Extracto
metilación del ADN es un fenómeno epigenético sabe que juega un papel importante en el desarrollo y progresión de la humana cáncer. La enzima responsable de este proceso es la ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) que mantiene un patrón de metilación alterada copiándolo de padres a cadenas de ADN hija después de la replicación. metilación aberrante de las regiones promotoras de genes críticos para las funciones celulares normales es potencialmente reversible. Por lo tanto, la inactivación de DNMT1 parece ser un objetivo valioso para el desarrollo de terapias contra el cáncer. Actualmente, los inhibidores de DNMT más populares (DNMTi) son análogos de citidina como 5-azacitidina, 5-aza-2 'desoxicitidina (decitabina) y pirimidin-2-ona ribonucleósido (zebularine). En el cáncer colorrectal, las modificaciones epigenéticas juegan un papel esencial en cada paso de la carcinogénesis. Por lo tanto, hemos abordado la hipótesis de que los inhibidores de la metiltransferasa de ADN pueden potenciar los efectos inhibidores de los agentes quimioterapéuticos clásicos, tales como oxaliplatino y 5-fluorouracilo (5-FU), que se utilizan comúnmente en el tratamiento del cáncer colorrectal. Aquí, nuestro informe muestra que DNMTi puede tener interacciones positivas con agentes quimioterapéuticos estándar en el tratamiento del cáncer colorrectal. El uso de modelos farmacológicos para el análisis de la interacción fármaco-fármaco, hemos puesto de manifiesto que la combinación de la decitabina con 5-FU u oxaliplatino muestra la interacción más atractivo (sinergismo), mientras que el efecto de zebularine en combinación con agentes quimioterapéuticos es moderado y puede ser dependía fondo genético /epigenético de una línea celular o de drogas secundario usado en combinación. Nuestros resultados sugieren que DNMTi administra en combinación con quimioterapia estándar podría mejorar el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal
Visto:. Flis S, Gnyszka A, K Flis (2014) ADN metiltransferasa mejorar el efecto de agentes quimioterápicos en SW48 y HT-29 de cáncer colorrectal células. PLoS ONE 9 (3): e92305. doi: 10.1371 /journal.pone.0092305
Editor: Caterina Cinti, Instituto de Fisiología Clínica, c /o Toscana Vida Fundación de Ciencias, Italia |
Recibido: 18 Octubre, 2013; Aceptado: 20 Febrero 2014; Publicado: 27 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Flis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio contó con el apoyo de ninguna subvención. N405 139139 del Centro Nacional de Ciencias de Polonia (http://www.ncn.gov.pl/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más común en la población de no fumadores en todo el mundo. Se estima que más de 600.000 personas mueren por esta enfermedad cada año en todo el mundo [1]. Esto significa que el cáncer colorrectal es una causa principal de las muertes relacionadas con el cáncer. Por desgracia, el CRC se desarrolla durante mucho tiempo sin síntomas; Por lo tanto, la enfermedad se reconoce en etapas avanzadas. En general, el riesgo de CCR aumenta con la edad y es causada no sólo por alteraciones genéticas que involucran oncogenes y genes supresores de tumor, pero también es impulsado por alteraciones epigenéticas que implican cambios en los patrones de expresión de genes, que no son dependientes de cambios en la secuencia de ADN. Uno de los eventos epigenéticos es causada por metiltransferasas de ADN (DNMTs), que catalizan la adición covalente del grupo metilo a la posición 5 'de la citosina en el dinucleótido CpG del donante
S
-adenosylmethionine. la metilación de citosina se produce en regiones genómicas denominadas islas CpG y se sabe que altera la estructura de la cromatina que conduce a silenciamiento génico. Durante la progresión del cáncer colorrectal, se observa una desmetilación global del genoma junto con hipermetilación selectiva de los supresores de tumores, reguladores del ciclo celular y los genes proapoptóticos [2]. Debido a las modificaciones epigenéticas son potencialmente reversible, constituyen una estrategia terapéutica interesante con el uso de inhibidores de DNMT (DNMTi).
decitabina y zebularine son inhibidores DNMT, que pueden potencialmente revertir alteraciones epigenéticas que resulta en la reactivación de los genes silenciados, el bloqueo de cáncer la proliferación celular y /o la inducción de apoptosis [3], [4]. Ambos agentes parecen ser muy interesante y valioso para la terapia de tumores sólidos. La decitabina, un análogo de citidina, ha sido aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) para el tratamiento de neoplasias hematológicas [5], mientras que zebularine en comparación con otros análogos de citidina es más estable, menos tóxico y se puede administrar por vía oral [6 ].
parece ser razonable utilizar agentes de desmetilación en combinación con agentes quimioterapéuticos. Curiosamente, alentadores resultados se obtuvieron con la combinación de la decitabina y carboplatino en pacientes con tumores sólidos [7]. Los autores concluyeron que la decitabina combina de manera segura con carboplatino y que el régimen de causa cambios epigenéticos. En otro estudio de fase I, una combinación de cisplatino con decitabina dio lugar a una respuesta parcial en pacientes con cáncer de cuello uterino y dos respuestas menores: uno de cada paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas y el otro en pacientes con cáncer de cuello uterino [8]. Sin embargo, a pesar de líneas de evidencia indican que los agentes de desmetilación podría mejorar la actividad anticancerígena de los agentes quimioterapéuticos clásicos, el conocimiento de su uso para tumores sólidos sigue siendo insuficiente y necesita ser evaluado más
.
Por lo tanto, para poner a prueba esta hipótesis, la línea celular modelo de supervivencia CRC fue elegida para estudiar estas interacciones. Con la ayuda de este modelo y análisis farmacológico hemos diseñado el estudio para averiguar el resultado de la interacción entre los inhibidores de DNMT, decitabina o zebularine, y agentes quimioterapéuticos contra el cáncer clásicos utilizados en el tratamiento de la CRC, tal como oxaliplatino, una inter e intra ADN agente de reticulación, y 5-fluorouracilo, un inhibidor de la timidilato sintasa. Los estudios de interacciones entre los agentes quimioterapéuticos y agentes DNMTi parecen ser razonables, ya que todos estos compuestos han sido probados por sus propiedades citotóxicas contra las células normales [5], [9], [10] y todos ellos, excepto zebularine están aprobados por la FDA de Estados Unidos para uso médico.
Materiales y Métodos
cultivo de células y tratamiento de drogas
Como modelo de células de cáncer de colon, el cáncer colorrectal humano de células HT-29 y SW48 líneas, obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), se utilizaron. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, Gibco), glutamax 2 mM (Gibco), 100 unidades /ml de penicilina, 100 g /ml de estreptomicina y 250 ng /ml anfotericina (Gibco) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que incluye 5% de CO
2. Las células se incubaron con los fármacos durante 24, 48 y 72 h, pero sólo los resultados observados después del tratamiento de 72 h se presentan como sus extremos positivo llegar a ser más pronunciada.
Medicamentos
Se estudiaron los siguientes medicamentos : 5-fluorouracilo (5-FU), oxaliplatino, zebularine y decitabina (Sigma, St. Louis, MI, EE.UU.). Las concentraciones de los fármacos estaban en el rango de hasta 100 mM. Todos los agentes se disolvieron en dimetil sulfóxido Hybri-Max (DMSO, Sigma) y después se diluyeron en los medios de comunicación para los experimentos. La concentración final de DMSO, sin afectar a la supervivencia celular, se mantuvo a 0,2%. En todos los experimentos, las células de control se incubaron con DMSO.
MTT ensayo
El ensayo se basa en la capacidad de las células viables para reducir metabólicamente una sal de tetrazolio amarilla para un producto de formazán púrpura. Esta reacción requiere enzimas reductasa mitocondrial activos.
Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos (1 x 10
4 células /200 l /pocillo). Después de la incubación con los reactivos, el medio se retiró y las células se trataron con 50 l de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) solución -2,5-difeniltetrazolio (MTT, Sigma) durante 4 horas a 37 DO. A continuación, se añadieron 150 l de solución de solubilización (10% de dodecilsulfato de sodio, SDS) y la mezcla se incubó a 37 ° C durante la noche. El producto de formazano solubilizado se cuantificó por espectrofotometría utilizando un lector de placas de microtitulación, Power Wave XS (Bio-Tek, Winooski, VT, EE.UU.), a 570 nm de longitud de onda.
Análisis de las interacciones medicamentosas
Las células de SW48 y líneas de células HT-29 se incubaron simultáneamente durante 72 h con agentes quimioterapéuticos e inhibidores de DNMT o con cada agente solo. La naturaleza de las interacciones entre los fármacos estudiados fueron analizados con la ayuda de izobologram [11] y la combinación de índice (IC), métodos derivados del principio del efecto medio de Chou y Talalay [12], [13]. Los datos obtenidos de los experimentos de citotoxicidad se utilizaron para la evaluación matemática y cuantitativa de las interacciones fármaco-fármaco.
isobolos fueron definidos por los efectos de los fármacos estudiados pareadas. Los efectos obtenidos por la media máxima concentración inhibitoria (IC
50) de cualquiera de los fármacos dentro de la pareja formada la base de la línea de aditividad; sinergismo o antagonismo estaba presente, cuando el mismo efecto se obtiene por la combinación de fármacos en dosis más bajas o más altas, respectivamente.
Un paquete de software comercial, Calcusyn ver. 2.0 (Biosoft, Cambridge, Reino Unido), se utilizó para el análisis del efecto medio. Se calcularon los valores de CI en base a la fórmula: IC = (D)
1 /(D
x)
1 + (D)
2 /(D
x)
2 para los medicamentos que se excluyen mutuamente. En el denominador, (D
x) es para D
1 "solo" que inhibe un sistema de
x
%, y (D
x)
2 es para D
2 "solo" que inhibe un sistema de
x
%. En los numeradores, (D)
1 + (D)
2 "en combinación" también inhiben
x
%. valores de CI fueron generados en los diferentes niveles de efecto (Fa, la fracción afectada por D, es decir, el porcentaje de inhibición /100) de 0,05 a 0,95 (muerte celular 5-95%). La sinergia se indica con valores de CI & lt; 1, aditividad por valores de CI = 1 y el antagonismo por los valores de CI & gt;. 1 |
La citometría de flujo análisis
Para el análisis del ciclo celular de las células (~ 1 × 10
6) se suspendieron en 4 ml de etanol 80% (-20 ° C) y se incubó a -20 ° C durante 24 h, se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI) y 100 mg /ml de RNasa en solución PBST 0,1% (PBS suplementado con 0,1% de Triton X-100) durante 30 min en la oscuridad a 4 ° C. Las muestras se midieron utilizando un citómetro de flujo BD FACSCalibure (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Los histogramas de ADN se analizaron utilizando el software ModFit (BD Biosciences).
La apoptosis de las células se midió, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un V-FITC kit anexina (BD Biosciences). Se recogieron las células después del tratamiento, se lavaron dos veces con PBS y se centrifugó. El sedimento celular se resuspendió en tampón de unión enfriado con hielo. Las soluciones de la anexina V-FITC y PI se añadieron a la suspensión de células y se mezclaron suavemente. Las muestras se incubaron a continuación durante 15 min en la oscuridad antes de citometría de flujo análisis.
Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron en 1,5% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y se permeabilizaron con metanol frío durante 20 min a 4 ° C. Después del lavado, las células se incubaron con el anticuerpo primario deseo (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) contra fosfo-ATR [(P) -Ser428, Cat. N ° 2853] y fosfo-ATM [(P) -Ser1981, Cat. No. 5883] a 1: 100 dilución en 0,5% de BSA /PBS durante 1 h a TA. Después de lavar con PBS, el anticuerpo secundario apropiado conjugado con FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.) se añadió a 1: 500 dilución en 0,5% de BSA /PBS y se incubó durante 30 min a TA. Después del lavado, las células fueron analizadas por citometría de flujo
.
Para todas las aplicaciones 10.000 eventos por muestra fueron analizadas por fluorescencia de células activadas (FACS).
Semi-RT-PCR cuantitativa
los niveles de mRNA de
CCNE1
,
ATM
y
GAPDH
fueron analizados por RT-PCR utilizando ARN total a partir de células HT-SW48 29 y aislado utilizando el GenElute ™ mamíferos total RNA Miniprep Kit (Sigma), como se describe por el fabricante. El cien ng de ARN total se utilizó en la reacción de transcripción inversa con Omniscript transcriptasa inversa (Qiagen, Hilden, Alemania) y oligo (dT)
18 imprimación (Fermentas, Vilnius, Lituania). Las amplificaciones por PCR se realizaron en un volumen total de 50 l de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 3 l de cDNA como plantilla y los pares siguientes cebadores:
CCNE1
(5'-3-AACTCAACGTGCAAGCCTCG ', 5'-CATCTCCTGAACAAGCTCCA-3'),
ATM gratis (5'-GCCTTGAGTCTGTGTATTCG-3 ', 5'-CCACTCAGAGACTCCACAGC-3') y
GAPDH gratis (5'-3-TCACCATCTTCCAGGAGCGA ', 5'-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3'). El
GAPDH
niveles de mRNA se utilizaron como controles internos. Los fragmentos amplificados se separaron en geles de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y se fotografiaron bajo luz UV.
Preparación de lisados de proteínas y Western Blot
Las células se lavaron con PBS frío buffer y después proteínas a partir de cinco compartimentos celulares se aislaron utilizando el kit subcelular de proteínas y fraccionamiento de células cultivadas (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). La concentración de proteína en las muestras se midió usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). Las muestras que contenían 60 g de proteína se desnaturalizaron y se fraccionó por 7, 12 o 15% de SDS-PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpos anti-humanos específicos para: ciclina A1 y D1, PARP, caspasa-3 y -8 (Santa Cruz Biotechnology); (Cat. No. 610982, BD Biosciences) p21 (Nº Cat. 554228), p53 (Nº Cat. 610183), Bax; β-actina (Cat. No. A1978, Sigma); y el daño del ADN Antibody Sampler Kit (fosfo-Chk1 [(P) -Ser296], fosfo-Chk2 [(P) -Thr68], fosfo-histona H2A.X [γH2A.X, (P) -Ser139], fosfo- p53 [(P) -Ser15], y fosfo-BRCA1 [(P) -Ser1524]; Nº Cat. 9947; Cell Signaling Technology). Todos los anticuerpos en el daño del ADN de anticuerpos Sampler Kit reconocen sus proteínas objetivos sólo cuando se modifican en los sitios indicados. Por lo tanto, no se utilizaron anticuerpos contra las proteínas no modificadas.
Anticuerpo
Anti-Bax reconoce forma Bax-α humano. Un corte y empalme alternativo de Bax pre-ARNm produce la forma de membrana integral Bax-α y las dos formas citosólicas ß y γ. Este anticuerpo se recomienda por la empresa BD para la detección de apoptosis. El anticuerpo anti-p53 reconoce la región terminal C de la proteína (la A.A. 195-393 se usó como un antígeno) y es capaz de reconocer tanto la de tipo salvaje y formas R273H de p53. Este anticuerpo también se recomienda por la empresa BD para la detección de apoptosis
.
La señal en transferencias se detectó mediante un método colorimétrico usando el kit de CN /DAB sustrato (Pierce) y Kit SignalBoost inmunorreacción Enhancer (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.).
potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ
m) de medición
El Δ
Ψ
m
se midió por citometría de flujo utilizando 10 mg /ml de 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolo- yoduro de carbocianina (JC-1 tinte, Sigma), que tiñe las mitocondrias en las células vivas. En las células sanas, el tinte se acumula en la mitocondria, formando agregados que emiten fluorescencia roja, mientras que en las células apoptóticas del colorante permanece en forma monomérica en el citoplasma y emite fluorescencia verde. Las células fueron tratadas con agentes quimioterapéuticos, inhibidores de DNMT o sus combinaciones para 72 h y se tiñeron como se describe por Roemer Mahyar-
et al.
[14] y luego examinado por FACSCalibure citómetro de flujo. Las mitocondrias contienen rojos JC-1 agregados en las células sanas fueron detectables en el canal FL2, mientras que el verde JC-1 monómeros en células apoptóticas fueron detectables en el canal FL1.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media Los valores ± SD. Las comparaciones estadísticas entre los grupos se realizaron mediante t-test o de un solo sentido el análisis de varianza de Student (ANOVA) seguido de Tukey
post hoc
prueba. La significancia se asumió a
P Hotel & lt; 0,05 (marcados con asteriscos en los gráficos).
Resultados
Estudios de crecimiento y los efectos de tratamientos de combinación de agentes quimioterapéuticos con DNMTi
Como primer paso, se analizó el efecto de los agentes aplicarse solo en SW48 y la viabilidad celular HT-29. Las células se trataron con 10 a 100 mM de los agentes evaluados. Los resultados de ensayo de viabilidad celular MTT indicaron que las células incubadas con CRC oxaliplatino y 5-FU mostró el más potente inhibición del crecimiento celular después de 72 h de tiempo de incubación (Figura 1). Los efectos inhibidores de agentes quimioterapéuticos fueron dependientes de la dosis y los coeficientes de correlación (estimado a partir de las curvas dosis-respuesta inhibidoras) estaban por encima de 0,9. agentes de desmetilación, decitabina y zebularine, han demostrado diferentes modos de inhibición:. decitabina ya estaba empezando inhibidora a la concentración (20 mM) y zebularine mostró efecto inhibitorio de 80 y 40 mM de SW48 y células HT-29, respectivamente
las células se trataron por separado o en combinaciones con las dosis acusadas de los agentes para 72; 5-FU, 5-fluorouracilo; DAC, decitabina; y ZEB, zebularine. Cada punto representa la media ± desviación estándar (n = 5), asteriscos indican una significación a
P
. & Lt; 0,05 para la comparación con oxaliplatino y 5-FU solo
Hemos probado también el tratamiento de los agentes quimioterapéuticos en combinación con DNMTi en CRC células supervivencia (Figura 1). La decitabina potenció los efectos inhibidores de oxaliplatino a la concentración de 20 mM hasta 100 mM, mientras que su impacto en la actividad 5-FU se inicia en 80 mM. Zebularine probó a concentraciones de hasta 100 mM ligeramente potenciada por los efectos inhibidores de cualquiera quimioterapéuticos (Figura 1).
El tipo de interacciones medicamentosas de dos grupos de compuestos evaluados fueron analizados con la ayuda de métodos de efecto isobolográfico y la mediana. Los isobologramas muestran resultados para el nivel de simple efecto 50% e indican que la interacción de la decitabina con agentes quimioterapéuticos resultados en efecto sinérgico, mientras que la administración de zebularine con oxaliplatino o 5-FU se traduce en efectos sinérgicos o aditivos ligeramente (Figura 2A).
A. Isobologramas a un nivel de efecto del 50%. Las concentraciones de fármacos en particular se indican en ejes X e Y.. Los isobologramas se construyeron mediante la conexión del IC
50 valores de agentes desmetilantes (en la ordenada) con el IC
50 de oxaliplatino o 5-FU representa en el eje de abscisas. Cuando las dosis de dos agentes en combinación son inferiores o superiores a las dosis de aditivos, la sinergia o antagonismo está presente, respectivamente. B. Los valores de índice de combinación (IC) con un intervalo de confianza del 95% en todos los niveles de efecto según lo calculado por el software Calcusyn. Un valor CI significativamente menor que 1 indica sinergia, un valor CI insignificantemente diferente de 1 indica de adición y un CI significativamente mayor que 1 indica antagonismo.
análisis realizado por el método de efecto de mediana confirmó que la combinación de la decitabina y agentes quimioterapéuticos en ambas líneas celulares produce efectos sinérgicos a nivel de la muerte de células 50% (Fa = 0,5), alcanzando valores de CI (índice de combinación) y lt; 0,9 (Figura 2B).
Combinación de zebularine y quimioterápicos para Fa = 0.5 efectos sinérgicos o aditivos ligeros indicados.
Análisis de daños en el ADN
Para dilucidar el mecanismo de la apoptosis , se analizó el estado de fosforilación de las proteínas son los principales puntos de control de señalización en respuesta al daño del ADN.
al detectar el daño en el ADN, serie de eventos de señalización celular diseñado para mantener la integridad y el funcionamiento adecuado de las células y las vías biológicas se involucrado. Las proteínas elegidas para la prueba de Western Blot inician cascadas de eventos que bloquean la progresión del ciclo celular, ya sea para que haya tiempo para reparar el ADN dañado o activar las vías de muerte celular si demasiado daño se haya incurrido. Fosforilada H2A.X histona se localiza en los sitios de daño de ADN y activa las quinasas de ATM /ATR, los mediadores centrales de la respuesta al daño del ADN. A su vez, quinasas ATM /ATR inician cascadas, que inhiben la progresión en la mitosis a través de la activación de las quinasas Chk (Chk1 para ATR y Chk2 para ATM) o tumor p53 supresor de la proteína, lo que ya sea la detención del ciclo celular y la reparación del ADN o la apoptosis mediante la regulación de p53 efectores. BRCA1, como el guardián de la estabilidad genómica, también es fosforilada por ATM, ATR, y Chk2 en respuesta al daño del ADN y puede co-localizar con otras proteínas en los sitios de daño en el DNA [15].
Se ha observado una significativa la fosforilación de la histona H2A.X en Ser139 en respuesta a agentes quimioterapéuticos y sus combinaciones con DNMTi, especialmente en las células HT-29. Se observaron niveles más bajos de γH2A.X (fosfo-H2A.X) en células tratadas con agentes únicos DNMTi. También observamos niveles elevados de fosforilación de las proteínas como ATR en Ser428, ATM en Ser1981, p53 en Ser15, BRCA1 en Ser1524 así como quinasas Chk1 y Chk2 en Ser345 y Thr68, respectivamente (Figura 3A y B). estado de fosforilación de las quinasas Chk1 y Chk2 fue más pronunciado en HT-29 a continuación, en las células SW48. En las células SW48, los niveles de fosforilación de Chk1 y Chk2 quinasas fue mayor después del tratamiento combinado con oxaliplain y decitabina en comparación con el tratamiento con ambos agentes quimioterapéuticos y DNMTi aplica individualmente (Figura 3B).
A. Se utilizó cuantificación de ATR y ATM siguiente nivel de fosforilación 72 (IMF). Datos representaba la media ± SD (n = 3). Diferencia significativa a
P
≤0.05 se indica con un asterisco (*). B. Análisis de los niveles de fosforilación de proteínas utilizando el método de transferencia Western. La detección de β-actina se utilizó como control de carga de gel. OXA, oxaliplatino; 5-FU, 5-fluorouracilo; DAC, decitabina; ZEB, zebularine; au, unidades arbitrarias.
Las combinaciones de agentes quimioterapéuticos con DNMTi influyen en la progresión del ciclo celular e inducir la apoptosis
En el cultivo de control, el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular fue estable, mientras que los compuestos ensayados tenían diversos efectos sobre la progresión del ciclo celular y la apoptosis. El tratamiento con los agentes quimioterapéuticos como resultado un aumento constante en el número de células en la fase S a expensas de la fase G1. La decitabina detenido el ciclo celular en la fase M o S G2 /en el SW48 y células HT-29, respectivamente. Zebularina no ejerció cambios estadísticamente significativos en las dos líneas celulares, en comparación con los controles.
La combinación de la decitabina con oxaliplatino o 5-FU indujo una parada del ciclo celular en el /G2 /límite de la fase S M y en la fase S, respectivamente, en ambas líneas celulares (Figura 4). La combinación de zebularine con oxaliplatino aumento del porcentaje de la células HT-29 en el S /G2 /límite de la fase M, mientras que la combinación de zebularine con 5-FU aumentó el porcentaje de estas células en la fase S del 12% al 36%, en comparación con controlar. En el caso de las células SW48, las combinaciones de agentes quimioterapéuticos con zebularine provocaron la detención de células en la G2 /M o fase S (Figura 4A).
A. Los cambios en la distribución del ciclo celular de SW48 y células HT-29 después de 72 h de tratamiento con los agentes evaluados. Las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y luego analizadas por citometría de flujo. El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se determinó utilizando ModFit LT ™ (versión 3.0). Cada barra representa la media ± S.D.. (N≥4). Diferencia significativa a
P Hotel & lt; 0,05 se indican con asterisco (*). B. Análisis de
CCNE1
y
ATM
niveles de mRNA por el método semi-cuantitativos RT-PCR después de 72 h de incubación de las células CRC con agentes quimioterapéuticos, DNMTi y sus combinaciones en las concentraciones que se indican. M, marcador [pb];
GAPDH
, transcripción de codificación deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato, un gen expresado constitutivamente, que se utiliza como un control interno. análisis de transferencia de Western C de las proteínas reguladoras del ciclo celular. El β-actina se utilizó como control de carga de gel. OXA, oxaliplatino; 5-FU, 5-fluorouracilo; DAC, decitabina; ZEB, zebularine.
El análisis de la expresión génica reveló que la combinación de la decitabina con oxaliplatino, en comparación con oxaliplatino solo, se incrementó el nivel de ARNm de
ATM
en ambas líneas celulares, así como
CCNE1
en la línea celular SW48 (Figura 4B). Las combinaciones de agentes de desmetilación con 5-FU mostró una tendencia similar, pero a un nivel inferior a las combinaciones con oxaliplatino. El análisis de proteínas específicas para la progresión del ciclo celular reveló que la combinación de DNMTi con agentes quimioterapéuticos, en comparación con oxaliplatino /5-FU solo, aumentó el nivel de ciclina A1 y la proteína p53 y disminuyó el nivel de ciclina D1 (pero no en el SW48 células) (Figura 4C y 5B). La combinación de quimioterapia con zebularine aumentó el nivel de p21 en células SW48 (Figura 4C).
A. Detección de apoptosis por la anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) /yoduro porpidium (PI) análisis. Los datos se expresan como las medias ± S.D.. (N≥4). Un asterisco (*) indica que la inducción de apoptosis por los agentes evaluados fue significativo en comparación con la combinación de agentes quimioterapéuticos e inhibidores de DNMT
frente
agentes quimioterapéuticos se aplica solo (
P
& lt; 0,05 ). análisis de transferencia de Western B. de los niveles de proteínas pro-apoptóticas. El β-actina se utilizó como control de carga de gel. citogramas C. representativos de citometría de flujo experimentos que demuestran los cambios en Δ
Ψ
m Hoteles en CRC líneas de células después de 72 h de incubación con agentes quimioterapéuticos, inhibidores Dnmt y sus combinaciones. Las células se tiñeron con JC-1. Las células en el cuadrante R2 se contaron como células privadas de potencial de membrana mitocondrial. Un asterisco (*) indica una diferencia significativa entre los grupos experimental y grupo control a los
P Hotel & lt; 0,05. OXA, oxaliplatino; 5-FU, 5-fluorouracilo; DAC, decitabina; ZEB, zebularine.
Dado que el tratamiento prolongado con agentes quimioterapéuticos o DNMTi podrían inducir la muerte celular, se analizaron tanto el marcador de apoptosis temprana. Para este fin se utilizó la anexina V, que reconoce la fosfatidilserina (PS). Durante la inducción de la apoptosis, la asimetría de la membrana se pierde y la translocación de PS de intracelular de hoja externa de la membrana plasmática tiene lugar. Como era de esperar, el tratamiento de las células de CRC con oxaliplatino o 5-FU solo apoptosis inducida en ~ 30% de las células, mientras que las combinaciones de los agentes evaluados generalmente aumentó el número de células apoptóticas de ~ 45% a 60% (Figura 5A ) con la excepción de las células HT-29 incubadas con agentes desmetilantes y oxaliplatino juntos. En este caso, la inducción de la apoptosis estaba en un nivel más bajo que para otras combinaciones, pero todavía estadísticamente significativa en comparación con oxaliplatino se aplica solo. Además, la inducción de la apoptosis en las células de CRC por combinación de agentes quimioterapéuticos con agentes desmetilantes fue confirmado por los cambios en el nivel de proteínas de pro-caspasa-3 y -8. La escisión proteolítica de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) se aumentó después de la incubación de las células con agentes quimioterapéuticos y agentes demethylating (Figura 5B).
Los cambios en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ
m)
Durante la apoptosis temprana la interrupción del potencial de membrana mitocondrial Δ
Ψ
m
puede ocurrir lo que resulta en un rápido colapso del gradiente electroquímico. En este trabajo, hemos explorado el efecto de DNMTi, quimioterapéuticos o sus combinaciones sobre Δ
Ψ
m fotos: por tinción de las células con JC-1 tinte. El análisis de citogramas mostró que las células de control emite la fluorescencia roja debido a la alta Δ
Ψ
m
, mientras que las células tratadas con agentes quimioterapéuticos y agentes DNMTi exhiben una mayor despolarización de la membrana, detectada por fluorescencia de color verde, y el efecto se mantuvo (oxaliplatino + DNMTi en la línea celular HT-29) o más fuerte cuando las células fueron co-incubadas con estos compuestos (Figura 5C).
Discusión
en los años 90 se ha confirmado que los resultados de CRC no sólo de la acumulación de mutaciones genéticas, sino también como consecuencia de alteraciones epigenéticas del genoma celular que transforma un epitelio glandular normal, en adenocarcinoma. Está bien establecido que la alteración epigenética más ampliamente caracterizado CRC es el gen promotor de la hipermetilación, que se produce en las islas CpG que a menudo están presentes en la región 5 'de aproximadamente 60% de los genes. Este fenómeno resulta de la mayor actividad de la enzima DNMT cuya sobreexpresión es una característica de casi todas las células transformadas [16]. Un número creciente de genes que se expresan en el colon ahora se ha demostrado que se hypermethylated y silenciado en el cáncer colorrectal. Estos incluyen genes implicados en el control del ciclo celular, el crecimiento, la diferenciación, la angiogénesis, la adhesión, la metástasis o la reparación del ADN [17]. Desde modificaciones epigenéticas son potencialmente reversible, se ha levantado la idea de que el empleo de inhibidores de DNMT puede mejorar el tratamiento de la CRC, especialmente ya que los agentes quimioterapéuticos clásicos son de eficacia limitada en el tratamiento del cáncer colorrectal. Por lo tanto el desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de tales tumores es un desafío para oncología [18]. Es por ello que hemos presentado los resultados de
in vitro
estudio de las interacciones de los fármacos citotóxicos estándar, 5-FU y oxaliplatino [19], con inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMTi), tales como la decitabina y zebularine.
DNMTis recientemente ha ganado mucha atención como agentes que inhiben el crecimiento del cáncer incluyendo carcinoma colorrectal [20]. Sin embargo, el papel de su potencial terapéutico puede ser evaluado correctamente sólo en combinación con agentes clásicos utilizados en el tratamiento de CRC, ya que todos los nuevos agentes terapéuticos se presentan como opciones de add-on. Desde el 5-fluorouracilo y oxaliplatino constituyen la columna vertebral de tratamiento CRC [19], hemos investigado los efectos sobre la supervivencia CRC células añadiendo decitabina o zebularine - los inhibidores de la ADN metiltransferasa - a estos agentes quimioterapéuticos
Hemos confirmado en
in vitro
condiciones que los agentes estudiados administrados solos son capaces de inducir la inhibición del crecimiento de las células cancerosas con el fin comparable de potencia calculado sobre la base del porcentaje de la supervivencia celular (Figura 1). Por otra parte, se ha encontrado un aumento de la inhibición de la CRC crecimiento celular después del tratamiento con los agentes contra el cáncer se aplica en combinación (Figura 1). Los isobologramas, construidos sobre la base de IC
50 valores, indicaron interacciones sinérgicas o aditivo entre agentes quimioterapéuticos y agentes DNMTi. La decitabina tenía las interacciones más favorables (sinergia) en combinación con agentes quimioterapéuticos en las dos líneas celulares;