis M, Suñol M, et al. (2012) DNA Hipometilación afecta a las funciones biológicas y Genes Cáncer pertinentes y relacionadas con neuroblastoma en la patogénesis. PLoS ONE 7 (11): e48401. doi: 10.1371 /journal.pone.0048401
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |
Recibido: 7 Agosto, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Mayol et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Ministerio español de Sanidad (Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, 2007; PI070286) y la Sociedad Española contra el cáncer (Asociación Española contra el cáncer, 2007). G. M. con el apoyo de una beca del Hospital Sant Joan de Déu de Barcelona (Grant BR201102), S. G. por una donación de la Asociación NEN y J.I.M-S. estudios sobre epigenomics son apoyados por el Ministerio de Ciencia e Innovación (contrato RyC y SAF2009-08663) español
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el neuroblastoma (NB), el tumor extracraneal más frecuente en la infancia, es un tumor maligno complejo del desarrollo que se caracteriza por numerosas alteraciones genéticas biológicamente significativas que están íntimamente asociado con la evolución clínica de los pacientes [1]. Además de los cambios genéticos, el complejo y heterogéneo evolución clínica de NB depende en gran medida de la edad del paciente en el diagnóstico, así como características de la etapa e histopatológicos clínicos del tumor [1].
patrones de metilación del ADN alterado han sido ampliamente notificado a ser un factor crítico en el desarrollo y progresión del cáncer. En particular, la hipermetilación del ADN regional (hyperM) de las islas CpG en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores, así como mundial hipometilación (hypoM) que afectan repeticiones de ADN se consideran los cambios epigenéticos relacionados con el cáncer más frecuentes [2], [3]. Hasta ahora, la mayoría de los estudios se han centrado su atención en el papel y los mecanismos de promotor hyperM, ya que se cree que la pérdida de metilación del ADN a nivel mundial para afectar repeticiones de ADN y para ser principalmente involucrados en las funciones estructurales nucleares tales como la inestabilidad cromosómica [2].
a pesar de que está bien caracterizado el perfil genómico de NB, cambios en la metilación del ADN no han sido ampliamente estudiados en estos tumores. Varios genes han sido reportados como ser metilado en NB [4] - [9], sin embargo, el patrón de metilación del ADN en todo el genoma de NB sigue siendo en gran medida desconocido. El objetivo del presente estudio fue investigar el patrón de cambios epigenéticos en NB a nivel de todo el genoma utilizando microarrays de ADN específicas de metilación. Además de identificar los cambios a nivel mundial asociados con NB, que caracteriza los patrones de metilación de ADN asociadas con subtipos clínicos y biológicos distintos de la enfermedad. Curiosamente, se observó que la pérdida de genes específicos de metilación del ADN es más frecuente que el promotor hyperM. Tal hypoM afectada funciones biológicas y los genes relacionados con el cáncer relacionados con la patogénesis NB como
CCND1
[10].
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Un total de 25 tumores primarios neuroblastic (NT) incluyendo 22 NBS, 2 ganglioneuromas (GN) y 1 ganglioneuroblastoma (GNB) fueron utilizados para el análisis de metilación del genoma de ancho. Además, se utilizó una cohorte independiente de 13 NBS y 2 GN para pirosecuenciación bisulfito, los análisis de la expresión génica y el número de copias de ADN variación mRNA (Tabla 1 y la Tabla S1A). glándula GN y GNB, así como normal del cerebro fetal humano (FB) y adrenal (AG) tejidos se utilizaron como muestras de referencia. NB evaluación de riesgos se definió por el Sistema Internacional de Neuroblastoma Staging (INSS) [11]. Las muestras tumorales fueron evaluadas por un patólogo (EM), sólo los tumores con & gt; contenido de células de tumor viable 70% se incluyeron en el estudio. Se aisló el ADN a partir de muestras congeladas instantáneamente utilizando lisis celular Solution (Promega, EE.UU.) y proteinasa K (Sigma, EE.UU.) siguiendo los protocolos del fabricante
comunicado
Ética:. El estudio fue aprobado por el Institutional Research Comité de ética (Comité Ético de Investigación Clínica, la Fundación San Juan de Dios - CEIC-FSJD). Pacientes /padres /tutores firmaron un consentimiento informado antes de la recogida de muestras.
de todo el genoma de perfiles de metilación del ADN
perfiles de metilación del ADN se realizó utilizando el Infinium HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, EE.UU.). Genómico de conversión de bisulfito de ADN y la hibridación de la plataforma se llevó a cabo en la Unidad de Genotipado Humano en el Centro Nacional del Cáncer Español (CEGEN-CNIO, Madrid, España), como se describió anteriormente. Los datos fueron analizados utilizando el software BeadStudio (versión 3, Illumina Inc, EE.UU.) [12], [13]. Para cada sitio CpG se calculó la beta-valor (βvalue), que es una medida cuantitativa de los niveles de metilación de ADN que van desde 0 para completamente no metilado a 1 para las citosinas metiladas completamente. Las posibles fuentes de sesgos biológicos y técnicos que podrían afectar nuestros resultados como los CpG baja calidad en función del género y fueron excluidos del estudio [14] - [16]. La metilación de datos de microarrays se han depositado en la Expresión Génica Omnibus repositorio de datos (GSE39626).
ADN metilación diferencial análisis
Dado que no existe una estrategia de consenso para el análisis de metilación diferencial, hemos utilizado tres enfoques diferentes. En primer lugar, sitios CpG se clasificaron como hyperM cuando βvalues eran & lt; 0,25 en las muestras de referencia y & gt; 0,75 en al menos 10% de las muestras NB, y hypoM cuando βvalues eran & gt; 0,75 en las muestras de referencia y & lt; 0,25 en al menos 10% de las muestras N °. En segundo lugar, la metilación diferencial se definió βvalues como medias entre NB y muestras de referencia que muestran una diferencia absoluta mayor que 0,25 [17]. Por último, se realizó una prueba t no pareada usando bajada Permutación (SDP) [18] y la tasa de falso descubrimiento (FDR) análisis [19]. Los diagramas de Venn se utilizaron para comparar las listas de CpG metilados diferencialmente (http://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi) y sólo aquellos concomitantemente identificado por los tres criterios de clasificación se definieron como diferencialmente metilado.
la agrupación jerárquica y principal componente de análisis
Sin supervisión y supervisado agrupación jerárquica de aglomeración se realizaron utilizando la herramienta de análisis de conglomerados de grano de Estudio (versión 3, Illumina Inc, EE.UU.). Análisis de Componentes Principales (PCA) se realizó con R (www.r-project.org) utilizando el paquete FactoMineR disponible a través de Bioconductor.
pirosecuenciación bisulfito
Para validar los datos de metilación del ADN, bisulfito de pirosecuenciación ( se realizó BPS) análisis como se describe anteriormente [20]. Brevemente, el ADN genómico fue bisulfito convierte usando EpiTect Plus bisulfito de conversión Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un posterior amplificación por PCR se realizó usando cebadores biotinilados (Tabla S1B). Pirosecuenciación y el análisis de datos se realizaron con el analizador pyrosequencer PyroMark Q96 (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La expresión génica análisis
Para evaluar los niveles de expresión de los genes diferencialmente metilado, públicamente- disponibles conjuntos de datos de microarrays de expresión [21] - [23] se analizaron con espectros representativos de tumores NB. Los datos en bruto se normalizó a una transformación z-score. Se realizó un análisis de la prueba t no pareada ajustado por el SDP y FDR. Los genes con una expresión diferencial estadísticamente significativa (
p Hotel & lt; 0,01), z-score & gt; 1 en & gt; 50% de las muestras, fueron consideradas diferencialmente expresados
Para los genes candidatos, total. ARN del aislamiento y la cuantificación de la expresión génica se realizó durante 10 casos incluidos en la matriz de metilación y un conjunto independiente de 13 muestras NB utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) como se describe anteriormente [22] (Tabla S1 B).
anotación bioinformático de los genes diferencialmente metiladas
La base de datos para anotación, y Visualización integrada y Descubrimiento (DAVID) v6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) se utilizó para el gen de la anotación de enriquecimiento de análisis y mapeo vía biológica [24]. Probabilidad (Benjamini-Hochberg corrección) inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
genes diferencialmente metilado fueron clasificados en función de su localización cromosómica. Se realizó un análisis de distribución de probabilidad para determinar el potencial de enriquecimiento cromosoma.
P-valor
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
clasificación promotoras de los genes diferencialmente metilado en promotores con alta (HCP), intermedio (ICP), baja (LCP) y el contenido de CpG mixta, así como la identificación de Polycomb (PcG) genes diana se realizó como se informó anteriormente [14]
análisis de distribución de probabilidad hipergeométrica con una probabilidad de corte. & lt; 0,05, se llevó a cabo para determinar hyperM o hypoM enriquecimiento cromosoma y para determinar el tipo de promotor y el enriquecimiento PCG-marca en los genes diferencialmente metilado. Los análisis se realizaron con SPSS versión 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).
Resultados
perfiles de metilación del ADN y la identificación de los genes diferencialmente metilado en NB
Con el fin de investigar el patrón de metilación del ADN en NB, se analizaron 22 tumores primarios NB utilizando el microarray Infinium HumanMethylation27 BeadChip. Dos GN, 1 GNB, así como, los tejidos normales FB y AG humanos se utilizaron como muestras de referencia para identificar los genes diferencialmente metiladas específicas para NB.
Se realizó inicialmente un control de calidad de los datos obtenidos de los análisis de microarrays y excluidos los CpG 3337 baja calidad específicos de género. Además, una muestra de NB (NT18, Tabla S1 A) se excluyó debido a la mala detección de
p-valores
.
Principal no supervisada Análisis de Componentes (PCA) realizó en todas las muestras incluidas en el estudio, mostró que NB mostrar un perfil de metilación del ADN que se distinguen claramente en comparación con muestras normales de referencia (FB y AG) y el menos agresivo clínicamente GNB y GN benigna (Figura 1A), siendo estas dos entidades epigenetically indistinguible de muestras de referencia normales. Con el fin de identificar los genes diferencialmente metilado en NB, análisis supervisados se realizaron de forma independiente utilizando tres diferentes muestras de referencia (FB, AG y 2 GN con 1 GNB). Mediante la comparación de las listas de genes generadas por estos análisis hemos sido capaces de identificar un conjunto común de 351 genes, siendo 23 hyperM y 328 hypoM, en NB (Figura 1B, Tabla S2A). Este conjunto de genes que se hará referencia de aquí en adelante como genes NB-específicas. A continuación realizó un agrupamiento jerárquico supervisado y un PCA utilizando el gen hyperM y hypoM conjuntos por separado. Sorprendentemente, el patrón de metilación del ADN de genes hyperM nos permitió diferenciar los RN con diversa
MYCN
estado de amplificación. Curiosamente, los genes NBS hypoM segregados por su edad al momento del diagnóstico, la agrupación de los que tienen 5 o más años por separado de los pacientes más jóvenes (Figura 1C y 1D) guía
A:. Principal no supervisada Análisis de Componentes (PCA) de ADN basada en matrices metilación de datos en 21 neuroblastomas (NB) (clasificados de acuerdo a la etapa INSS), 2 ganglioneuroma (GN), 1 ganglioneuroblastoma (GNB); y las muestras de referencia normales: cerebro fetal (FB) y la glándula suprarrenal (AG). B: diagrama de Venn que muestra la estrategia usada para identificar los genes NB-específico. Hypermethylated y los genes hypomethylated en NB se determinaron utilizando tres diferentes supervisada análisis con muestras de referencia distintos (FB, AG y GN /GNB). C: Supervisado análisis de agrupamiento jerárquico de los datos de la metilación del ADN de genes específicos en NB-21 muestras, NB 2 GN, 1 GNB; y 2 muestras normales de referencia: FB y AG. D: Principal Supervisado Análisis de Componentes (PCA) en 21 muestras, NB 2 GN, 1 GNB; y las muestras normales de referencia:. FB y AG para los genes específicos NB-
Los genes NB-específicos se clasifican de acuerdo con el porcentaje de muestras encuentran diferencialmente metilado y el nivel de cambios βvalue. Los genes más claramente hyperM en nuestra serie fueron
EMP1
,
RASSF1A
,
ACTC
,
GNG12
,
HOXD3
,
PAMR1
,
IL17RC
,
CARD11
,
POU2F2
y
P2RY6 gratis (Tabla S2 B). Entre estos,
RASSF1A
y
POU2F2
han sido previamente descrito metilado en los tumores NB y líneas celulares. Aquí, ambos genes mostraron claramente aumentaron los niveles de metilación en ≥80% de las muestras NB, que es coherente con los informes anteriores [5], [7], [25]. Además, en nuestro conocimiento sólo
HOXD3
ha sido previamente descrito hyperM en el cáncer, específicamente en el carcinoma de próstata [26], [27].
La aplicación de la misma estrategia, 69 genes estaban claramente en hypoM NB (Tabla S2B). Cabe destacar que entre éstos se identificaron
CCND1
. Este gen se ha informado de que se altamente expresado en una porción significativa (& gt; 75%) de los tumores NB y líneas celulares [10], [28]. Las 17 CpG analizadas a través de la longitud de la
CCND1
locus reveló un patrón complejo epigenético en casos NB y muestras de control (Figura 2A). En NB, se observó una reducción de los niveles de metilación del ADN en 12 de 17 sitios CpG y una hipometilación significativa, utilizando criterios estrictos, solamente en dos CpG (ID de destino cg04717045 y cg02723533). Inesperadamente, se observó la pérdida de la metilación del ADN fuera de la región 5 'de
CCND1
, que era no metilado en casos NB y muestras de control. La hipometilación dentro del gen de cuerpo no se consideró significativo debido a la heterogeneidad epigenética en las muestras de referencia (Figura 2A). La región no traducida 3 '(3'-UTR), en contraste, fue metilado consistentemente en las muestras de referencia y hypomethylated en una gran fracción de NBS. En los dos sitios significativamente hypoM, 17 de 21 NB bajar de metilación en comparación con todas las muestras de referencia (βvalue & gt; 0,90), siendo 11 de ellos marcadamente hypoM (Figura 2A)
A: Representación gráfica de la. los niveles de metilación del ADN de los 17 CpG medidos a través de la
CCND1
longitud. El mapa de calor muestra los datos de 21 neuroblastoma (NB) y muestras de referencia (2 GN, 1 GNB; 1 FB 1 y AG). Debajo del mapa de calor mostramos algunas de las características genómicas de la
CCND1
locus (UCSC Genome Browser, los datos de la hg19 adaptado a la hg18) incluyendo factor de transcripción sitios de unión (TFBS), dominio conservado hipersensibles DNAseI evolutiva (cluster DNAseI) Vertebrados y Multiz alineamiento, Conservación PhastCons (Conservación de Mamíferos) y genes miARN sitios objetivo (TS). B: ADN pirogramas específicas de metilación de
CCND1
. El pyrogram anterior corresponde a una muestra de neuroblastoma mientras que el pyrogram abajo corresponde a una muestra de referencia (FB). el sombreado gris muestra el porcentaje de metilación CpG observado para los analizados. C: Box-plot para los datos de metilación del ADN de
CCND1
obtenido por pirosecuenciación bisulfito en una cohorte independiente de 13 NB y 2 GN muestras y muestras de referencia. D: niveles de mRNA expresión de
CCND1
ha analizado por QRT-PCR en dos cohortes independientes NB
cambios en la metilación del ADN en subgrupos clínicamente y biológicamente relevantes NB
A. supervisado enfoque se utilizó para analizar los perfiles de metilación del ADN diferenciales entre los subgrupos clínicos NB y biológicamente relevantes.
de alto riesgo (HR) NBS (n = 9), definido como la etapa 4 y
MYCN amplificado
(
MYCN
A) los tumores, se compararon con bajo riesgo (LR) NBS (n = 8), que incluye la etapa 1 a 3
MYCN
no amplificado (
MYCN
NA) tumores. Se identificaron un total de 19 genes diferencialmente metilado con claridad. Cinco genes eran hyperM en los recursos humanos respecto a LR NB y muestras de referencia, mientras que no se observó ningún gen hypoM en este subgrupo clínico. Por el contrario, hyperM no se observó en LR NB, mientras que 14 genes exhiben
de novo
pérdida de metilación en este subgrupo clínicamente favorable (Tabla S2C).
A continuación comparó los dos NB metastásico clínicamente relevante subgrupos, es decir, la etapa 4 (n = 6) y estadio 4S (n = 4) NB. Se identificaron un total de 9 genes diferencialmente metilado. De estos, 2 genes fueron hyperM en al menos 3 de 4 etapas 4S RN y no se detectó en la etapa 4 hyperM NBS. Con respecto a hypoM, se observaron 5 y 2 genes en el estadio 4S y 4 NB, respectivamente (Cuadro S2C).
La comparación de
MYCN
A (n = 5) y NA (n = 15 tumores), se identificaron 23 genes diferencialmente metilado (7 hyperM y 16 hypoM) en
MYCN
amplificado con respecto a los tumores no amplificados y muestras de referencia (Tabla S2C).
Por último, se compararon RN basado en la edad del paciente en el diagnóstico usando la establecida clínicamente-18 mes edad de corte, es decir, & lt; 18 meses (n = 11) y ≥ 18 meses (n = 10). De acuerdo con nuestros criterios de selección, no consistentemente se identificaron genes diferencialmente metiladas, muy probablemente debido a la gran heterogeneidad en ambos subgrupos. Basándose en el análisis PCA supervisado se muestra en la Figura 1D, se observó que los pacientes con 5 o más años de edad segregados por separado de los pacientes más jóvenes, lo que sugiere diferentes patrones de metilación subyacentes. Un análisis supervisado por tanto, se ha realizado mediante dos cortes de edad, 18 meses y 5 años (es decir, 0 a & lt; 18 meses (n = 12), ≥18months a & lt; 5 años (n = 4), mayores de 5 años (n = 5)). No se observaron diferencias entre los patrones de metilación de los tres subgrupos de edad. Sin embargo, la metilación fue heterogénea en pacientes menores de 5 años, pero claramente distintas de las de más edad NB pacientes (Tabla S2C). Aplicando solamente una edad de corte de 5 años (& lt; 5 años, n = 16 y ≥5 años, n = 5), hemos identificado un patrón de metilación del ADN claro que se caracteriza por un conjunto de genes con una pérdida constante de la metilación del ADN en pacientes menores de 5 años de edad en comparación con los pacientes de mayor edad, siendo similar a las muestras de referencia (Tabla S2C). éste
validación técnica y clínica de genes candidatos por pirosecuenciación
bisulfito de ADN pirosecuenciación de 3 genes candidatos NB-específicos (
EMP1
,
GNG12
y
CCND1
), así como de
EPSTI1
, que está metilado diferencialmente en NB clínicamente relevante subgrupos, se realizó para validar datos de la matriz de metilación de ADN. Dos tumores NB incluidos en el microarray, así como una cohorte independiente de 13 NB y 2 GN muestras se utilizaron para este fin. En primer lugar, el grado de correlación entre la metilación del DNA microarrays y datos de BPS se puso a prueba y resultó ser significativamente alta (r = 0,958,
p Hotel & lt; 0,001) (Figura S1)
De acuerdo con. los resultados de la matriz,
EMP1
y
GNG12
genes NB-específicos mostraron altos niveles de metilación en comparación con muestras de referencia en todos los casos NB del conjunto de validación (n = 13) (Figura S2 B y S2C ).
CCND1
mostró una clara pérdida de metilación en 10 de los 13 RN independientes ensayadas, que está en línea con la proporción de casos hypoM identificados por el array de metilación (Figura 2A, 2B y 2C, Figura S2A).
EPSTI1
análisis de metilación en la serie de validación también confirmó la matriz de datos (Figura S2D).
Asociación entre la metilación del ADN y la expresión génica
Para investigar si la metilación del ADN diferencial en NB se asocia con la expresión de genes, se analizaron los datos de expresión de genes publicamos de conjuntos independientes y representativas de tumores NB [21] - [23]. Expresión de datos estaba disponible para 13 de 23 hyperM y 136 de 328 hypoM genes NB-específicos (Tabla S3 A). Cinco de trece (38,4%) genes hyperM mostraron menores niveles de expresión en comparación con muestras de referencia. Por el contrario, 10 de 136 genes (7,3%) con los niveles de metilación más bajos fueron altamente expresado en NB en comparación con muestras de referencia. Estos resultados están en línea con los estudios previos informes que sólo una fracción de los genes con el promotor hipometilación muestran un aumento significativo en la expresión génica, siendo, posiblemente, condicionado a la activación específica [29] - [30].
Para validar si la metilación del ADN diferencial de NB se asocia con cambios en la expresión génica, se analizaron 5 genes candidatos de QRT-PCR en 23 RN con ARN disponible (10 casos incluidos en la matriz de metilación y un conjunto independiente de 13 muestras NB). En general, los genes hyperM mostraron niveles más bajos de expresión en muestras de NB en comparación con muestras de referencia. Del mismo modo, la mayoría de los genes hypoM mostraron mayores niveles de expresión en los tumores NB con respecto a muestras de referencia, lo que confirma los datos de microarrays (datos no mostrados).
fue encontrado CCND1
ser altamente expresado en todas las muestras NB, de acuerdo con informes anteriores [10], [31] (Figura 2D).
Características biológicas y funcionales de los genes diferencialmente metilado en NB
genes diferencialmente metilado se caracterizan funcionalmente utilizando enfoques bioinformáticos. Un análisis de la ontología de genes (GO) de los genes en hypoM NB permitió la identificación de enriquecido significativamente (
p Hotel & lt; 0,05) funciona como respuesta de defensa, respuesta inmune, proceso del sistema inmunológico, la respuesta al estímulo y desarrollo de la epidermis ( S3B Tabla). Debido al tamaño pequeño de la muestra, conjuntos de genes derivados de otras comparaciones no dio lugar a ningún plazo GO enriquecido significativamente.
La mayoría de los estudios en tumores de adultos han informado de que los genes hyperM se enriquecen en promotores con alto contenido de CpG (HCP) y genes diana PRC2 en células madre embrionarias (ESC) [17]. Cabe destacar que, en nuestra serie, el grupo de genes hyperM mostró una pérdida para los promotores de HCP (21,7%
vs.
53,5% en el fondo,
p = 0,072
) y un enriquecimiento de los promotores del PCI (34.78%
vs.
11,68% en el fondo,
p = 0,012
). No se observó enriquecimiento significativo para los objetivos PRC2 (13%
vs.
9,6% en el fondo,
p = 0,49
). En contraste, los genes hypoM mostraron el patrón se informó anteriormente [17], es decir, que se asociaron con un aumento de los promotores de bajo contenido de CpG (LCP) (68,3%
vs.
22,6% en el fondo,
p
. & lt; 0,001) y una disminución de los objetivos PRC2 (3,3%
vs
9,6% en el fondo,
p
. & lt; 0,001) (Tabla S3C)
Para determinar si la metilación diferencial en NB se produce de forma homogénea por todo el genoma, se analizó la distribución cromosómica de genes NB-específicos. Dado el pequeño número de genes hyperM importantes de enriquecimiento o tendencia agrupados se observó (Tabla S3D). Por el contrario, una parte significativa de los genes hypoM asigna a los cromosomas 1 (48 genes), 17 (25 genes), 19 (58 genes) y 21 (9 genes) (
p
& lt; 0,05 para todos) y mostró cromosoma localización específica. Estos genes mapeados a regiones cromosómicas específicas 1p36 (20%) y 1q21 (25%), el cromosoma 17p13 y 17q21 (ambos 27%), mientras que la mayoría de los genes identificados en el cromosoma 19 se limita a 19p13 (& gt; 70%; 43 de 58), y todos los genes del cromosoma 21 hypoM asignadas a 21q22 (9/9).
Dicussion
en el presente estudio, hemos analizado el patrón de metilación diferencial en muestras NB primaria utilizando microarrays análisis de la metilación del ADN basado. No supervisada PCA mostró que los perfiles de metilación del ADN en NB son claramente distintos de los de la GNB clínicamente menos agresivo y benigna GN y las muestras normales de referencia utilizados en este estudio (Figura 1A). el análisis de metilación del ADN diferencial utilizando criterios estrictos nos ha permitido identificar la metilación del ADN cambios característicos de los tumores NB. Curiosamente, se encontró que el patrón de hyperM y hypoM estar asociado con subgrupos clínica-biológicamente relevante de tumores NB. En concreto, el patrón de metilación del ADN de genes hyperM nos permitió diferenciar los RN con diversa
MYCN
estado de amplificación. HypoM genes segregados de los casos según la edad al momento del diagnóstico, la agrupación de los que tienen 5 o más años por separado de los pacientes más jóvenes (Figura 1D). el análisis de metilación del ADN supervisado comparando subgrupos clínicos NB conocidos confirmó la existencia de genes diferencialmente entre los tumores metilados alto y bajo riesgo,
MYCN
A partir de NA tumores, así como la etapa 4 de la etapa 4S NB. En informes anteriores se analizan los genes candidatos específicos han identificado genes asociados con hypermethylated
MYCN
estado de amplificación en líneas y tumores [4] NB celulares, lo cual corrobora la existencia de patrones de metilación del ADN específicas de los subgrupos en NB. Sin embargo, no se identificaron diferencias de metilación de ADN consistentes al comparar los subgrupos con el pronóstico clínicamente establecida la edad de corte de 18 meses. En contraste, de acuerdo con el análisis se muestra en la Figura 1D, se observó una pérdida constante de la metilación del ADN en pacientes menores de 5 años, en comparación con pacientes de mayor edad y las muestras de referencia (Tabla S2C). En NB, la edad al momento del diagnóstico es un potente marcador de comportamiento del tumor, y por lo tanto es crítico en la evaluación del pronóstico de este tumor maligno de desarrollo [32]. Tradicionalmente, la edad del paciente ha sido analizado como una función binaria, con un punto de corte establecido inicialmente a los 12 meses y recientemente ajustado a una edad más óptima pronóstico de corte de 18 meses [32]. Sin embargo, la Clasificación Internacional de Patología neuroblastoma (el sistema Shimada) evalúa el impacto pronóstico de las características histológicas del tumor teniendo en cuenta dos puntos de corte de edad en el momento del diagnóstico: 18 meses y 5 años [33]. Curiosamente, aunque hemos observado patrones de metilación del ADN relacionadas con la edad que recuerdan estos dos puntos de corte de edad, fueron más coherente utilizando los 5 años de corte.
En general, se observó que la pérdida de metilación del ADN es más frecuente que promotor hyperM en NB. Esto está en línea con el conocido hipometilación global del ADN de células de cáncer, en general, se cree que afecta a secuencias repetitivas y el ADN satélite y para contribuir a la generación de la inestabilidad cromosómica [2]. Por lo tanto, la hipometilación de genes específicos no ha sido ampliamente estudiado. Curiosamente, se observó que hypoM afectada genes relacionados con la patogénesis NB como
CCND1
. Ciclina D1 es una subunidad reguladora de quinasas dependientes de ciclina G1 necesarios para el ciclo celular /S de transición que se ha descrito altamente expresado en varios tipos de tumores sólidos, así como en más de 75% de NBS. La causa de
CCND1
sobreexpresión de estos tumores es en gran medida desconocido. amplificaciones de alto nivel de
CCND1
se han reportado sólo en un pequeño porcentaje (2%) de los tumores NB [10]. Por lo tanto, mecanismos distintos de la amplificación de genes parecen ser responsables del aumento de
CCND1
expresión [34]. Recientemente,
GATA3
, un factor de transcripción sobreexpresa en NB, se ha informado que estar implicados en
CCND1
sobreexpresión [35]. En este estudio, se observó pérdida de
CCND1
metilación de genes en más de 70% de los tumores NB analizados, asociada con altos
CCND1
niveles de expresión y la ausencia de la amplificación de genes (datos no mostrados) . Diferencialmente metilado CpGs no se localizaron en la región del promotor pero en la región no traducida 3 '(figura 2A). Curiosamente, en base a los datos disponibles en la UCSC Genome Browser (GRCh37 /hg19), la 3'-UTR de
CCND1
es un dominio conservado hipersensibles DNAseI evolutiva altamente enriquecido para sitios objetivo de microARN y los sitios de unión de factores de transcripción, incluyendo
GATA3
,
MYC
,
FOXA1 /2 Opiniones y
JUND
, entre otros. Los datos experimentales que apoyan el papel funcional de la región 3'-UTR en la expresión de
CCND1
han sido reportados en los linfomas de células del manto (MCL), donde además de la fusión de
CCND1
gen en el cromosoma 11 para la cadena pesada de inmunoglobulina potenciador, la pérdida de la 3'-UTR se ha relacionado con la hiper-proliferativa MCL [36]. Sin embargo,
CCND1
reordenamientos que conducen a la pérdida de la 3'-UTR se han observado sólo en un porcentaje muy pequeño de NBS [10]. Digno de mención, en nuestra serie
CCND1
hypoM se produce en presencia de
RASSF1A promotor
hyperM. Selectiva silenciamiento epigenético de
RASSF1A
es un evento común en el cáncer humano, incluyendo NB, donde se ha informado de hypermethylated en & gt; 75% de los tumores [5], [25]. Ras dominio de la familia asociación 1 isoforma A es un gen supresor tumoral que regula negativamente la proliferación celular mediante la inhibición de la ciclina D1 acumulación de proteínas a través de mecanismos posttranscriptional [37].
RASSF1A
hyperM anteriormente ha estado inversamente asociado con la expresión de ciclina D1 y la proliferación de células tumorales [38]. Por tanto, es tentador especular que la pérdida de
CCND1
metilación de genes en la región reguladora 3 'UTR y la hipermetilación concomitante de
RASSF1A
podría representar un mecanismo potencial subyacente
CCND1
la sobreexpresión de genes en NB.
Pérdida de metilación también afectó a los genes con funciones biológicas relacionadas con el cáncer, es decir,
SPRR3
, se informó anteriormente como hypomethylated en el cáncer, específicamente en el carcinoma hepatocelular [39]. La sobreexpresión de
SPRR3
ha sido reportado para promover la proliferación de mama y cáncer de colon mediante el aumento de la degradación de p53 a través de la
AKT
y
MAPK
vías [40], [41]. HypoM genes también afectados informaron de estimular la proliferación celular, es decir,
BTC
,
EGF
y
FGF6
. Betacelulina, miembro de la familia EGF, recientemente se ha informado de inducir la proliferación de las células madre neurales y prevenir la diferenciación espontánea en el cultivo celular a través tanto del receptor de EGF (
EGFR
) situado en NSC y
ErbB4
en neuroblastos [42]. El factor de crecimiento epidérmico también actúa a través de la EGFR para estimular la proliferación celular y la transformación neoplásica.