Extracto
La quimioprevención se presenta una estrategia importante para el tratamiento médico de cáncer colorrectal. La mayoría de los fármacos utilizados para el tratamiento del cáncer colorrectal inducen daños en el ADN-alquilación, que se reparan principalmente por la vía de reparación por escisión de base (BER). Por lo tanto, el bloqueo de la vía de REC es una opción atractiva para inhibir la propagación del cáncer colorrectal. El uso de un
in silico
enfoque, hemos realizado una pantalla basada en la estructura de acoplamiento de moléculas pequeñas en el ADN polimerasa β (beta-Pol) y se identificaron un compuesto anti-Pol-β potente, NSC-124854. Nuestro objetivo fue examinar si NSC-124854 podría mejorar la eficacia terapéutica del agente de alquilación de ADN, temozolomida (TMZ), mediante el bloqueo de la BER. En primer lugar, se determinó la especificidad de NSC-124854 de Pol-β mediante el examen de
in vitro
actividades de APE1, Fen1, ADN ligasa I, y Pol-β-dirigida de un solo nucleótido (SN) - y largo parche (LP) -BER. En segundo lugar, se investigó el efecto de NSC-124854 sobre la eficacia de la TMZ para inhibir el crecimiento de reparación de genes-deficiente (MMR) y líneas celulares de cáncer de colon MMR-dominio utilizando
in vitro
ensayos por clonación. En tercer lugar, hemos explorado el efecto de NSC-124854 en TMZ inducida por
in vivo
inhibición del crecimiento tumoral en xenoinjertos de colon MMR-deficientes y MMR-dominio implantados en ratones SCID hembras homocigotos. Nuestros datos mostraron que los NSC-124854 tiene una alta especificidad de Pol-β y bloqueado dirigidas-Pol-β actividades Sn y LP-BER en
in vitro
sistema reconstituido en. Por otra parte, el NSC-124854 indujo eficazmente la sensibilidad de TMZ a las células de cáncer de colon MMR-deficiencia de MMR y con dominio tanto
in vitro
cultivo celular y
in vivo y modelos de xenoinjertos. Nuestros hallazgos sugieren un nuevo potencial estrategia para el desarrollo de inhibidor altamente específico basado en la estructura para la prevención de la progresión del tumor de colon
Visto:. Jaiswal AS, Banerjee S, R Aneja, Sarkar FH, Ostrov DA, Narayan S (2011) ADN polimerasa β como un nuevo objetivo para la intervención quimioterapéutico del cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (2): e16691. doi: 10.1371 /journal.pone.0016691
Editor: Ben Ko, Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 4 de octubre de 2010; Aceptó 3 de enero de 2011; Publicado: 2 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Jaiswal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Nacional del Cáncer Instituto, Institutos nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE.UU. (R01 CA-097 031 y CA-100247). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común y la segunda causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. En el año 2010, un estimado de 102.900 nuevos casos colorrectal serán diagnosticados y 51.370 muertes se producen sólo en los Estados Unidos. Aunque en las dos últimas décadas un avance apreciable se ha hecho en las opciones de tratamiento, la tasa de mortalidad de esta enfermedad no se mejora mucho. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias para mejorar el pronóstico de esta enfermedad. Durante muchos años, la primera elección del fármaco quimioterapéutico para el cáncer colorrectal ha sido del 5-fluorouracilo (5-FU). Se utiliza sobre todo como terapia neoadyuvante con la radiación y en combinación con varios otros fármacos quimioterapéuticos, tales como mitomicina, cisplatino, oxaliplatino, camptosar, eloxatin, Avastin, Erbitux, y panitumumab para el tratamiento de cáncer colorrectal que se convierte en metástasis [2]. Estos medicamentos dan mejores resultados en dosis más altas, pero causan efectos secundarios graves, incluyendo la muerte de las células sanas de revestimiento de la boca, el revestimiento del tracto gastrointestinal, los folículos pilosos, la médula ósea y causar lesión hepática e hipertensión [3].
las mutaciones en el
poliposis adenomatosa coli (APC)
gen es un evento temprano en la poliposis adenomatosa familiar (FAP), un síndrome en el que hay una predisposición hereditaria al cáncer de colon [4], [5]. La mayoría de las mutaciones de la
APC
gen se producen en la región de la mutación grupo (MCR) y dan como resultado la producción de una proteína truncada. Este truncamiento compromete varias funciones de APC, que está implicado en la inestabilidad cromosómica y el funcionamiento anormal de la vía de Wnt-señalización, regulación del ciclo celular, la estabilización del citoesqueleto microtubular, interacciones célula-célula y rep ADN y [6] - [14]. Estudios recientes sugieren que la APC nuclear, a través de una región (aminoácidos 1441-2077) que se trunca en la mayoría de los tumores colorrectales, colabora en el reclutamiento de DNAPKcs a la cromatina ADN dañado y mejora la respuesta temprana a las roturas de doble hebra (DSB ) la reparación del ADN [15]. APC también interactúa directamente con el ADN genómico, preferentemente con ricos secuencias de A /T [16], lo que implica un papel de la APC en la replicación del ADN [17]. Se ha sugerido que APC a través de su extremo C-terminal (aminoácidos 2140-2421) interactúa con el ADN y regula negativamente la progresión del ciclo celular a través de la inhibición de la replicación del ADN mediante la interacción directa con el ADN [17]. Hemos demostrado previamente que el tratamiento con ADN de los agentes de alquilación aumenta el nivel de APC en células de cáncer de colon [14]. Además, hemos demostrado que la APC interactúa con el ADN polimerasa β (β-Pol) y la solapa endonucleasa-1 (Fen1) y bloques de Pol-β-dirigida de un solo nucleótido (SN) - y largo parche (LP) de reparación por escisión -base (BER) a actividades afectan a la respuesta celular a la quimioterapia [14], [18]. Sobre la base de estos estudios, parece ser que la interacción de APC con Pol-β y otras proteínas BER puede ser un objetivo apropiado para la intervención quimioterapéutica del crecimiento del cáncer colorrectal.
El uso de ADN de los agentes de alquilación como fármacos quimioterapéuticos es basa en su capacidad para desencadenar una respuesta de muerte celular [19], y su eficacia terapéutica se determina por el equilibrio entre el daño y reparación del ADN. Las lesiones de daño inducido por el ADN-alquilación se reparan por el REC, O
6-metiltransferasa de ADN-metiltransferasa (MGMT) y las vías de reparación desajuste (MMR). Muchos tumores de colon se vuelven resistentes a los agentes de ADN-alquilante debido a la sobreexpresión de MGMT o MMR-deficiencia de [20]. Las células deficientes en MGMT son incapaces de procesar la O
6meg durante la síntesis de ADN, y si no se repara, un G: C a G: T transición se produce la mutación [21]. En estudios previos, el papel de la vía BER también se ha implicado en la resistencia celular a TMZ [22], [23], que depende de la expresión de genes BER específica y la actividad [24]. En los últimos años, los medicamentos contra el cáncer que se han desarrollado principalmente como objetivo la MGMT y las vías de MMR [25], [26]. Desde los cánceres colorrectales MMR-deficientes suponen un mayor riesgo de resistencia a los fármacos de ADN-alquilación de debido a la sobreexpresión de MGMT o MMR-deficiencia de [27] - [29], es crítico para descubrir una estrategia quimioterapéutico que puede ser útil para el tratamiento de ambos tumores colorrectales deficientes de MMR y MMR-dominio. Curiosamente, a pesar de REC es responsable de la reparación de 70%, 5% y el 9% de N
7-metilguanina (MEG), n
3-MEG, y N
3-metiladenina (MEA) lesiones , respectivamente, inducida por el fármaco de ADN-alquilación de temozolomida (TMZ; NSC-362856) [23], [30], [31], la utilidad potencial de BER bloqueo vía no se ha explorado a fondo. Por lo tanto, con la combinación de agentes de bloqueo de BER y el tratamiento TMZ, el resultado clínico de la eficacia quimioterapéutica de TMZ se puede mejorar. Estudios anteriores también apoyan que el daño inducido por alquilación de ADN se repara principalmente por la vía BER [26], [27]. En el pasado, vía de REC se ha utilizado como diana para el desarrollo de nuevos fármacos, pero la implicación clínica de estos fármacos está todavía bajo investigación [31] -.
TMZ ha sido exitosamente utilizada [36] para el tratamiento de melanoma metastásico y glioblastoma multiforme, este último en combinación con radioterapia [37], [38], pero se ha demostrado ser menos eficaz en el tratamiento de otros tumores malignos. Un estudio clínico de fase II de TMZ en pre-seleccionado cánceres avanzados del tracto aerodigestivo, incluyendo neoplasia colorrectal, ha sido recientemente completado por Schering-Plough, Kenilworth, NJ, mostrando sólo una respuesta parcial al tratamiento (http://clinicaltrials.gov/CT2 /mostrar /NCT00423150). En una fase más temprana que el estudio clínico de TMZ, también se observó una respuesta parcial del fármaco sobre el cáncer colorrectal metastásico, lo que sugiere una considerable resistencia del tumor al tratamiento [39]. Para superar la resistencia de TMZ, se realizó un estudio clínico de fase II en los que lomeguatrib se combinó con TMZ, pero los resultados no fueron muy significativas [40]. Por lo tanto, hay una necesidad urgente del desarrollo de una nueva estrategia mediante la cual la eficacia de la TMZ se puede aumentar para el tratamiento de los cánceres colorrectales.
Como la mayoría de los fármacos quimioterapéuticos causan daños en el ADN y la resistencia debido a la activación de la vía (s) de reparación del ADN, la orientación proteínas de estos vía (s) para bloquear su actividad puede ser una estrategia prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos con mayor eficacia a los tumores quimio-resistentes y sensibles. En los últimos años, el diseño virtual basado en estructura y la estructura tridimensional de una interacción fármaco-diana con los inhibidores de bajo peso molecular se ha utilizado para guiar el descubrimiento de fármacos razón de [41]. El diseño de fármacos asistido por ordenador podría encontrar nuevos compuestos de plomo y ayudado en la optimización de la estructura para las pruebas biológicas y farmacológicas [42] - [44]. En el presente estudio, se realizó un acoplamiento molecular basado en la estructura de Pol-β en el sitio donde dirige Pol-β-poliposis adenomatosa coli (APC) interactúa y bloques BER [14], [45], [46]. El acoplamiento molecular basado en la estructura se considera un enfoque adecuado para el desarrollo de nuevos fármacos, ya que este enfoque se dirige a la proteína específica y vía específica [47]. Sobre la base de los esfuerzos en silico, hemos identificado un inhibidor molecular pequeña altamente potente peso, NSC-124854 {[5- (4-amino-6-yodo-2-oxo-5,6-dihidropirimidin-1-il) -3- hidroxi-oxolan-2-il] ácido methoxyphosphonic}, que interactúa específicamente con Pol-β-dirigida de un solo nucleótido (SN) Pol-β y bloques - y largo parche (LP) -BER. Aquí presentamos los datos que describen que la NSC-124854 puede mejorar la eficacia de la TMZ en células de cáncer de colon MMR-deficientes y con dominio
in vitro Opiniones y
in vivo y modelos. Proponemos que estos hallazgos preclínicos establecerá un nuevo paradigma para el manejo clínico de cáncer de colon.
Resultados
Proyección de pequeñas moléculas para inhibir la actividad de desplazamiento de cadena dirigida Pol-β-
Para identificar un compuesto anti-Pol-β potente, se utilizó un
in silico
alto rendimiento enfoque de acoplamiento molecular basado en la estructura y se seleccionan aproximadamente 140.000 compuestos de moléculas pequeñas (peso molecular & lt; 500 daltons) por su capacidad para interactuar con el sitio de unión a APC de Pol-β (Fig. 1
a
) [48]. Se pidió a los 22 compuestos moleculares pequeños con mayor puntuación del Programa terapéutica del desarrollo (DTP) del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) para la evaluación funcional. Se realizó la selección inicial de los compuestos para determinar su capacidad para inhibir la síntesis de desplazamiento de cadena dirigida-Pol-β. Hemos utilizado un
in vitro
sistema de ensayo en reconsitiuted en estos estudios. Se seleccionaron 22 compuestos con mayor puntuación y los datos de 12 compuestos que aquí se muestra (figura 2
Un CD -.
C
). Entre 22 pequeñas moléculas, NSC-21371 y NSC-91855 dirigido por Pol-β inhibe la síntesis de la cadena de desplazamiento a 125 mM de concentración (Figura 2
B Opiniones;. Comparar el carril 3 con carriles 9-13 y 19-23 , respectivamente). Estos compuestos moleculares pequeños no afectaron a la actividad incorporación 1-nt (producto 24-mer) de Pol-β en cualquier concentración ensayada. Sin embargo, NSC-124854 inhibe Pol-β-dirigido actividad desplazamiento de cadena en 5 concentración mu M, mientras que las concentraciones más altas de NSC-124854 abrogadas por completo la formación de productos de línea de desplazamiento (Fig 2
A
;. Comparación de carril 3 con los carriles 4-8 respectivamente). Cuando la concentración de NSC-124854 se incrementó aún más a 50 M o más, la actividad de la incorporación 1-nt (24-mer producto) de Pol-β fue completamente bloqueado como se muestra por la acumulación de producto de la incisión 23-mer y la falta de 1 producto de la incorporación nt, lo que refleja una pérdida completa de la actividad Pol-β (Fig. 2
un
, comparar el carril 3 con 4-8, respectivamente). Estos resultados sugieren que NSC-124854 es un inhibidor más potente de la actividad de Pol-β entre todos los compuestos ensayados.
Panel
A
muestra la interacción predicho de NSC-124854 sobre la base de la estructura cristalina de Pol-β. Pol-β se muestra en oro y cadenas laterales predijo para formar contactos con NSC-124854, Asp17 y Arg89, se representan con oro para el carbono, el nitrógeno y el azul para el color rojo para el oxígeno. Los residuos del bolsillo de unión de APC, Thr79, Lys81, Arg83 de Pol-β se muestran como esferas de color gris para el carbono, el nitrógeno y azul para el color rojo para el oxígeno. contactos polares se representan como líneas discontinuas amarillas entre NSC-124854 y residuos Pol-ß Lys81 y Arg89. La figura fue hecha con PyMOL. Panel de
B Opiniones representa las interacciones Pol-ß-ligando predecir sobre la base de la orientación acoplamiento molecular planteado de NSC-124854. se muestran las interacciones mediadas por enlaces de hidrógeno (verde) y por los contactos hidrofóbicos (gris). NSC-124854 y Pol-β se muestran en negro de carbono, azul para el nitrógeno y el rojo para el oxígeno. enlaces inter-atómicas de NSC-124854 se muestran en color magenta. enlaces inter-atómicas de Pol-β se muestran en oro. Los enlaces de hidrógeno se indican mediante líneas discontinuas entre los átomos involucrados, mientras que los contactos hidrofóbicos están representados por un arco con los rayos que irradian hacia los átomos de NSC-124854 se ponen en contacto. Los átomos de Pol-ß contacto se muestran con los rayos que irradian hacia atrás. La figura fue hecha con Hbplus y LIGPLOT.
Para determinar el efecto de los compuestos sobre el bloqueo de Pol-β-actividad, que reunió a
in vitro
ensayo en línea de desplazamiento con la síntesis purificada precorte APE1
marcada con 32P 63-mer F-ADN y Pol-β. Panel de
Un gratis (NSC-124854, NSC-143995, NSC-160172 y NSC-263659),
B Opiniones (NSC-10730, NSC-21371, NSC-43656 y NSC-91855) y
C gratis (NSC-274937, NSC-351093, NSC-668472 y NSC-674711) muestran el efecto de pequeñas moléculas sobre la síntesis de desplazamiento de cadena dirigida por Pol-β. En cada panel, carril 1 muestra 63-mer
marcada con 32P F-ADN, carril 2 muestra el producto 23-mer después APE1 incisión, carril 3 muestra 1-nt incorporación (24-mer) y productos de línea de desplazamiento. Los carriles 4-8, 9-13, 14-18 y 19-23 muestran la actividad desplazamiento de cadena de Pol-β se incubaron con 0, 5, 10, 25, 50 y 125 mM, respectivamente, de los compuestos indicados. Los datos son representativos de dos experimentos.
inhibidor de molécula pequeña, NSC-124854, bloquea específicamente la actividad Pol-β
determina además si NSC-124854 es un inhibidor específico de Pol actividad β o también podría bloquear la actividad de otras enzimas Ber. Primero se determinó la IC
50 de NSC-124854 para la síntesis de la cadena de desplazamiento dirigida por Pol-β. Este experimento fue el mismo que el descrito en el experimento de selección, excepto que elegimos concentraciones más bajas para determinar la IC
50 de NSC-124854. Su cuantificación los productos de síntesis de la cadena de desplazamiento (Fig. 3
A
, carriles 3-10, respectivamente) y representa como un porcentaje de cambio de bloqueo mediada por NSC-124854 de la actividad de Pol-β (Fig. 3
B Opiniones). El tratamiento con NSC-124854 mostró una disminución dependiente de la dosis en la actividad de síntesis de la cadena de desplazamiento con una CI
50 de 5,3 M (Fig. 3
B Opiniones). Estos resultados sugieren que NSC-124854 tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la síntesis de la cadena de desplazamiento dirigida Pol-β-.
Para determinar la afinidad de NSC-124854 para el bloqueo de la actividad de desplazamiento de cadena dirigida Pol-β- , a fin de determinar su CI
50 en un sistema de ensayo reconstituido como se describe en la Figura 2. Panel de
un
muestra el autorradiograma de la actividad de desplazamiento de cadena. El carril 1 muestra
marcada con 32P 63-mer F-ADN, carril 2 muestra el producto 23-mer después APE1 incisión, y el carril 3 muestra la actividad de desplazamiento de cadena de Pol-β. Los carriles 4-10 muestra el efecto de 0,5 a 20 M de NSC-124854 sobre la actividad de Pol-β. Panel de
B Opiniones muestra el IC
50 datos. NSC-124854 inhibe Pol-β-Directed actividad desplazamiento de cadena de una manera dependiente de la dosis con una CI
50 de 5,3 mM. Los datos son el representante de dos estimaciones independientes.
A continuación, se determina si el NSC-124854 puede inhibir la actividad de otras enzimas de la ruta BER como apurinic /apymidinic endonucleasa 1 (APE1), Fen1 y el ADN ligasa I. los resultados mostraron que los NSC-124854 no inihibit las actividades de estas enzimas (figura 4
Un CD -.
C
, respectivamente). A partir de estos resultados, se concluye que el efecto inhibidor de NSC-124854 fue altamente específico para Pol-β y no afectó a la actividad de otras enzimas Ber.
Panel
A
muestra el efecto de NSC-124854 sobre la actividad APE1. APE1 (10 nM) se incubó con diferentes concentraciones de NSC-124854 (0,5 a 20 mM, carriles 3-9, respectivamente) y
32P marcado con 63-mer F-ADN. Los carriles 1 y 2 muestran sin cortes
32 P-etiquetados 63-mer F-ADN y el producto de incisión 23-mer, respectivamente. Panel de
B Opiniones muestra el efecto de NSC-124854 sobre la actividad Fen1. Fen1 (10 nM) se incubó con diferentes concentraciones de NSC-124854 (0,5-20 M, carriles 3-9, respectivamente) y
marcada con 32P 51-mer-ADN batió. El carril 1 muestra la posición de 51-mer oligonucleótido marcado y el carril 2 muestra 11-mer producto solapa escindido. Panel
C
muestra el efecto de NSC-124854 sobre la actividad ligasa I de ADN. ADN ligasa I (5 nM) se incubó con diferentes concentraciones de NSC-124854 (0,5 a 20 mM, carriles 3-9, respectivamente) seguido de la adición de 2,5 nM de ADN mellado 63-mer
marcado con 32P. El carril 1 muestra 23-mer oligonucleótido marcado (producto mellado) y el carril 2 muestra 63-mero producto ligado. Los datos son representativos de dos experimentos independientes
Pequeña molécula inhibidora NSC-124854 bloques de un solo nucleótido (SN) -. Y largo parche (LP) actividades -BER reconstituido en un
in vitro
ensayo
con base en el análisis de acoplamiento molecular, NSC-124854 se predice para formar polares (enlaces de H) interacciones con los residuos de aminoácidos Lys81 y Arg89 y una interacción no polar (van der Waals) con la residuo de aminoácido Asp17 en la superficie de Pol-β [48], [49]. Estos residuos se encuentran en las proximidades de la unión de PCA de bolsillo (residuos de aminoácidos Thr79, Lys81 y Arg83) (Fig. 1
B Opiniones). Estos contactos previstos sugieren unos varios contactos directos entre NSC-124854 y Pol-β, que posiblemente pueden imitar la interacción de APC con Pol-β. Dado que estos datos sugieren que el NSC-124854 en combinación con TMZ como una posible estrategia de tratamiento quimioterapéutico para el cáncer colorrectal, se llevó a cabo un estudio para determinar la eficacia y las limitaciones de esta estrategia.
A pesar de que se determinó la especificidad de NSC- 124.854 para la actividad de Pol-β, como se muestra en la Fig. 3 y 4, fue necesario examinar el efecto de este compuesto cuando se monta el sistema BER completa de SN-y LP-BER. Estos experimentos proporcionarán evidencia bioquímica de la potencia de NSC-124854. Se utilizó el 63-mer
marcada con 32P T-ADN como sustrato (Fig. 5
Un
) para SN-BER. Dado que se requiere Fen1 para la actividad LP-BER y puede estimular la actividad de Pol-β para la síntesis de desplazamiento de cadena [50], [51], adoptamos misma estrategia para determinar el efecto de NSC-124854 en LP-BER (Fig. 5
B Opiniones). Después de APE1 incisión, se generó un producto 23-mero esperado (Figura 5
C
;. Comparar los carriles 1 con 2). Los resultados mostraron incorporación eficiente 1-nt (producto 24-mer) por Pol-β que se ligó con DNA ligasa I para generar 63-mero producto reparado (Fig. 5
C
, carril 5). La adición de Fen1 estimuló la actividad Pol-β para la síntesis de desplazamiento de cadena (Fig. 5
C
, carril 4), que también se ligó con la ligasa I de ADN para generar 63-mer producto reparado (Fig. 5
C
, carril 6). La adición de NSC-124854 bloqueado 1-nt (producto 24-mer en ausencia de Fen1) Además-β-dirigida Pol (Fig. 5
C
, comparar carril 3 con 7), así como Strand- la síntesis de desplazamiento en presencia de Fen1 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5
C
, comparar el carril 4 con los carriles 8-11, respectivamente). Además, la reparación completa por Sn y LP-BER sub-vías después de la adición de ADN ligasa también estaba bloqueado por NSC-124854 en una forma dependiente de la dosis (Fig. 5
C
, comparar los carriles 12 -15 y 16-19, respectivamente).
Paneles
A y B Opiniones representan los protocolos de la SN-y LP-BER, respectivamente. Panel
C
muestra el autorradiograma que describe el efecto de diferentes concentraciones de NSC-124854 sobre las actividades Sn- y LP-Ber. El carril 1 muestra 63-mer
marcada con 32P T-ADN, carril 2 muestra el producto 23-mer después APE1 incisión, carril 3 muestra 1-nt incorporación por Pol-β, carril 4 muestra los productos de línea de desplazamiento después de la adición de Fen1. Carriles 5 y 6 muestran el producto 63-mer ligado de actividades Sn- y LP-BER, respectivamente. Carril 8-19 muestra el efecto de NSC-124854 en el bloqueo de 1-nt (producto 24-mer) la incorporación. Los carriles 8-11 representan bloque mediada por NSC-124854 de la síntesis de desplazamiento de cadena. Además, carriles 12 a 15 y los carriles 16 a 19 muestran el efecto de NSC-124854 en el bloqueo de las actividades de LP-BER SN- y de una manera dependiente de la dosis. Datos es una representativos de tres experimentos diferentes.
La expresión de tipo salvaje APC causa resistencia al tratamiento con TMZ que está abolida por el tratamiento con NSC-124854
En estudios anteriores, se han demostrado que la APC interactúa con actividades LP-BER [14] Pol-β y Fen1 y bloques SN-y, [45], [46], [52] - [54]. También hemos demostrado que células HCT-116 (expresar de tipo salvaje APC) son más sensibles a méthylméthane sulfonato (MMS) y tratamientos TMZ que HCT-116-APC (KD) células (derribado APC con pSiRNA) [36], [45], [46]. En el presente estudio, se determinó la sensibilidad de TMZ en presencia de NSC-124854 a varias líneas celulares de cáncer de colon (HCT-116, HCT-116-APC (KD), HCT-116 + CH3, Caco-2, HT29, SW480, LoVo y RKO) usando un ensayo clonogénico [18], [36], [46]. El IC
50 resultados mostraron que todas las líneas celulares ensayadas mostraron una mayor sensibilidad a la combinación de tratamiento de NSC-124854 con TMZ (Tabla 1). El IC
50 datos mostraron que NSC-124854 fue capaz de mejorar el efecto inhibidor del crecimiento de TMZ a ambas líneas celulares HCT-116 y HCT-116-APC (KD); sin embargo, el efecto fue mayor en HCT-116 que en HCT-116-APC (KD) de las células (Tabla 1). Estos resultados confirman nuestros hallazgos anteriores de que APC de tipo salvaje mediante la inhibición de la vía BER aumenta la sensibilidad de los fármacos de ADN-alkylaying [36], [46], [54]. Sin embargo, otras líneas celulares que expresan ya sea de tipo salvaje o truncado APC, tales como RKO (310 kDa), SW480 (147 kDa), Caco-2 (150 kDa), LoVo (120 kDa) y HT29 (110 y 200 kDa) no mostraron una correlación directa de la función de APC en la sensibilidad de estos fármacos. Estos resultados sugieren que los factores genéticos distintos de mutaciones en el
APC
gen también podría desempeñar un papel en la determinación de la sensibilidad de NSC-124854 y TMZ a diferentes células de cáncer de colon. Uno de los parámetros críticos para esta sensibilidad diferencial es controlado por el estado diferenciado de la actividad triple vírica, que se discute a continuación.
El tratamiento de combinación de NSC-124854 mejora el efecto inhibidor del crecimiento de TMZ sobre MMR-deficiente y MMR células de cáncer de colon con dominio
MMR proteínas están involucradas en la respuesta a la quimioterapia de las células de cáncer de colon, y defectos en la proteína (s) MMR está presente en el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) [55]. Dos de las proteínas MMR están mutados con más frecuencia en los cánceres humanos, MLH1 y MSH2. MMR células deficientes son con frecuencia resistentes a los agentes alquilantes de ADN [55]. Para determinar el papel de la MMR en el efecto de combinación de NSC-124854 con TMZ en la inhibición del crecimiento, se utilizaron varias líneas celulares de cáncer de colon MMR-competente y MMR-deficientes. HCT-116, HCT-116-APC (KD), y RKO líneas de células son deficientes en MMR debido a la falta de expresión de hMLH1, una enzima clave de esta vía [56], mientras que las células LoVo son MMR-deficiente debido a la ausencia de MSH2 expresión [57]. El HCT-116 + CH3 célula se ha hecho MMR-competente mediante la introducción de una sola copia del cromosoma 3 que alberga el
hMLH1
de genes [58]. TMZ se sabe que causa la resistencia a las células deficientes de MMR-[26]. En estudios previos, se ha sugerido que la interrupción de la vía BER puede abolir la resistencia a fármacos causado por la deficiencia de MMR-[59]. En el presente estudio, se determinó si el tratamiento de TMZ sensibiliza a las células MMR-dominio comparativamente más que las células deficientes de MMR, y si el bloqueo de la vía de REC por NSC-124854 puede abolir la resistencia a TMZ células deficientes de MMR. Como era de esperar, las líneas celulares MMR-dominio SW480 (IC
50 108,1 ± 3,2 M), HCT-116 + CH3 (IC
50 130,7 ± 4,3 M) y Caco-2 (IC
50 449,2 ± 42,4 M), excepto HT29 (IC
50 962,7 ± 62,7 M) mostró una mayor sensibilidad a TMZ en comparación con MMR deficiente en líneas de células HCT-116 (IC
50 739,0 ± 25,9 M), HCT-116- APC (KD), (IC
50 877,7 ± 49,2 M), LoVo (IC
50 838,8 ± 53,1 M) y RKO (IC
50 1572,6 ± 89,9 M) (Tabla 1). Además, el tratamiento de combinación de NSC-124854 reduce aún más el IC
50 de TMZ por dos veces en todas las siete líneas celulares independientemente de su estado de actividad MMR (Tabla 1). Estos resultados sugieren que el tratamiento de combinación de NSC-124854 con TMZ podría ser una estrategia quimioterapéuticos útiles para la gestión de ambos tumores colorrectales MMR-deficientes y MMR-dominio.
Combinación de NSC-124854 con TMZ se puede utilizar como un posible enfoque quimioterapéutico para aumentar el crecimiento del tumor de colon
in vivo
a fin de verificar el
in vitro
resultados de la eficacia del tratamiento combinado de NSC-124854 y TMZ con un objetivo bien caracterizado y específica de Pol-β para reducir las dosis de TMZ que pueden eliminar los efectos secundarios y al mismo tiempo abolir la MMR-resistencia, se realizó un
in vivo
estudio de xenoinjerto en el uso de inmunodeficiencia combinada severa ( SCID, que carecen de células T y B funcionales) del ratón, tal como se describe en la Figura 6
Un
. Nuestra elección para los ratones hembra se basa en el estudio reciente que describe que la estimación de nuevos casos de cáncer de colon en 2009 se prevé que sea mayor en mujeres que en hombres [60]. Elegimos una dosis de 20 mg /kg de peso corporal de TMZ para estos experimentos, que es de 10 y 4 veces menor que la dosis máxima tolerada en ratones y humanos, respectivamente [61] - [65]. Además, la dosis de 10 mg /kg de peso corporal para NSC-124854 es más de 20 veces inferior a su IC
50 en cultivo (Tabla 1). Aunque no hemos determinado la dosis máxima tolerada (DMT) de NSC-124854 en ratones, la concentración elegida es en gran medida en el rango más seguro.
Panel de
Un
muestra la representación esquemática de la protocolo experimental. Panel de
B Opiniones muestra el cambio en el volumen del tumor en el 42
º día del experimento. Los datos presentados son la media ± desviación estándar de cuatro a seis animales en cada grupo. *, Significativamente diferente de control;
†, significativamente diferente de NSC-124854. P & lt;.
0,05
Estos fármacos se administraron por vía intraperitoneal (.
i.p.
) durante cinco días consecutivos. La inhibición del crecimiento de los tumores se controló hasta 42 días. Los resultados mostraron un aumento en el volumen del tumor en el grupo de control de una manera dependiente del tiempo para todas las líneas celulares,
es decir
, HCT-116, HCT-116-APC (KD) y HCT-116 + CH3. El volumen del tumor alcanzó un máximo de 1.120 mm
3 dentro de los 42 días de la implantación de xenoinjertos, que se muestra en la Figura 6
B Opiniones. El crecimiento del tumor en los no tratados HCT-116 xenoinjerto fue mayor que HCT-116-APC (KD) y 116-HCT + CH3 células. El efecto antitumoral de TMZ sola fue significativamente diferente en 116 HCT + células CH3 (MMR-competente) y fue menos pronunciado en HCT-116 y HCT-116-APC células (KD) (Fig. 6
B
). El tratamiento con NSC-124854 solo también redujo el crecimiento de tumores con todas las líneas celulares, lo que fue más pronunciada cuando se combina con TMZ (Fig. 6
B
). Estos resultados sugieren que el tratamiento combinado de NSC-124854 mejora la eficacia terapéutica de TMZ igual de bien tanto en el modelo de xenoinjerto de tumor MMR deficiente y MMR-competente
in vivo
. Para determinar la tolerancia de los fármacos, se registró el peso corporal de los animales dos veces a la semana hasta el final del experimento. Los resultados mostraron una ganancia similar en el peso corporal de control y el grupo tratado de los animales con NSC-124854 y TMZ sola o en combinación (datos no mostrados). Por lo tanto, parece que las dosis de 10 mg /kg de peso corporal para el NSC-124854 y 20 mg /kg de peso corporal para TMZ fueron bien tolerados y no causaron ningún efecto secundario adverso evidentes en nuestros animales de experimentación.
discusión
En estudios previos, Pol-β se ha utilizado como diana para el desarrollo de fármacos de quimioterapia [23], [34], pero no ir más allá del nivel pre-clínico. La eficacia de los compuestos anteriores ha sido menos eficaz, ya que requieren concentraciones muy altas para conseguir la citotoxicidad deseada
in vitro
y no se prueban sistemáticamente los
in vivo
. Además, se orientaron principalmente para bloquear SN-BER. El uso de TMZ para el tratamiento de enfermedades malignas distintas de glioblastoma y melanoma se ha limitado, especialmente para el tratamiento de tumores colorrectales, debido al efecto menos pronunciado en la supresión del crecimiento del tumor [39], [40]. En el presente estudio, hemos utilizado enfoque molecular basado en la estructura para identificar moléculas pequeñas que pueden imitar la interacción de APC con Pol-β y BER dirigida-Pol-β bloque que puede ser utilizado como un objetivo quimioterapéutico. Nuestra estrategia de acoplamiento molecular en el bolsillo de APC-unión de Pol-β fue identificar una pequeña molécula que puede bloquear tanto las actividades Sn y LP-BER y demostrar la citotoxicidad tanto en
in vitro
y
In los ensayos in vivo
a concentraciones más bajas
Cabe destacar que, si tiene éxito, la estrategia propuesta será muy eficaz en la prevención de los cánceres colorrectales ambos MMR-dominio y MMR-deficientes.; esto es de importancia porque los cánceres colorrectales MMR-deficientes suponen un mayor riesgo de resistencia a los fármacos de ADN-alquilación debido a la sobre-expresión de MGMT o MMR-deficiencia de [27] - [29]. Las células deficientes en MGMT son incapaces de procesar la O
6meg durante la síntesis de ADN, y si sin reparar, un G: C a G: T transición se produce la mutación [27]. El G: T desajuste es luego reparado por vía MMR [28]. Sin embargo, si el O
6meg no se repara antes de la etapa de re-síntesis en MMR, la timina es probable que sea reinsertado opuesto a la lesión. Se cree que el ciclo repetitivo de los resultados de MMR inútiles en una generación de lesiones terciarias, lo más probable gapped DNA.