Extracto
Antecedentes
ADN circulante libre de células (cfDNA) en el plasma ha mostrado potencial como biomarcador en varios tipos de cáncer y podría convertirse en una fuente de importancia para la detección de mutaciones de tumores. Los objetivos de nuestro estudio fueron establecer un rango normal de cfDNA en una cohorte de individuos sanos y comparar esto con cuatro cohortes de cáncer colorrectal (CCRm) pacientes metastásicos. También se investigó el valor pronóstico de cfDNA y analizado el tumor-específica
KRAS
mutaciones en el plasma.
Métodos
El estudio fue una evaluación prospectiva de biomarcadores en cuatro fases consecutivas II de ensayos clínicos, incluyendo 229 pacientes con cáncer colorrectal metastásico refractario quimioterapia y 100 individuos sanos. El plasma se obtuvo a partir de una muestra de sangre-EDTA, y el número total de alelos de ADN y
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alelos mutados fueron evaluados utilizando un filtro en casa ARMS-PCR cuantitativa como se ha descrito anteriormente.
mediana de los niveles cfDNA fueron mayores en CCRm en comparación con los controles (p & lt; 0,0001). ROC análisis reveló una AUC de 0,9486 (p & lt; 0,00001). Los datos mostraron OS deteriorada con niveles crecientes de cfDNA de referencia tanto al categorizar pacientes por cuartiles de cfDNA y en grupos de baja o alta cfDNA basado en el rango normal superior del grupo de control (mediana de OS 10.2 (08/03 a 11/07) y 5.2 (4.6 a 5.9 ) meses, respectivamente, HR 1,78, p = 0,0006). El análisis multivariado confirmó un valor pronóstico independiente de cfDNA (HR 1,5 (IC 95% 1,3-1,7) por cada incremento en el cuartil cfDNA). La concordancia global de
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mutaciones en el plasma y el tejido fue alta (85%).
Conclusiones
Estos datos confirman el valor pronóstico de la medición cfDNA en el plasma y la utilidad de la detección de mutaciones mediante el procedimiento presentado
Visto:. Spindler KLG, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund I, Jakobsen a (2015) ADN circulante libre como biomarcador para la detección y la Fuente de mutaciones en el cáncer colorrectal metastásico. PLoS ONE 10 (4): e0108247. doi: 10.1371 /journal.pone.0108247
Editor Académico: Libing Song, Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer, CHINA
Recibido: 20 Julio, 2013; Aceptado: 27 Agosto 2014; Publicado: 13 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Spindler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este estudio fue financiado por el Counsil Vejle hospital de Investigación y Tryg Fonden. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, desicion de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer colorrectal
metastásico (CCRm) tiene un mal pronóstico ya pesar de las recientes mejoras resistencia a la terapia sigue siendo un reto importante. La búsqueda de mejores criterios de selección de la terapia junto con los nuevos regímenes de tratamiento potencialmente efectivo para la enfermedad resistente a la quimioterapia ha atraído considerable atención en la última década. Estos incluyen el desarrollo de nuevos agentes, la identificación de las alteraciones genéticas responsables de la resistencia y la búsqueda de biomarcadores para la orientación durante la terapia.
Se ha reportado la presencia de ADN circulante libre de células (cfDNA) en la sangre hace más de 60 años [1]. Se libera activamente de las células normales y fallecidos, y apoptosing necrotizante procesos, así como de las interacciones complejas entre células no tumorales adyacentes [2-5] y tumor. ADN libre de células se puede detectar en el suero, plasma y otros fluidos corporales [6], pero los mecanismos de liberación en el torrente sanguíneo y el origen del ADN están lejos de entenderse completamente. Para cualquier aclaración se requiere para hacer una distinción fiable entre los aumentos malignos y las variaciones no cancerosos en cfDNA.
Los estudios han sugerido que el nivel de cfDNA se incrementa tanto en pacientes con cáncer [7-8] y no en varios condiciones patológicas malignos en comparación con los individuos sanos. Sin embargo, un reciente meta-análisis demostró resultados inconsistentes [9]. Establecer un rango normal, por tanto, es un requisito previo para la investigación adicional de la función potencial de cfDNA como un marcador de diagnóstico, así como de su utilidad en la detección precoz de las recidivas.
ADN libre de células también se ha considerado un potencial marcador pronóstico para el resultado de varios tipos de cáncer [10]. Recientemente, se informó de que cfDNA celebró valor pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal metastásico [11-13]. Un elevado número de alelos cfDNA en el plasma se correlacionó consistentemente con una pobre supervivencia global (OS) en nuestros pacientes tratados con quimioterapia para el cáncer colorrectal metastásico thirdline, mientras que los pacientes con una baja concentración en plasma de cfDNA tuvieron una SG mayor mediana. La verificación de estos resultados en cohortes más grandes es altamente relevante para establecer el potencial clínico de cfDNA.
Además de su potencial como herramienta de diagnóstico y marcador pronóstico, cfDNA es también una fuente valiosa para la detección de mutaciones específicas del tumor en la circulación periférica de pacientes con cáncer [14-16]. En CCRm, hay una alta frecuencia de
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mutaciones, que son responsables de la resistencia a los anticuerpos monoclonales usados ampliamente dirigidos al EGFR [17]. El análisis molecular de las alteraciones genómicas se realiza normalmente en el tejido tumoral de archivo, pero ha habido preocupaciones de que este enfoque no refleja suficientemente la biología de la enfermedad en el momento del inicio de la terapia EGFR dirigida, que es a menudo varios años desde el diagnóstico primario y /o cirugía. Por otra parte, repetidas biopsias no son factibles por razones prácticas y éticas. Por lo tanto, el uso de cfDNA para detectar estas mutaciones específicas del tumor puede ser una adición atractiva para una mejor selección de pacientes para las terapias dirigidas en el futuro
.
Los métodos utilizados para la cuantificación de ADN han variado con el tiempo, que van desde simples qPCR métodos a tecnologías complejas radiante y secuenciación de próxima generación profunda [18,5]. La sensibilidad y especificidad del análisis han mejorado muchos pliegues ya que los estudios iniciales, pero los usos de los diferentes materiales y métodos para la cuantificación de muestreo cfDNA, además de informes inconsistentes, han complicado una comparación válida de los resultados de diferentes estudios. Los recientes avances en los métodos tecnológicos nos han permitido desarrollar un método qPCR altamente sensible para la cuantificación de cfDNA en muestras de plasma, que también es factible en el laboratorio. Esto nos ha permitido investigar el potencial biomarcador de cfDNA en una gran cohorte de pacientes con cáncer y controles sanos.
Los objetivos del presente estudio fueron establecer un rango normal de cfDNA en una cohorte de individuos sanos y para comparar esta gama cfDNA con los de cuatro diferentes cohortes de pacientes tratados por cáncer colorrectal metastásico. Además, el objetivo fue validar el valor pronóstico de los niveles previos al tratamiento de cfDNA y analizar el tumor-específica
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mutaciones en el plasma.
Materiales y Métodos
Estudio de diseño em
se estudió un total de 100 individuos sanos y 229 pacientes con CCRm. El estudio se realizó como un biomarcador investigación prospectiva en cuatro fases II y biomarcadores estudios consecutivos: el estudio cetuximab [11,20], la TIRASMUS (identificador de ClinicalTrials.gov, NCT00827684, [12], PG (identificador de ClinicalTrials.gov, NCT01109615 [ ,,,0],13] y GemCap (identificador de ClinicalTrials.gov, NCT01472770, [32] los ensayos llevados a cabo en el Departamento de Oncología, hospital de Vejle, Dinamarca, entre abril de 2005 y noviembre de 2012. los cuatro estudios de fase II incluyó a pacientes con enfermedad refractaria la quimioterapia y la recolección fue biomarcador prospectiva realizado.
el criterio de valoración principal fue la correlación de cfDNA a OS, la supervivencia libre de progresión secundaria (PFS) y la evaluación de la diferencia entre los controles sanos y pacientes con CCRm, además de la correlación entre el tumor KRAS (tKRAS) y . KRAS de plasma (pKRAS) de detección de datos se presentan de acuerdo con las directrices OBSERVACIÓN
los pacientes
los criterios de inclusión en los ensayos fueron similares:. histopatológicamente verificado estadio IV cáncer colorrectal metastásico, el fracaso del tratamiento después de la exposición a flouropyrimidine, oxaliplatino e irinotecán, indicación de tratamiento tercera o cuarta línea, el estado ECOG rendimiento (PS) de 0 a 2, y la función del órgano adecuado.
KRAS
y
BRAF
estado determinó su inclusión en los ensayos TIRASMUS y PG, pero no en los estudios de cetuximab o GemCap.
RECIST versión 1.1 y NCI-CTCAE versión 4.0 eran se utiliza para examinar los puntos finales en los estudios GemCap y PG, mientras que en los ensayos anteriores, se utilizaron los criterios RECIST versión 1.0 y NCI-CTCAE versión 3.0.
Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes del ingreso al estudio y la reglamentación pertinente y la ética comités (Agencia de Medicamentos danés y el Comité ético Científico regional para el Sur de Dinamarca) aprobó los estudios antes del comienzo. Los ensayos clínicos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Buena Práctica Clínica como son emitidos por la Conferencia Internacional sobre Armonización y la Declaración de Helsinki.
Tratamiento
El Estudio cetuximab.
El tratamiento que comprende irinotecán (350 mg /m
2) cada tres semanas, con semanal de 250 mg /m
2 de cetuximab (dosis de carga inicial fue de 400 mg /m
2), hasta la progresión o toxicidad inaceptable. Evaluación de la respuesta se realizó cada tres ciclos de tratamiento.
TIRASMUS.
Los pacientes recibieron tratamiento con el inhibidor de mTOR temsirolimus 25 mg cada semana hasta la progresión. Posteriormente, los pacientes fueron tratados con terapia de combinación que comprende cada dos semanas irinotecan (180 mg /m
2) y temsirolimus semanalmente hasta la progresión o toxicidad inaceptable. Evaluación de la respuesta se realizó cada 6 semanas.
PG.
Los pacientes recibieron pemetrexed (inicialmente 500 mg /m
2 Q3W) + gemcitabina (1250 mg /m
2 días, 1 y 8) hasta la progresión o toxicidad inaceptable. Evaluación de la respuesta se realizó cada tres ciclos de tratamiento.
GemCap.
Los pacientes recibieron capecitabina (2000 mg /m
2, 1-7 días, cada 2 semanas) en combinación con gemcitabina (1000 mg /m
2, día 1) hasta la progresión o toxicidad inaceptable, y la respuesta se evaluó cada 12 semanas.
grupo de control sano
la cohorte individuo sano se selecciona del Biobanco Diabetes Vejle (aprobado por la Agencia danesa de Protección de datos (revista no. 2006-53-1385) y el Comité Científico danés (ID del proyecto S-20080097)).
los individuos fueron seleccionados en base a los grupos de edad, y The Danish National Registro paciente se accedió para ICD-10 códigos para asegurar una significativa falta de co-morbilidad (CIE-10 C, D, I y códigos M). El consentimiento informado se obtuvo de cada individuo para el uso de muestras de sangre, y el estudio aprobado por el Comité Ético Científico Regional para el Sur de Dinamarca para este análisis adicional marcador.
Toma de muestras para estudios de investigación translacional
Recolección de muestras de sangre y tejidos del tumor primario para la investigación traslacional es un procedimiento estándar en los ensayos realizados en nuestro departamento. Después de consentimiento informado, muestras de sangre pre-tratamiento se extrajeron antes de la primera ciclo de terapia. Los métodos para la cuantificación de cfDNA y mutado
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alelos en el plasma se han descrito anteriormente [11], y la información de cebadores y sondas están disponibles en línea. El plasma se obtuvo a partir de muestras de sangre recogidas en EDTA-tubos y se centrifugó a 2000
g
de 10 min a 2 horas de recogida, antes de ser almacenado a -80 ° C hasta su uso. Se analizaron todas las muestras, cegados a los puntos finales del estudio.
purificación de ADN
ADN fue purificado de 1 ml de plasma usando un virus QIAsymphony /midi-kit de bacterias en un robot QIAsymphony (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADN se eluyó en 110 ul. tampón AVE, que se suministra con el kit.
-Cell libre de la cuantificación de ADN
Para determinar el nivel de cfDNA, la cantidad del gen peptidylprolyl isomerasa A (ciclofilina A) gen gCYC, HUGO ( ppia abreviatura) se midió mediante un ensayo qPCR en la casa como se describe en [11]. Los ensayos se realizaron en dublicates o triplicado y se utilizó 5 ul de DNA en cada reacción 25 ul de PCR. Para cada PCR una piscina de ADN genómico se incluyó como control positivo y agua como control negativo. El CV del ensayo gCYC basado en la piscina de control positivo se determinó que era 19%. controles de agua eran siempre negativos.
Los cebadores y sondas para la casa en gCYC fueron diseñados utilizando el software OLIGO 7 (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO) (disponible en línea, secuencia de número de acceso NG_029697.1). El cebador directo se encuentra en el intrón 1 a 2, la sonda en el exón 2 y el cebador inverso en el intrón 2 a 3 (Forward ACATGGGTACTAAGCAACAAAATAAG, CACAATTGGAACATCTTTGTTAAAC inversa, la sonda Fam-TTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCA-Tamra). BLAST búsqueda se realizó y se prevé ningún objetivo inespecíficos. Análisis de los datos qPCR se realizó utilizando SDS ver software. 2.2.2 CQ y valores fueron determinados usando el ajuste automático y la línea de base umbral fijo en 0.2. La cuantificación de cfDNA se llevó a cabo mediante el cálculo del número de copias de
gCYC
alelos como 10
ordenada en el origen (gCYC) -mean Cq (gCYC) /pendiente (gCYC) y normalizar esta al volumen de plasma.
detección de la mutación KRAS y cuantificación
KRAS
análisis del tejido tumoral de archivo de la FFPE se llevó a cabo en el estudio Cetuximab con el aprobado por la FDA
KRAS
kit DxS (Qiagen), como se informó anteriormente. Las muestras de tumor de los ensayos TIRASMUS, PG y GemCap se analizaron con un ensayo en el local validado. Los ensayos in-house se basan en la PCR de amplificación refractaria mutación Sistema-cuantitativa (ARMS-qPCR) metodología y detecta mutaciones en 6
KRAS
codón 12 (Gly12Ala, Gly12Arg, Gly12Asp, Gly12Cys, Gly12Ser, y Gly12Val) y una mutación en el codón 13 (Gly13Asp). Los cebadores y sondas para la in-house
KRAS
ensayos, así como
KRAS
fragmentos de PCR de control mutación, fueron diseñados utilizando el software OLIGO 7 (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO) ( disponible en línea, secuencia de número de acceso NW_001838052.1). El ensayo se encuentra en el exón 2 del gen KRAS. El análisis se realizó como se describió anteriormente. Una comparación de los dos métodos para la detección de la mutación en el tejido tumoral ha sido publicado previamente y mostró un acuerdo completo [19] y las curvas estándar están disponibles como material en línea [11]. La sensibilidad de detección varió entre 0,03% -0,001%, dependiendo del tipo de mutación detectada, 12asp (1/200000, 0,0005%), 12Cys (1/200000, 0,0005%), 12ser 1/7000, 0,0143%), 13asp 1 /3000, 0,0333%), 12ala (cienmilesima, 0,0010%), 12val (1/200000, 0,0005%), 12arg (1/200000, 0,0005%), respectivamente). Una mezcla de mutación positiva fragmentos de control y de los donantes de ADN genómico se incluyó en cada ejecución PCR y agua como control negativo. Se incluyó una muestra de ADN genómico de donantes puro para determinar la especificidad de los ensayos (datos presentados en [11]). CV para cada ensayo de mutación KRAS y para el ensayo de gCYC se determinó con base en los datos de los análisis de PCR en un período de tiempo de 20 meses y tenían entre 18% y 32%. controles de agua eran siempre negativos. La cuantificación de los
KRAS
se llevó a cabo mediante el cálculo del número de copias de mutado
KRAS
alelos como 10
ordenada en el origen (KRAS) -mean Cq (KRAS) /pendiente (KRAS) y normalizadora esto con el volumen plasmático.
el análisis estadístico
Una comparación de los niveles de cfDNA descriptiva se realizó con la prueba t de dos caras y de Wilcoxon rango suma de prueba. El límite superior de la normalidad, tal como se define por la media + 2SD en el grupo control, se utilizó para el valor de corte de exploración para el análisis de supervivencia. Se aplicó el método de Kaplan-Meier para estimar la SLP y la SG. Se realizó un análisis de regresión de Cox para examinar si las diferentes variables se asociaron con una menor supervivencia, incluyendo los niveles de cfDNA y pruebas de las características basales (edad, género y PS) con potencial influencia (conocidos factores pronósticos o parámetros significativos o dudosos por ejemplo, P & lt; 0,02 ) sobre la supervivencia. Se empleó un análisis de la curva de funcionamiento del receptor (ROC) para describir el desempeño de cfDNA y pKRAS. Los valores de P se refiere a pruebas de dos colas y se consideraron significativos cuando p ≤ 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico NCSS 2007 v.07.1.5 (Statistical Software NCSS, Utah 84037, EE.UU., www.ncss.com).
Resultados
Características de los pacientes
enfermedad y de tratamiento preliminar características de los pacientes se presentan en la Tabla 1. la mediana de edad en la cohorte total de pacientes fue de 63 años (rango 35 a 82) y la mayoría eran hombres, sobre todo en el buen estado general. No hubo diferencias significativas en la edad, el sexo o el estado funcional entre los 5 cohortes.
La cohorte individuo sano incluyó a 10 hombres y 10 mujeres de 25-44 años, 20 hombres y 20 mujeres de edades comprendidas 45- 59 y 60-75.
La mayoría de los pacientes incluidos en los ensayos tenían muestras de sangre disponibles. Por lo tanto, un total de 229 pacientes fueron incluidos, de los cuatro ensayos, y 223 tenían tejido tumoral disponible y 211 una muestra de plasma de línea de base a juego. Los resultados fueron que faltan debido a la mala calidad del ADN del tumor o debido a la cantidad inadecuada de plasma en las muestras.
ADN y de tratamiento preliminar características libres de células
Los niveles medios cfDNA en las cohortes individuales se dan en la Tabla 1. Los niveles de ADN libres de células se analizaron para la correlación de características de la enfermedad y de pre-tratamiento. No hubo diferencias significativas en los niveles medios de cfDNA según la edad o el sexo, pero significativamente más altas concentraciones cfDNA con el aumento de PS (Tabla 1).
ADN libre de células en pacientes con cáncer en comparación con individuos sanos
la media y la mediana de las concentraciones de cfDNA en el grupo de control fueron 2800 y 2400 alelos por ml de plasma, respectivamente, dentro de un rango de 800 a 14.000 alelos por ml de plasma. El nivel medio de cfDNA en toda la cohorte de pacientes con cáncer fue 17900 alelos por ml de plasma (rango de 800 hasta 4.618.400). Fig 1A ilustra las diferencias en las concentraciones de cfDNA en el plasma de los controles sanos y las muestras de referencia de las diferentes cohortes de pacientes con cáncer. Los datos se presentan como un diagrama de caja de los valores en una escala logarítmica, y los niveles en pacientes con cáncer fueron marcadamente mayor que en el grupo de control sano. Los niveles de cfDNA fueron similares entre las cohortes de pacientes con cáncer. Las diferencias en cfDNA fueron altamente significativas entre el grupo control y todos los grupos individuales de pacientes de cáncer (todos los valores p fueron & lt; 0,0001). El poder para discriminar entre individuos sanos y pacientes de cáncer se puso a prueba mediante la estimación de la República de China y el área bajo la curva (AUC) como se demuestra en la Figura 1B. El AUC fue 0,9486 (IC del 95% desde 0,9182 hasta 0,9679, p & lt; 0,00001).
Una muestra de cajas y bigotes parcelas con 25%, 50%, 75% percentiles, los valores y los valores extremos adyacentes superior e inferior (puntos) . Forma horizontal las cuatro cohortes de ensayos clínicos y control de grupo, la concentración vertical cfDNA en una escala logarítmica. C estudio cetuximab, GemCap GemCap cohorte, PG PG cohorte del estudio, T cohorte del estudio TIRASMUS, controles de grupo de control sano. B muestra una curva de funcionamiento del receptor (ROC) estimar el rendimiento de cfDNA para discriminar entre pacientes con cáncer colorrectal y controles. El AUC fue 0,9486, (IC del 95%: 0,9182 a 0,9679, p & lt; 0,00001).
han presentado son el valor pronóstico de los pacientes con cáncer en cfDNA
El análisis de supervivencia de acuerdo a los niveles de cfDNA por separado para los grupos individuales de cáncer con los resultados de los ensayos primarios [11-13]. Un análisis combinado de todos los pacientes confirmó una supervivencia general más corta con el incremento de los niveles de línea de base cfDNA. La figura 2A ilustra las curvas de Kaplan-Meier de OS en los pacientes divididos en los cuatro grupos de acuerdo con los cuartiles de los niveles cfDNA. El sistema operativo de los pacientes clasificados en grupos bajos o altos de concentración cfDNA basados en el rango normal superior del grupo de control (que se define como la media + 2SD = cfDNA 7100 alelos por ml) se muestra en la figura 2B. regresión de Cox análisis multivariado incluyendo la edad (& gt; /& lt; 63 años), el sexo, PS y cfDNA cuartiles (tratada como una variable continua) confirmó un valor pronóstico independiente de cfDNA en toda la cohorte. Como una variable continua, no había una relación de OS Hazard de 1,5 (IC 95% 01/03 a 01/07) para cada incremento en el nivel cuartil cfDNA (Tabla 2).
A. Los pacientes están agrupados por cuartiles de cfDNA (desde la derecha) más bajo, segundo cuartil más bajo de cfDNA, el segundo más alto y más alto. La mediana de SG acuerdo con los cuartiles cfDNA fueron; 10,2 meses (95% CI 8.9-12.8), 7,8 meses (5.7-9.3), 5,0 meses (4.3-6.0) 3.5 meses (3,0-3,9), respectivamente. B. Los pacientes se agrupan por el rango superior de la normalidad como se define por medio cfDNA + 2SD en el grupo control (7100 alelos por ml.) Grupo de bajo riesgo (línea continua), mediana de SG, 10,2 meses (8.3-11.7). grupo de alto riesgo (línea punteada) La mediana de OS, de 5,2 meses (4.6 a 5.9). HR 1,78, p = 0,0006.
La detección de mutaciones del gen KRAS en muestras de tumores y de plasma
Un total de 211 pacientes tenían ambas muestras tumorales y de plasma para la detección fiable de
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mutaciones. Las muestras de plasma con un bajo número de alelos cfDNA no fueron excluidos del análisis. -Tumor específico
se detectaron mutaciones de KRAS
en un total de 119 muestras de plasma. La concordancia global entre el estado de mutación en el tumor y el plasma fue alta: (180/211 = 85%) y 112 de las muestras de tumores con mutaciones demostradas 140
KRAS
mutaciones en las muestras de plasma también, mientras que sólo tres casos se observó que los pacientes tenían una mutación detectable en el plasma, pero no en el tumor primario.
ADN libre de células y correlación con las mutaciones KRAS específicos de tumores
la correlación entre el número de ADN celular total alelos libres y el número de alelos mutación KRAS en los pacientes con KRAS mutantes se analizó mediante la correlación de rangos de Spearman. Debido a la amplia gama de niveles cuantitativos se utilizó una escala logarítmica. Como se muestra en la figura 3, que representa el ADN libre de células verticalmente y el número de alelos mutación KRAS horizontal éstas fueron fuertemente correlacionada figura 3 (r
2 = 0,97, rango de Spearman = 0,86, p & lt; 0,000). Esto confirma los datos preliminares del estudio cetuximab [11), e indica que una fracción significativa del origen cfDNA a partir de ADN del tumor (como se representa por el ADN con mutaciones KRAS específicos de tumores)
Esta parcela ilustra la fuerte correlación entre el número total de alelos de ADN y el número de alelos mutados en los pacientes con mutaciones de KRAS detectados. La correlación de Spearman se calculó en 0,86 y r
2 = 0,97 (
p Hotel & lt; 0,0000). Los diferentes símbolos representan las cohortes individuales de pacientes de cáncer. (PG Plaza de correlación = 0,9, círculo cetuximab correlación = 0,88, triángulo de correlación GemCap = 86, pentágono TIRASMUS de correlación = 0,67).
Discusión
Una mayor atención a la investigación traslacional y tecnológica reciente avances han dado una nueva visión de la importancia clínica de cfDNA en el cáncer y su potencial para la detección de mutaciones específicas del tumor en la circulación periférica.
Como una medida de la cantidad total de cfDNA, este estudio investigó el número de alelos de el gen de la ciclofilina, y confirmó un nivel más alto en los pacientes con CCRm que en los controles sanos. Una búsqueda de estudios similares revela resultados inconsistentes; Sin embargo, las diferencias en las metodologías de investigación hacen difícil las comparaciones directas. En general, existen variaciones en el método aplicado para la purificación de ADN, el gen de referencia, medida, y las cohortes de los individuos investigados. Sin embargo, algunos estudios en pacientes con CRC apoyan nuestros datos [21-24]. Un estudio muy reciente explora la utilidad de usos múltiples del ADN circulante en plasma en pacientes con cánceres avanzados usando un enfoque metodológico diferente, mostrando en general niveles más altos de cfDNA en el CCR, de mama, de próstata y otros cánceres que en los controles sanos [8]. Sin embargo, el tamaño de la muestra de ese estudio no permitió el establecimiento de un rango normal (n = 20), pero sus resultados no apoyar a los datos actuales. Una observación reciente en el cáncer de recto localmente avanzado, a pesar del uso de un método diferente para la medición de cfDNA, también reveló una diferencia significativa en los niveles de cfDNA entre los controles y las primeras etapas del cáncer rectal [25]. La capacidad de discriminar entre niveles cfDNA nuestros pacientes con cáncer colorrectal y los controles sanos fue excelente, el apoyo a la necesidad de más estudios de cfDNA en etapas anteriores de tumores y lesiones precancerosas. Por otra parte, la variación de los individuos con cfDNAin no canceroso co-morbilidad necesita ser estudiada posteriormente, para tener en cuenta el sesgo potencial. El presente estudio también pone de relieve la importante función biológica de cfDNA en esta enfermedad. La concentración elevada de cfDNA en pacientes con cáncer y la correlación con un número de alelos mutados también indican que la cfDNA es en gran parte derivado del tumor, aunque el origen todavía permanece indefinido.
Hay una necesidad de herramientas adicionales para una mejor selección de pacientes para el tratamiento de cáncer colorrectal metastásico fuertemente pretratados. En cuatro estudios realizados consecutivamente en fase clínica II hemos confirmado un nivel uniforme de cfDNA y un valor pronóstico claro.
Un estudio recientemente publicado de nuestro grupo ha puesto de manifiesto que la cfDNA no es simplemente una medida de la carga tumoral [ ,,,0],26]. En lugar de ello, sugerimos ese total cfDNA es más probable que refleje tanto los mecanismos de la carga tumoral y biológicas y por lo tanto es un cuadro más complejo de la enfermedad en una etapa determinada. La similitud de los niveles basales entre los cuatro estudios de fase II que observamos ilustra la homogeneidad de las cohortes de los pacientes. Los pacientes fueron seleccionados sobre la base de la verdadera condición de la quimioterapia refractaria en lugar de líneas de tratamiento, que puede variar en función de las definiciones y estrategias de tratamiento anteriores, y es por lo tanto una definición menos precisa de la etapa avanzada de la enfermedad. Una comparación entre las cohortes y la posterior puesta en común de datos, por lo tanto se justifica como también apoyada por el análisis multivariante. La investigación en pacientes sin tratamiento previo de quimioterapia debe ser objeto de estudios futuros.
niveles basales más altas mostraron una fuerte correlación con mal pronóstico, en primer lugar cuando se analizaron en la fase II de los estudios individuales, en segundo lugar, cuando se valoran de acuerdo con los cuartiles de los niveles en cfDNA la cohorte total de CRC, y, finalmente, cuando se divide en grupos de alto y bajo de concentración en función del nivel máximo cfDNA en individuos sanos. Además, el análisis combinado permitió un análisis multivariado fiable, que confirmó un fuerte impacto pronóstico de cfDNA como parámetro continuo. El valor pronóstico de cfDNA se ha descrito en varios tipos de cáncer, pero sólo unos pocos en relación a la quimioterapia [15 a 16, 27]. El informe publicado recientemente por Perkins y col está de acuerdo con nuestros datos, y es uno de los pocos estudios que investigan cfDNA en pacientes tratados por cáncer avanzado [8].
El tratamiento de la CRC, sin duda, seguirá desarrollando hacia la focalización individual características moleculares de la enfermedad. Sin embargo, la heterogeneidad del tumor, la inestabilidad genómica y clonales lugar la evolución molecular altas demandas en una caracterización precisa y oportuna. La realización de biopsias tumorales repetidas se ha hecho, pero es inconveniente e implica un riesgo para el paciente. El uso de plasma como una biopsia líquida para la detección de mutaciones tiene muchas ventajas y podría superar los problemas asociados con las biopsias de tumores repetidas. repetición de las pruebas durante el tratamiento se realiza fácilmente y el presente método desarrollado para la detección de
KRAS mutaciones
es factible, relativamente barato, rápido y pueden llevarse a cabo sobre una base a gran escala. Sin embargo, la tecnología actual qPCR sólo permitirá un número limitado de reacciones de PCR dirigidas por muestra. Desde
KRAS
tiene un impacto clínico predominante y una alta frecuencia en CCRm este enfoque es todavía viable, mientras que los métodos tales como la secuenciación de próxima generación pueden llegar a ser relevante si se revelan múltiples mutaciones con potencial importancia clínica y destinos disponibles. Sin embargo, en este momento, un método simple y factible para estas investigaciones parece el enfoque más racional, especialmente teniendo en cuenta el hecho de que los tamaños de muestra adecuados para investigaciones clínicas fiables son de suma importancia.
La tasa de detección de tumor-específica mutaciones en plasma depende de la especificidad y la sensibilidad del ensayo, que se puede aumentar por pasos de amplificación pre-análisis, así como de la cantidad de la cfDNA en la muestra. Este último puede ser superado mediante el aumento del volumen inicial de plasma analizada. Estos aspectos deben tenerse en cuenta al abordar la concordancia entre el tumor primario y el estado de mutación de plasma, el cual fue alta con nuestro método en comparación con los pocos estudios relevantes en la literatura [28-30]. Las razones para la discordancia incluyen la posible mala calidad del ADN extraído de parafina embebido archivo de tejidos del tumor, o la verdadera heterogeneidad de la enfermedad y la evolución molecular clonal durante varias líneas de tratamiento.
es clínicamente relevante para investigar si p
KRAS
puede ser utilizado como un criterio de selección para el tratamiento inhibidor de EGFR en lugar de t
KRAS
detección. Los datos actuales y un informe previo similar [31] sugieren que p
KRAS
estado tiene un valor predictivo fuerte en este entorno. Esto también se aplica a las cohortes de nuestros pacientes que no fueron tratados con inhibidores de EGFR. Sin embargo, los resultados de nuestros estudios pequeños no aleatorios deben ser interpretados con precaución y de investigaciones adicionales en tamaños de muestra más grandes, preferiblemente en estudios aleatorios, están garantizados. Cohortes de prueba y validación
Hemos proporcionadas con tamaños de muestra adecuados para multivariante análisis del valor de pronóstico y para la definición de un rango normal de cfDNA. El presente estudio confirma la utilidad pronóstica de cfDNA en el plasma y la viabilidad de las pruebas de mutaciones mediante el procedimiento presentado. Hacemos un llamado a los esfuerzos combinados para comparar, validar y prospectiva investigar el papel de cfDNA cuantificación en el cáncer, con la perspectiva global de la traducción de los resultados en la atención clínica de los pacientes con enfermedades de cáncer avanzado.
Reconocimientos
agradecemos sinceramente el Consejo de Investigación, hospital Lillebaelt, Asta og Peter Götz-Petersen Fundación y la Fundación Novo Nordisk para la financiación del estudio.