Extracto
Antecedentes
ADN metilado en los fluidos puede ser un biomarcador adecuado para pacientes con cáncer.
XAF1
se ha demostrado que con frecuencia las reguladas en el cáncer gástrico humano (GC). A continuación, se investigó si
XAF1
metilación en GC podría ser un biomarcador útil.
Métodos
En tiempo real RT-PCR se utilizó para detectar
XAF1
expresión de ARNm; inmunohistoquímica y transferencia de Western se utilizaron para examinar la expresión de proteínas en los tejidos XAF1 GC (n = 202) y sus correspondientes tejidos normales histológicos para-cancerosos (PCHNTs). se utilizó en tiempo real específica de metilación-PCR para investigar
XAF1
promotor de la metilación en el mismo grupo de tejidos GC, sus PCHNTs y sueros.
Resultados
Nos confirmó frecuentes
XAF1
regulación a la baja, tanto en los niveles de proteína en los tejidos GC ARNm y en comparación con los controles y PCHNTs normales.
XAF1
hipermetilación se evidenció en 83,2% (168/202) de los tejidos GC y 27,2% (55/202) de PCHNTs, mientras que no metilación se detectó en los 88 controles normales. El nivel de metilación en los tejidos GC fue significativamente más alta que en PCHNTs (
p & lt; 0,05
). La hipermetilación de
XAF1
correlacionó significativamente con la baja regulación de
XAF1 Hoteles en tejidos GC, tanto en los niveles de ARNm y proteínas (
p Hotel & lt; 0,001 cada uno). Por otra parte, se detectó alta frecuencia de
XAF1
metilación (69,8%, 141 de 202) en los ADN de suero de los mismos pacientes, mientras que los ADN de sueros de 88 controles no tumorales fueron negativos para
XAF1
metilación. El
XAF1
metilación en ambos tejidos GC y en el suero podría ser un buen biomarcador para el diagnóstico de GC (AUC = 0,85 para el tejido y el AUC = 0,91 para sueros) y se correlacionó significativamente con peor pronóstico (
p Hotel & lt; 0,001). Además, después de la cirugía negativo a positivo transición de
XAF1
metilación en los sueros fuertemente asociada con la recurrencia del tumor.
Conclusiones
1) La disfunción de
XAF1
es frecuente y se regula a través promotor
XAF1
hipermetilación; 2) La detección de circulante metilado
XAF1
ADN en el suero puede ser un biomarcador útil para el diagnóstico, la evaluación de los resultados del paciente (pronóstico y la recurrencia) para los pacientes con cáncer gástrico
Visto:. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) circulantes metilado
XAF1
ADN Indica Mal pronóstico para el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Marzo, 2013; Aceptado: 16-may de 2013; Publicado: 27 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Ling et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una subvención del proyecto de la ciencia y la tecnología general de la provincia de Zhejiang (n. ° 2009C33143), y en parte por una subvención del Talento Backbone de Medicina Provincial de Zhejiang y programas de higiene de la plataforma (n. ° 2011RCA009). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes en china, con una alta incidencia y mortalidad, aproximadamente representa el 10% de todos los tumores malignos [1]. tumorigénesis gástrico es un proceso complicado, de múltiples etapas que implica alteraciones de muchos genes [2]. Metilación aberrante promotor es uno de los principales mecanismos para silenciar algunos genes supresores de tumores y genes relacionados con el tumor y juega un papel muy importante en la patogénesis y la progresión de los cánceres humanos [3], [4] - [6], incluyendo el cáncer gástrico [7] , [8]. Mientras tanto, los datos de la acumulación sugiere fuertemente que la metilación del ADN podría ser biomarcador útil y de gran alcance en la evaluación de riesgo de cáncer [5], [7], el diagnóstico precoz [7], predecir el pronóstico de los pacientes [7], [8], y la evaluación de la sensibilidad a la fármacos quimioterapéuticos [9]. Nuestro estudio reciente y otras investigaciones demostraron que la detección de ADN metilado que circula en la sangre es un enfoque potente y práctica para pacientes con cáncer [7], [10], [11].
ligada al X inhibidor de la apoptosis (
XIAP
) -asociado el factor 1 (
XAF1
) es un regulador negativo de la novela
XIAP
, que invierte la función de protección de XIAP en células tumorales [12] - [14]. La pérdida de
XAF1
expresión será hacer que las células tumorales resistencia a la apoptosis y promover la supervivencia de las células tumorales [14] - [17]. La disfunción de
XAF1
ha sido reportado en varios cánceres humanos probablemente a través de la metilación del promotor [15] - [19], lo que sugiere su importancia en la tumorigénesis. En el cáncer gástrico humano,
XAF1
se ha informado de que con frecuencia y significativamente las reguladas y esto baja regulación de
XAF1
probablemente a través de la hipermetilación del ADN de los sitios específicos CpG [15], [16 ], [18]. Sin embargo, ningún informe está disponible de
XAF1
metilación en sangre y su potencialidad como un biomarcador. En el presente estudio se analizaron
XAF1
promotor de la metilación en muestras de tejido y pareadas de suero de un gran grupo de pacientes con cáncer gástrico, y se evaluaron circulante metilado
XAF1
como un biomarcador potencial para el cáncer gástrico .
material y Métodos
Declaración de Ética
muestras de tejidos humanos identificados-dE y los sueros se obtuvieron de la provincia de Zhejiang Banco de tejidos humanos de muestras. El uso de las muestras fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Cáncer de la provincia de Zhejiang. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente de acuerdo con los requisitos del Consejo de Ética de nuestra institución. 88 voluntarios no cancerosas escrito el consentimiento informado. Parte de las muestras eran de Hospital Popular de la provincia de Zhejiang y el Hospital de las primeras personas de Chunan Condado. La Junta de Revisión Institucional de Ética Médica del Hospital Popular de la provincia de Zhejiang y el Hospital de las primeras personas de Chunan Condado aprobó el método de obtención de la muestra incluyendo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, respectivamente.
Tejido de muestras
tejidos normales histológicos de tumores y para-cancerosos pareadas (PCHNT) muestras se recogieron en el momento de la cirugía de 202 pacientes con adenocarcinoma gástrico primario en el hospital de la provincia de Zhejiang cáncer, hospital de Zhejiang Popular de la provincia y el hospital de las primeras personas de Chunan Condado a partir de enero de 2008 a diciembre 2009. el PCHNT se evaluó microscópicamente la presencia de células normales y la ausencia de las células displásicas. Ninguno de estos casos había sido sometido a ningún tratamiento médico antes de la cirugía. Los parámetros demográficos, clínicos e histopatológicos de estos casos se muestran en la Tabla 1. El patrón de crecimiento de las células tumorales se determinó de acuerdo con la clasificación de Ming [20]. Todos los pacientes reclutados habían sido objeto de seguimiento periódicamente hasta la fecha de vencimiento. muestras de biopsia de la mucosa del antro de 88 voluntarios que no tienen cáncer de gastroscopia fueron recogidos al azar como controles en el mismo plazo, incluyendo 54 hombres y 34 mujeres, con una edad media de 52,9 años de edad. Entre estos voluntarios, 48 pacientes fueron diagnosticados con la gastritis no atrófica crónica. Mientras tanto, se recogieron muestras pareadas de suero antes de la cirugía o endoscopia.
Análisis de Helicobacter Pylori (
H. Pylori
) Infección
Las biopsias se obtuvieron de todos los pacientes que tenido un examen endoscópico.
H
.
Estado pylori
se determinó mediante la prueba de ureasa rápida y métodos de tinción Giemsa [21], [22]. Se consideró como
H
.
pylori
cuando ambas pruebas fueron positivos, y se excluyeron las muestras con un solo positivo para el análisis estadístico [22].
Real-time RT-PCR
La expresión del ARNm de
XAF1
se analizó por tiempo real de RT-PCR [23]. ARN totales se extrajeron mediante el Trizol (Gibco). Un total de 3 g ARN totales se sometió a transcripción inversa utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega). El gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
) fue seleccionada como la referencia interna. Las secuencias de
XAF1
cebadores fueron los siguientes: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5' GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3 '.
GAPDH
secuencias de los cebadores fueron los siguientes: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. El 2 Se utilizó el método
-ΔΔCt para calcular cambios relativos en la expresión génica.
tinción inmunohistoquímica
La expresión de la proteína XAF1 se determinó mediante análisis inmunohistoquímico con anticuerpo monoclonal XAF1 (Santa Cruz Biotechnology ). La tinción inmunohistoquímica para XAF1 se llevó a cabo utilizando muestras representativas incluidas en parafina a partir de los 202 pacientes con cáncer gástrico. Después de desparafinación, recuperación de antígeno en tampón de citrato 0,01 M, y la inactivación de la actividad de peroxidasa endógena en 3% H
2O
2 /metanol, se incubaron los portaobjetos con anticuerpos para XAF1 a 4 ° C durante la noche, y la tinción inmunohistoquímica, siguiendo una técnica compleja avidinbiotin-peroxidasa estándar, se llevó a cabo usando 3,3'-diaminobencidina (DAB) como cromógeno. Los núcleos se counterstained con hematoxilina. La puntuación de tinción inmunohistoquímica (ISS) se determina por tres patólogos independientes que combinan la frecuencia y la intensidad de tinción de la siguiente manera [24], [25]: no tinción se puntuó como 0, 1~10% de células teñidas anotó como 1, 11~50% como 2, 51~80% como 3, y 81~100% como 4. intensidad de la tinción se califica en una escala de 0 a 3, con 0, negativo; 1, débil; 2, moderado; y 3, fuerte. Cuando hay inmunorreactividad multifocal y hay diferencias significativas en la intensidad de la tinción entre focos, se registró el promedio de la menos intensa y más intensa tinción. Los datos brutos se convirtieron a la ISS multiplicando la puntuación de frecuencia y la puntuación de la intensidad de la tinción. En teoría, la ISS podría variar de 0 a 12. Un ISS de 9~12 inmunoreactividad fuerte fue considerado, 5~8 se consideró moderada, 1~4 se consideró débil y 0 fue marcado como negativo. Las secciones en las que la tinción no podía estar bien caracterizadas fueron considerados equívoca.
juegos de análisis Western Blot
En combinación tumorales y PCHNT de 20 casos fueron seleccionados al azar de 202 pacientes con cáncer gástrico para el análisis de Western blot. La proteína total se extrajo y se cuantifica luego utilizando el método de Lowry [26]. Western blot se realizó utilizando anticuerpos monoclonales anti-XAF1 (Santa Cruz, CA) de acuerdo con el informe anterior [6]. β-tubulina se sirve como un control interno.
Extracción de ADN, bisulfito de modificación y la metilación en tiempo real específica-PCR (MSP)
Las secciones seriadas 5 mm que contenían carcinoma y no neoplásico los tejidos se montaron en portaobjetos de vidrio no recubiertos y se secaron a 37 ° C durante la noche. Después de deparaffinization y tinción con hematoxilina y eosina (H & amp; E), se recogieron 5.000 núcleos de 5 a 10 secciones en serie utilizando una aguja 27G. Los núcleos recogidos fueron tratados con 40 ml de 200 mg /ml de proteinasa K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) a 42 ° C, durante 72 hr. La tecnología de perlas paramagnéticas (kit AxyPrep Mag Blood gDNA, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) se utilizó para aislar el ADN genómico a partir de sangre fresca de acuerdo con el protocolo del kit. El protocolo consiste en la siguiente etapa: la lisis, la unión, lavado y elución. Los contaminantes se eliminan durante las etapas de unión y de lavado. La calidad del ADN se evaluó por la relación A260 /280 en espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), la integridad del ADN se comprobó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa.
ADN fueron modificados por bisulfito de sodio utilizando el kit EpiTect bisulfito (Qiagen Inc.) siguiendo las instrucciones de manufactura. Los ADN modificados se analizaron mediante MSP-tiempo real en el ABI7500 PCR (ABI Co.) usando el kit de SYBR Premix Taq ExTaq (Takara Co. Ltd).
XAF1
metilación y no metilación primers específicos fueron diseñadas de la siguiente manera:
XAF1 gratis (MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3';
XAF1 gratis (UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Se utilizó el ADN genómico humano (NEB) tratado por LICE metiltransferasa in vitro como un control positivo. Se utilizó un ADN de sangre periférica de un sujeto sano como control negativo. El porcentaje de ADN metilado en las muestras se calcula de acuerdo con las referencias anteriores como se describe [27], [28]. índice metilado ADN se obtuvo de acuerdo con el porcentaje de metilación del ADN; 0, & lt; 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; y 4, & gt; 80%. El resultado del índice de 0 se considera como no metilación del ADN y anota 1-4 se consideraron hypermethylated, respectivamente [7], [27]. El corte umbral del 20% para la hipermetilación del ADN se basa en muestras de control normales y controles internos de calidad obtenidos en el análisis de MSP en tiempo real.
Cultivo de células y medicamentos para el tratamiento
líneas celulares de cáncer gástrico Humanos (AGS y KATO-III) se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, y 100 U /ml de estreptomicina a 37 ° C y 5% de CO
2, respectivamente. Las células cultivadas se trataron con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-CdR) (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 1,0 mol /L. La tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 20 ng /ml se administró después del tratamiento 5-Aza o solo durante 24 h. Las células se recogieron y se sometieron a ADN, ARN y la purificación de proteínas y análisis posteriores.
Análisis estadístico
SPSS 17,0 software estadístico se adoptó para el análisis de datos. Contando las comparaciones de datos entre los grupos fueron sometidos a la
χ
2 y el test exacto de Fisher. El análisis de supervivencia se computadorizada mediante el método de Kaplan-Meier y niveles significativos fueron evaluados mediante la prueba de log-rank. Se utilizó un análisis univariante con el modelo de regresión de Cox para determinar los factores pronósticos identificados, y se utilizó el análisis multivariado con el modelo de regresión de Cox para explorar los efectos combinados. Para todos los análisis estadísticos,
p
valores. & Lt; 0,05 se consideraron significación estadística
Resultados
El descenso de regulación de
Hoteles en XAF1 gástrico primario los tumores
Para investigar
XAF1
perfil de expresión génica, se analizó la expresión del ARNm de
XAF1
en 88 voluntarios que no tienen cáncer, y 202 cáncer gástrico tejidos primarios y sus correspondientes PCHNTs. Como se muestra en la Figura 1A, el
XAF1
expresión se redujo significativamente en las muestras de cáncer gástrico en comparación con la de los controles y PCHNTs normales (
p & lt; 0,001
). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en
XAF1
expresión en PCHNTs comparación con los controles sin cáncer.
A,
XAF1
nivel de expresión de ARNm en los tejidos de GC, PCHNTs ( controles para-canceroso del tejido normal histológico) y no cancerosas se determinaron por tiempo real de RT-PCR y se normalizó a
GAPDH
. B-F, la expresión de proteínas XAF1 se había reducido regulado en los tejidos de cáncer gástrico. B, A, alta expresión positiva representante de la proteína XAF1 en unos tejidos PCHNT; C, ausente de expresión XAF1 en un GC pobremente diferenciado; aumento original × 200. D, un resumen de XAF1 tinción inmunohistoquímica resultados en 202 cánceres gástricos. E, western blot Representante de expresión XAF1 en el cáncer gástrico y muestras PCHNT correspondiente con diferentes
XAF1
los niveles de metilación. tejidos PCHNT en la caja 59 (XAF1 puntuación de metilación: 0); tejidos de GC en la caja 59 (metilado
XAF1
Puntuación: 4); tejidos PCHNT en Caso 20 (puntuación metilado: 0); GC tejidos en Caso 20 (metilado
XAF1
puntaje: 1). Beta-tubulina se utilizó como control interno. M, Resumen de los resultados de Western Blot de 20 GC y PCHNTs correspondientes que se presentan como la densidad de bandas relativa normalizada a la beta-tubulina de las mismas muestras.
Además,
XAF1
expresión era significativamente menor en los tumores avanzados (estadio III /IV) que en los tumores en estadio temprano (estadio I /II) (
P & lt;
0,0001, Figura S1 a), y fue significativamente menor en los tumores pobremente diferenciados de aquel en el pozo /tumores moderadamente diferenciados (
P & lt; 0,0001
, Figura S1 B)
Para comprobar el nivel de proteína XAF1 en tejidos de cáncer gástrico, se realizó un análisis inmunohistoquímico de los 202 tejidos de cáncer gástrico y sus correspondientes PCHNTs.. XAF1 expresión nuclear era constantemente presente en el epitelio gástrico normal con puntajes altos inmunorreactivas. La expresión de la proteína se detectó en XAF1 alto nivel en 97,5% (197/202) de PCHNTs (Figura 1B). Sin embargo, la alta expresión de la proteína XAF1 sólo se detectó en el 16,8% (34/202) de los tejidos de cáncer gástrico; mayoría de los tejidos de cáncer gástrico fueron ausente o a un nivel bajo de proteína XAF1 (Figura 1C). Los hallazgos inmunohistoquímicos se resumen en la Tabla 1. La puntuación de tinción inmunohistoquímico en tejidos de cáncer gástrico fue significativamente menor que en PCHNTs o en los controles normales (
p & lt; 0,0001
, la Figura 1D). La pérdida de proteínas XAF1 correlacionó significativamente con
H. pylori
infección, el tamaño del tumor, la diferenciación histológica, la invasión linfática, invasión venosa, la profundidad invasiva, metástasis ganglionares, metástasis a distancia y el estadio clínico (Tabla 1) (todos los
p & lt; 0,05
)
.
Los resultados inmunohistoquímicos de 20 tejidos de cáncer gástrico se confirmaron adicionalmente por medio de análisis de transferencia Western. Los resultados de transferencia de Western representativas en dos casos se muestran en la Figura 1E. La cantidad relativa de expresión de la proteína XAF1 se normalizó a la β-tubulina de las mismas muestras. El nivel promedio de proteína XAF1 en 20 tejidos de cáncer gástrico fue significativamente menor que en PCHNTs (
p Hotel & lt; 0,05). (Figura 1F)
hipermetilación del promotor de
XAF1
en gástrico primario tumores
para investigar los mecanismos moleculares de la
XAF1
silencio en los cánceres gástricos, se aplicó una tecnología MSP en tiempo real para estudiar el estado de metilación del ADN de
XAF1
promotor. La frecuencia de
XAF1
hipermetilación en los tejidos de cáncer gástrico, PCHNTs correspondientes y los controles no cancerosas fueron 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) y 5,7% (5/88), respectivamente. La frecuencia de hipermetilación de
XAF1
en los cánceres es significativamente más alta que en PCHNTs y controles sin cáncer (todo el
p Hotel & lt; 0,0001, Figura 2): perfil
muestra datos. la frecuencia de
XAF1 gratis (nivel de metilación del ADN ≥20%) hipermetilación en cada grupo.
Es de destacar que el estado metilado de
XAF1
correlacionaron significativamente con algunos parámetros clínico-patológicas en el cáncer gástrico, tales como la metástasis de los ganglios linfáticos, la T-etapa,
H
.
pylori
, etc (todo el
p & lt; 0,05
, Tabla 2). No hay correlación significativa entre la hipermetilación de
XAF1
y el género, la edad al momento del diagnóstico, se evidenció sitio del tumor y la metástasis distante (todo el
p Hotel & gt; 0,05). (Tabla 2)
XAF1
hipermetilación del promotor está asociado con su silenciamiento transcripcional en las células del cáncer gástrico
Para examinar las relaciones entre los
XAF1
metilación y
XAF1
expresión, se comparó la
XAF1
nivel de metilación con
XAF1
nivel niveles de ARNm y de proteína determinada ya sea por análisis inmunohistoquímico (Figura 3A) o Western Blot (Figura 3B) por el análisis de correlación de Spearman. Como se muestra en la figura-3A, la expresión de proteínas XAF1 (determinado por análisis inmunohistoquímico) en 202 tejidos GC se correlacionó estrechamente con
XAF1
nivel de ARNm [lg (T /N)] (determinado por RT-PCR) (
γ
= 0,841,
p & lt; 0,0001
). Más importante,
XAF1
nivel de metilación se asoció significativamente con
XAF1
nivel de ARNm (
γ
= - 0,846,
p & lt; 0,0001
) y la proteína XAF1 nivel (
γ
= -0.969,
p & lt; 0,0001
). Se obtuvieron resultados similares cuando se analiza la correlación de
XAF1
la metilación del promotor y de la expresión de la proteína XAF1 determinada por Western blot (Figura 3B). Estos resultados fuertemente acusadas que
XAF1
expresión está regulada por el promotor de
XAF1
metilación.
A, Correlación de
XAF1
metilación con
XAF1
nivel de ARNm se determina por análisis RT-PCR y expresión de proteínas XAF1 determinado por análisis inmunohistoquímico en tejidos de cáncer de 202 gástricos. B, La correlación de
XAF1
metilación con
XAF1
nivel de ARNm se determinó mediante análisis de RT-PCR y la expresión de la proteína XAF1 determinado por análisis de Western Blot en 20 tejidos congelados de cáncer gástrico. En tanto A como B,
XAF1
puntuaciones de metilación inversamente correlacionada con
XAF1
la expresión génica en los dos niveles de mRNA y proteína.
5-Aza-CdR Administración Restaura la expresión de la
XAF1
Para confirmar aún más la regulación epigenética de
XAF1
expresión, células AGS y Kato-III fueron tratados con 5-Aza-CdR y /o TSA .
XAF1
expresión de ARNm se reactivó en ambas líneas celulares de cáncer gástrico, acompañado por desmetilación de
XAF1
promotor (Figura 4), lo que indica que
XAF1
es silenciado transcripcionalmente en estas células por hipermetilación del ADN. Curiosamente, el tratamiento TSA solo fue eficaz en la restauración de
XAF1
expresión en AGS y Kato-III, sin cambio significativo de
XAF1
nivel de metilación, lo que sugiere que las modificaciones de las histonas también puede estar implicada en la regulación de
XAF1
expresión. Sin embargo, la administración de TSA tras 5-aza-CDR tuvo un efecto aditivo en la restauración de la expresión de genes con una mayor disminución en el nivel de metilación de
XAF1
. Estos resultados están de acuerdo con estudios recientes que sugieren que la TSA puede tener un efecto desmetilación de un modo específico del gen [5]. El análisis de transferencia Western utilizando células AGS, como modelo, confirmó la sobre regulación de las proteínas siguientes XAF1 el 5-Aza-CdR tratamientos /TSA (Figura 4) 5-Aza-CdR y.
Dos cáncer gástrico líneas celulares (AGS y KATO-III) se trataron con 1,0 mol /L 5-aza-CDR durante 72 horas y /o 100 nM TSA durante 24 horas. Los niveles de metilación se determinaron por tiempo real MSP. Se realizó análisis en tiempo real RT-PCR por triplicado para cada muestra de ADNc y se utiliza valores de la mediana en tres experimentos. La relativa
XAF1
expresión de ARNm se normolized a la
GAPDH Red de las mismas muestras usando la fórmula 2
-ΔΔCT. Los resultados se multiplican por 100 para una mejor visualización. El porcentaje de
XAF1
la metilación del ADN se muestra en el lado izquierdo; mientras que la expresión de mRNA relativa de
XAF1
se muestra en el lado derecho. B: Expresión de XAF1 a nivel de proteínas después de los tratamientos 5-aza-CDR y de la TSA. El análisis de transferencia Western de las células AGS después del tratamiento con DMSO (control), 5-Aza-CdR, o 5-Aza-CdR /TSA durante 72 horas demostrar sobre regulación de las proteínas XAF1 en las células tratadas en comparación con el control (DMSO). La beta-tubulina se muestra como control de carga.
Detección de circulante
XAF1
metilación
Hemos detectado alta frecuencia de
XAF1
metilación en el cáncer gástrico primario (83,2%), lo que sugiere que puede ser un buen marcador biológico si
XAF1
metilación podría ser detectable en el suero. Por lo tanto, hemos examinado
XAF1
metilación en los ADN de suero coincidentes de los 202 pacientes con cáncer gástrico.
XAF1
metilación se detectó en 141 (69,8%) los ADN de suero de los 202 pacientes con cáncer gástrico (Figura 5). Por el contrario,
XAF1
metilación no se detectó ADN en suero de los 88 controles sin cáncer.
A continuación, se confirmó la consistencia en el
XAF1
metilación entre tejidos tumorales y suero correspondiente. En 168 casos que mostraron
XAF1
metilación en los tejidos tumorales, 141 visualiza
XAF1
metilación en su suero emparejado, dando una consistencia de 83,9% entre ellos. Y en los 34 pacientes con cáncer gástrico sin
XAF1
metilación en sus tejidos con cáncer gástrico, sin metilación se encontró en todos los ADN de suero (Figura S2).
XAF1
metilación como un biomarcador para el diagnóstico del cáncer gástrico
Para evaluar el valor de
XAF1
metilación como un biomarcador para el diagnóstico de GC, que trazan características operativas del receptor (ROC) curvas y el área bajo la curva calculada (AUC) valores utilizando datos de la metilación del ADN de ambos tejidos GC y sueros. Tanto los análisis de la ROC de
XAF1
metilación en tejidos y sueros reveló la capacidad discriminativa significativa (Figura 6); el valor AUC de tejidos
XAF1
metilación fue 0,849 (intervalo de confianza del 95%, 0,806 a 0,892;
p Hotel & lt; 0,0001), el valor AUC de suero
AXF1
metilación fue 0,909 (intervalo de confianza del 95%, 0,875 hasta 0,942;
p Hotel & lt; 0,0001).
funcionamiento del receptor análisis de las características (ROC) se utilizó para evaluar la posibilidad de
XAF1
metilación en tejidos de cáncer gástrico o en el suero como un biomarcador para el diagnóstico de cáncer gástrico. Para
XAF1
metilación en tejidos de cáncer gástrico, un área bajo la curva ROC (AUC) es 0,849 (intervalo de confianza del 95%, ,806-0,892;
P & lt; 0,0001
). Para
XAF1
metilación en el suero, las AUC es 0,909 (intervalo de confianza del 95%, 0,875 a 0,942;
P & lt; 0,0001
).
Además, al igual
XAF1
estado de metilación en tejidos de cáncer gástrico y los sueros se correlacionó significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, la T-etapa, estadio clínico, y otros parámetros clínico-patológicas (todos los
p & lt; 0,05
, Tabla 2 ).
XAF1
metilación correlacionaron con un pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico
La correlación significativa de
XAF1
metilación con muchos parámetros clínico-patológicas (Tabla 2 ) sugirió que se puede asociar con el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico. Hasta la fecha de vencimiento de seguimiento, 113 de 168 pacientes con
XAF1
hipermetilación en tejidos de cáncer gástrico fue la progresión rápida de la enfermedad o murieron. La enfermedad La mediana de supervivencia libre (DFS) fue de sólo 23,4 meses. Por el contrario, en los 34 pacientes sin
XAF1
hipermetilación en sus tejidos con cáncer gástrico, sólo 5 pacientes se ponían cuesta arriba, y la mediana de SSE fue de 39,6 meses. El análisis de Kaplan-Meier demostró que los pacientes con
XAF1
hipermetilación en sus tejidos con cáncer gástrico mostraron un evidente la supervivencia peor que la que sin
XAF1
hipermetilación (
p & lt; 0,0001
) (Figura 7A). Del mismo modo, el análisis de Kaplan-Meier demostró que los pacientes con suero positivo
XAF1
metilación tenían DFS significativamente más bajo que en los pacientes sin suero
XAF1
metilación (
p
& lt; 0,0001 ) (Figura 7B), lo que indica que
XAF1
promotor de la metilación en el suero era un predictor desfavorable para los pacientes con cáncer gástrico.
los agains de la supervivencia libre de enfermedad acumulativa (DFS) Cum curvas son trazadas en
nivel de metilación t XAF1
ADN en tejidos de cáncer gástrico (a) y en el suero (B). En tanto A como B, se utilizó el análisis de Kaplan-Meier y
P & lt;.
0,0001, respectivamente
El análisis de regresión de Cox reveló que
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metilación en el suero es un factor independiente en la supervivencia de los pacientes: pacientes con
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metilación tuvo un peor pronóstico (
p & lt; 0,0001
; cociente de riesgos, 5.710; IC del 95%, 3.474~9.383). Además, estadios TNM y la edad al momento del diagnóstico podrían considerarse como el factor que influye en el pronóstico del cáncer gástrico, sólo cuando el efecto de
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metilación fue eliminado. Por otra parte, circulando metilado
XAF1 Hoteles en sangre tenía un mayor impacto en el pronóstico de aquel en estadios TNM (Tabla S1).
Detectar flanco positivo de circulación
XAF1
metilación Predice tumor recurrencia y de mal pronóstico
Entre los 202 pacientes que fueron evaluados para preoperatoria circulantes
XAF1
metilación, 72 pacientes recibieron exámenes de seguimiento de circular
XAF1
metilación 2~5 veces a intervalos de 1~6 meses después de la cirugía. Entre 12 pacientes recurrentes, 10 pacientes muestran negativo a positivo de transición en
XAF1
estado de metilación en sus sueros, los otros dos mostraron siempre positivo para
XAF1
metilación, lo que sugiere que el seguimiento de
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metilación en el suero puede ser un buen marcador para predecir la recurrencia del tumor (Tabla 3).
Discusión
XAF1 gratis (
XIAP
factor de -asociado 1) es una novela
XIAP
proteína que podría interferir en la combinación de la unión
XIAP
con las caspasas, suprime su protección en las células tumorales y los resultados en la apoptosis de las células tumorales [12 ] - [14]. La función de anti-apoptosis de
XIAP
se determina por la relación de los niveles de expresión de
XIAP
contra
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[15]. expresión o silencio de
Reducción XAF1
es un evento frecuente en los tumores humanos [16] - [19]. En el presente estudio, se confirmó que la primera
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la expresión de genes fue significativamente las reguladas tanto en el nivel de ARNm y el nivel de proteína en un gran panel de tejidos de cáncer gástrico primario, y la baja regulación de
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expresión se asoció significativamente con las fases del tumor, metástasis y así sucesivamente, lo que implica la pérdida de
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función en la progresión tumoral. Esto es consistente con otros informes de investigación [17] - [19]. Para explorar los mecanismos moleculares responsables de la
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silencio, hemos examinado
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la metilación del promotor en un gran panel tejidos de cáncer gástrico (
n
= 202) y los controles normales (
n
= 88) utilizando una tecnología MSP en tiempo real. Se detectó una frecuencia alta (83,2%) de la hipermetilación del ADN de
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en tejidos de cáncer gástrico. La hipermetilación del ADN de
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significativa correlación con la baja regulación de
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tanto en mRNA y los niveles de proteína en los tejidos de cáncer gástrico (Figura 3). Además, el tratamiento 5-Aza-CdR restauró significativamente
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expresión en
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ha silenciado líneas celulares de cáncer gástrico (Figura 4). Estos datos sugieren fuertemente que la frecuente baja regulación de
XAF1 Hoteles en células de cáncer gástrico está regulada por su promotor hipermetilación. Curiosamente, el tratamiento de células de cáncer gástrico con TSA, un inhibidor de histona desacetilasa también restauró
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expresión, solo o combinado con tratamiento con 5-Aza-CdR, lo que indica que la modificación de histonas también puede estar implicado en
XAF1
regulación
metilación del ADN puede utilizarse como un biomarcador potencial tumor en varios cánceres humanos [3] - [11], [23]. La presencia de ADN libre de células que circulan en la sangre periférica se ha descrito en pacientes con procesos malignos, y la liberación activa de ADN tumoral en la circulación se ha informado [29] - [31].