Extracto
El punto de acceso AKT1
E17K mutación en el dominio de homología pleckstrin AKT1 se produce en aproximadamente el 0,6-2% de los cánceres de pulmón humano. Recientemente, hemos demostrado que AKT1
E17K transforma células bronquiales humanas inmortalizadas. Aquí por el uso de una cepa murina Cre-inducible transgénicos en el tipo silvestre Rosa26 (R26) locus (
R26-AKT1
E17K
ratones) se demuestra que AKT1
E17K es un
de buena fe
oncogén y desempeña un papel en el desarrollo del cáncer de pulmón
in vivo
. De hecho, nos informan de que mutante AKT1
E17K induce bronquial y /o lesiones hiperplásicas bronquiolar en el epitelio pulmonar murino, que el progreso a carcinoma franco a muy baja frecuencia, y acelera la formación de tumores inducidos por carcinógenos químicos. En conclusión, AKT1
E17K induce hiperplasia del epitelio pulmonar ratón
in vivo
y coopera con uretano para inducir el fenotipo maligno totalmente
Visto:. Malanga D, S Belmonte, Colelli F, SCARFO M, De Marco C, Oliveira DM, et al. (2016) AKT1
E17K Es oncogénica en pulmón de ratón y coopera con carcinógenos químicos en la inducción de cáncer de pulmón. PLoS ONE 11 (2): e0147334. doi: 10.1371 /journal.pone.0147334
Editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ESPAÑA
Recibido: 30 Marzo, 2015; Aceptado: 1 Enero de 2016; Publicado: 9 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Malanga y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:.. Este trabajo fue apoyado por Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC 2012-14, IG_12969) y Ricerca (MIUR PRIN, prot Ministero Istruzione Università e 2010W4J4RM_001 ; PONa3_00239; PON01_02782) a la VG. HF fue apoyada por Västra Götalandsregionen bajo el acuerdo de LUA /ALF y por las fundaciones Assar Gabrielssons y Magnus Bergvalls
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer, se asocia con una tasa de supervivencia de 5 años en todo el mundo de menos del 15% [1,2]. activación mutacional del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la vía es el evento patogénico principal en el adenocarcinoma tabaco inducida no (ADC), mientras que la vía impulsado por v-Ki-ras2 /Kirsten sarcoma de rata oncogén viral homólogo (KRAS) está implicado en carcinogénesis de pulmón tabaco mediada [3-6]. Desafortunadamente, la activación de mutaciones en EGFR no están típicamente presentes en el carcinoma de células escamosas de pulmón (SCC), el segundo tipo más común de NSCLC [7], y la terapia dirigida por lo tanto no es efectivo. Estudios recientes muestran tasa de 2-4% de la p110 subunidad α-catalítica de PI3K (PIK3CA mutaciones) [8-10] y la tasa de 1% de las mutaciones AKT1 [11,12] en CEC han sugerido que la orientación de estos genes puede resultar un éxito terapéutico opción [7,13-15].
las quinasas AKT (AKT1, AKT2, Akt3) aguas abajo representan el principal punto final de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), que regula la proliferación, supervivencia, metabolismo y invasión. AKT1 y AKT2 se activan frecuentemente en el cáncer humano [16-18] después de la pérdida de la fosfatasa lipídica PTEN, la activación de mutaciones y /o copiar la variación del número de receptores de tirosina quinasa de EGFR o HER2, la activación de mutaciones en KRAS, en PIK3CA [19,20]
, [21] o en sí mismo AKT1 [22]. En el cáncer de pulmón una mutación somática en el dominio de homología pleckstrin (PH) de AKT1 que resulta en la sustitución de ácido glutámico a lisina en el residuo 17 (E17K) se informó con frecuencia global de 0,6 a 2% [7,11,12,23-25 ].
AKT1
E17K muestra una mayor afinidad por PI (4,5) P2, el reclutamiento membrana plasmática mejorada y la activación constitutiva [22,26]. AKT1 endógeno
E17K proteína mutante detectado en las células de cáncer de pulmón muestra unos mayores localización de la membrana [11], lo que resulta en la activación de la señalización aguas abajo [11,22].
El papel de AKT1 mutante
E17K en la tumorigénesis epitelial sigue sin estar claro ya que los estudios en modelos celulares en células de mama y pulmón han producido resultados discordantes [27-30]. Además, ninguna cepa murina que los modelos de la AKT1
mutación E17K se ha generado hasta el momento.
Estas consideraciones nos llevaron a abordar el papel de AKT1
E17K en la transformación de las células epiteliales del pulmón
in vivo
. En esto, se demuestra que AKT1
E17K promueve la hiperplasia en el pulmón de ratón y coopera con otras lesiones genéticas para inducir el tumor maligno completo.
Materiales y Métodos
Diseño vectorial y Generación de ratones transgénicos
Para generar
R26-AKT1
E17K
ratones transgénicos humana AKT1 cDNA fue amplificado por PCR a partir de células mononucleares de sangre humana mediante PCR utilizando cebadores 5'-ATGAGCGACGTGGCTATT- 3 'y 5'-TCAGGCCGTGCCGCTGGC-3'. El producto de PCR se clonó en un plásmido lanzadera (pBlueScript) usando técnicas de clonación estándar. AKT1 mutante
E17K cDNA se generó por Quick Change Site-mutagénesis directa (Stratagene) y sub-clonado en el vector pROSA26 [31-33] para obtener el E17K constructo PR26-AKT1
, que consistía en 5 ' y 3 'brazos de homología del locus ROSA26, flanqueado-FRT FRT /resistencia a la neomicina (Neo) y la secuencia de casete loxP /loxP-flanqueado triple de poliadenilación (TPA). Véase la figura 1 para más detalles.
A. Representación esquemática de la construcción de la orientación utilizada para el knock-in condicional en el
R26
locus. El humano
AKT1
E17K
ADNc precedido por un casete de parada transcripcional loxP-flanqueado, se recombina en el locus R26. la eliminación mediada por Cre del casete de parada une Rosa26 exón 1 al ADNc exógeno que permite la expresión del transgén. B. transferencia Southern de ADN digerido con EcoRV genómico derivado de mESCs transfectadas con el constructo de llevar a AKT1 mutante. Carril 1: ADN de mESCs no dirigidas, carril 2 y 3: ADN de ADN a partir de dos diferentes
R26-AKT1
E17K
mESCs cepas. alelo endógeno corresponde a la banda de 11,5 kb (
WT
); alelo mutante corresponde a la banda de 4,3 kb (
REC
). C. Expresión relativa del mRNA de AKT1 humano
E17K por Q-RT-PCR en mESCs objetivo y en las celdas correspondientes transfectadas con el Flp (pFlpE-IRES-Puro) o recombinasa Cre (pcre-IRES-Puro). Los datos proceden de experimentos repetidos como la media ± SD. *** P & lt; 0,001. D. Análisis de genotipo mediante PCR sobre el ADN punta de la cola de los ratones genéticamente modificados como se indica.
30μg del R26-AKT1
plásmido E17K fue linealizado con la enzima de restricción SfiI (New England Biolabs,) y la electroporación en células madre embrionarias de ratón (mESC). clones mESC resistentes a G418 se aislaron y se seleccionaron para la correcta orientación de la locus por PCR (cebadores F1 y R1, respectivamente: 5'-AGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTT-3 ', 5'-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3) amplificar un fragmento de 3,9 kb. PCR clones positivos resistentes a G418 se seleccionaron posteriormente por transferencia Southern de sondeo para la unión de recombinación 5 '. Una vez identificados, dirigidos clones mESC fueron transfectadas con Flp-expresión de plásmido (pFlpE-IRES-Puro) para la escisión del casete Neo. clones mESC Posteriormente, eliminados-Neo se aislaron, se proyectó por PCR (cebadores F2 y R2, respectivamente: 5'-CGGCCTCGACTCTACGATACCGTCGATCC-3 ', 5'-R2 GGATCGAGATCTGATAACTTCGTA-3') y se inyecta en blastocistos B6, que fueron transferidos a continuación en seudo -pregnant hembras para producir animales quiméricos en el Centro de células Madre embrionarias de IRGs (Ariano Irpino, Avellino, Italia). Las quimeras generadas fueron criados para establecer la transmisión de la línea germinal del alelo humano. Genotipos de
R26-AKT1
E17K
ratones fueron determinados por PCR utilizando ADN genómico aislado de las puntas de la cola con los siguientes cebadores: 5'ARMF, 5'-AACTGCAGACTTGTGGGATAC-3 ' ; 3'ARMR, 5'-ATATTAGTCCACCTCACTCCT-3 '; mE17KR5 5'-GCCAACCCTCCTTCACAATA-3 '. El
R26-AKT1
E17K
línea fue acoplado con
TTF1-Cre
línea (un regalo del Dr. Mario De Felice, IRGs, Ariano Irpino, Italia ), para generar
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre;
ratones. El
TTF1
-Cre ratones fueron genotipo utilizando los siguientes cebadores: FP, 5'-CCTGATGGACATGTTCAGGGACA-3 ': RP, 5'-GCCAGATCTCCTGTGCAGCATGT-3'.
R26-AKT1
E17K
ratones se cruzaba nuevamente en el fondo B6. En todos los experimentos de camada se utilizaron como controles.
La experimentación animal que fue aprobado por el comité de ética local "Comitato per la Etico Sperimentazione Animale" (CESA) del GIEC y conforme a las reglas y directrices de Italia y la Unión Europea. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales (S1 LLEGA Lista de verificación). Los animales fueron alojados en un entorno microbiológico altamente controlado para garantizar condiciones SPF. Ellos se mantuvieron en jaulas de VCI, bajo condiciones constantes de temperatura (22 ± 2 ° C), humedad (55% ± 10 UR) y el ciclo luz /oscuridad de 12/12 horas. Los animales tuvieron libre acceso a la dieta estándar y agua irradiada. Los ratones fueron genotipados por PCR de la cola de ADN [34]. La deleción de secuencias de parada de la transcripción loxP-flanqueado se determinó por PCR usando los siguientes cebadores:.
TRF, 5'-GGATCGACGGTATCGTAGAGTCGAGGCCG-3 ';
L2R 5'-GCCAATGAAGGTGCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3'
la expresión de AKT1
E17K en mESCs transfectadas con pcre-IRES-Puro se determinó por RT-PCR cuantitativa.
Southern blot
Un protocolo estándar para la transferencia de Southern era usado. El ADN genómico (30 g) se digirió con EcoRV. Una sonda de 500 pb en el lado 5 'del sitio de inserción dirigida (de CTTGAAAGTGGAGTAACTAC a TCAGAAGCTTTGAACTAGAA en el locus ROSA26) se marcó con DIG-dUTP, usando PCR DIG sonda Síntesis Kit (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suiza). Esta sonda identifica un fragmento de 11,5 kb en el locus salvaje tipo ROSA26 y un fragmento 4.3kb en el locus ROSA26 objetivo.
Western Blot y anticuerpos
extractos de proteínas de tejidos enteras se han preparado con tampón NP-40 ( Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% NP-40) que contienen inhibidores de la proteasa (SigmaFast, Sigma-Aldrich). El análisis de transferencia Western se llevó a cabo por métodos estándar [11]. Anti-fosfo-AKT (Ser473) (# 4058), anti-AKT1 (# 2938), anti-fosfo-FoxO1 (Ser256) (# 9461), anti-FoxO1 (# 2880), anti-fosfo-GSK3-α /β (Ser21 /9) (# 9331), anti-GSK3-α (# 9338), anti-GSK3-β (# 9332) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danver, MA).
inversa cuantitativa transcripción PCR en tiempo real (Q-RT-PCR)
ARN total se preparó como se describe [35]. RT-PCR se realizó en ARN extraído por Trizol (Invitrogen) y retro-transcrito con superíndice II (Invitrogen). Q-RT-PCR se realizó con la PCR Master Mix verde SYBR de energía en ABI Prism 7900 termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión génica se normalizó al contenido de ARNm de GAPDH. Las cantidades relativas de ARNm o ADN se calcularon por el método de ciclo umbral comparativo (CT) [36]. Los siguientes cebadores se utilizan en Q-RT-PCR
AKT1R26 adelante 5'-CACACCACCTGACCAAGATG-3. ';
AKT1R26 revertir 5'-AATCAAGGGTCCCCAAACTC-3'
Virus la infección de ratones
control
R26 un
nd
R26-AKT1
E17K
ratones fueron infectados con 10
6 o 10
7 pfu de adenovirus que expresa Cre (Ad-Cre) (Biolabs vector, Filadelfia, PA). Los ratones de 6 a 12 semanas de edad se anestesiaron con isoflurano y Ad-Cre se administró por vía intranasal. Los ratones recibieron 120 l de Ad-Cre, en dos dosis de 60 l cada uno, con un descanso entre las dos dosis, para permitir que los ratones para recuperar una respiración normal. Los ratones de control recibieron la misma cantidad de solución salina tampón fosfato (S1 LLEGA Lista de verificación).
Experimental Carcinogénesis
R26 o R26-AKT1
E17K
compañeros de camada fueron o bien infectadas con Ad-Cre (10
6-10
7 PFU) o tratadas con disolvente solo antes de recibir la inyección intra-peritoneal con una dosis única de 1 mg /g de peso corporal de uretano, una éster etílico de ácido carbámico utiliza ampliamente en modelos murinos de la carcinogénesis [37], disueltos en solución salina estéril al 0,9%. Los ratones se controlaron semanalmente y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. No ratón tenía que ser sacrificados antes del punto final experimental específico (6, 9 y 18 meses, respectivamente) por razones de salud. Los ratones fueron sacrificados después de 6, 9 y 18 meses por dislocación cervical (S1 LLEGA Lista de verificación). Los pulmones se retiraron y se inflaron con 10% de formalina tamponada neutral. Los tejidos pulmonares se recogieron y se fijaron con 10% de formalina, y embebidos en parafina utilizando procedimientos estándar. Se realizaron cortes de pulmón para abarcar 1,5 mm de parénquima pulmonar; secciones frontales se recogieron en 15 niveles con 100 micras espaciado) de la distancia sagital para cubrir adecuadamente las dos regiones periféricas y centrales. Las secciones fueron montadas en portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina eosina anuncio y se evaluaron mediante microscopía de luz por los patólogos veterinarios y patólogo humano (OP, HF y CM). Para cada tumor se identificó la diapositiva con diámetro máximo de la lesión y se registra bajo el microscopio.
El análisis histológico e inmunohistoquímica
se recogieron
tejidos pulmonares y se fijaron con 10% de formalina, y embebidos en parafina utilizando el estándar procedimientos. Secciones (5μm) se montaron en portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina y eosina para ser evaluado por microscopía de luz por los patólogos (CM) humanos veterinaria (OP y HF) o. Una puntuación combinada de las lesiones hiperplásicas se calculó mediante la adición de una puntuación que mide el número de capas epiteliales (puntuación Layer) para un porcentaje de medición puntuación de hiperplasia presente en toda la sección (puntuación global hiperplasia). La puntuación de capa se define de la siguiente manera: la puntuación de 1, 1-2 presencia de capa (s), la puntuación de 2, 2-3 presencia de capas, la puntuación de 3, presencia de & gt; 4 capas. La puntuación global de la hiperplasia se define de la siguiente manera: la puntuación de 1, cuando la hiperplasia estaba presente en 1-20% de los tramos analizados en total (3 secciones en serie /ratón); Resultado 2, cuando era aficionado a la hiperplasia de 21-60% del total de las secciones analizadas (3 secciones en serie /ratón); puntuación 3, cuando se encontró en la hiperplasia 61-100% del total de las secciones analizadas (3 secciones en serie /ratón).
La inmunotinción con anti-fosfo-AKT se realizó con protocolos estándar utilizando el kit Vectastain rápida universal y DAB sustrato de peroxidasa Kit (Vector Laboratories, Burlingame) según las instrucciones del fabricante. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con el tratamiento con microondas en Antigen solución desenmascaramiento (VectorLaboratory, Burlingame, CA) durante 10 min. Conejo anti-fosfo-AKT (Ser473) (1: 1000,#4058) fue adquirido de Señalización Celular Tecnología
La inmunotinción para Ki67 se realizó con protocolos estándar utilizando Bond ™ Polímero Refinar detección (Leica Biosystems, Buffalo Grove. , IL) según las instrucciones del fabricante. Rabbit anti-Ki67 (1: 100, PA5-19462) se adquirió de Fisher Scientific (Thermo Fisher Sientific, Pittsburgh, PA). La inmunotinción para p21 se realizó con los protocolos estándar utilizando EnVision ™ Sistemas de Detección de Dako, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. policlonal de conejo Ab-5; anti-p21 /WAF1 antisuero (01:50) se adquirió de Oncogene Research Products (Cambridge, MA). Ki67 y p21 positividad se determinó contando núcleos positivos en 10 campos con una ampliación de X 400
captura de microdisección por láser (LCM)
microdisección se realizó utilizando el láser Leica Microdissector LMD6 & amp.; LMD7 (Leica Microsystems, Milán). secciones de tejido tumoral 5-micras en portaobjetos de vidrio se insertaron en el Microdissector láser para la disección de los tumores de pulmón. Las áreas seleccionadas fueron capturadas con pulsos de láser infrarrojo en CaPSURE Caps LCM Macro.
Directo
Kras
secuenciación
microdissected muestras fueron lisadas por Kit SB LysePrep (Silicon Biosystems, Bolonia) de acuerdo las instrucciones del fabricante. Las alícuotas de solución de lisis (2,5 l) se utilizaron como molde para la amplificación de ADN con los cebadores siguientes: mKrasF-TCCTAC AGGAAACAAGTA y mKras R-TTATTTATGGCAAATACA. El programa de amplificación utilizado fue: 95 ° C /5 min; 35x (95 ° C /30 s, 52 ° C /30 s 72 ° C /30 s) para la desnaturalización, hibridación y extensión; 72 ° C /7 min para terminar la extensión, seguido de enfriamiento a 15 ° C. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 2% y se purificaron mediante el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen). Los productos de PCR purificados se analizaron en 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Para todos los análisis, los datos fueron alineados a la secuencia consenso obtenida de la base de datos GenBank BLAST.
inmunofluorescencia tinción
Deparaffinized secciones se hidrataron en la disminución de las soluciones de gradiente de etanol y se aclararon en solución de lavado (TBST, 0,05 mol /L Tris Buffered Saline con Tween20). La recuperación del antígeno se llevó a cabo con tampón citrato pH 6 durante 30 minutos a 98 ° C seguido de lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4). Las secciones fueron incubadas con anticuerpos contra la SP-C (anticuerpo policlonal de cabra anti-SP-C, 1: 200 DILUCIÓN, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EE.UU.) o de anticuerpos CC-10 (de cabra policlonal anti-CC-10, 1 : 200 dILUCIÓN, Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante 60 minutos, seguido de incubación con anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488-conjugado anti-IgG de cabra (dilución 1: 400; Santa Cruz Biotechnology) durante 60 minutos. Las células fueron counterstained con DAPI (2 mg /ml; Santa Cruz Biotechnology), montados utilizando medio de montaje (Sistema DakoEnvision, Inc, CA, EE.UU.) y anti-fade observada en microscopía de fluorescencia (Leica Microsystems)
. el análisis estadístico
los datos presentados son las medias ± SD de
n
independientes ensayos o repeticiones como se indica en el texto. Las variables continuas se analizaron mediante la prueba t de Student o la prueba de ANOVA, mientras que las variables categóricas se analizaron mediante χ
2 o la prueba exacta de Fisher. La significación se calcula Log-rank (Mantel-Cox) prueba (GraphPad Prizm 5 Software, San Diego, CA).
Resultados
Mutant AKT1
E17K promueve la hiperplasia de los bronquios y los bronquiolos
Hemos generado una cepa de ratón transgénico (
R26-AKT1
E17K
) que expresa de forma condicional AKT1 mutante humana en el pulmón mediante el uso de un sistema de knock-in (Cre condicional
Rosa26
,
R26
) que alberga secuencias de parada transcripcional loxP-flanqueado aguas arriba de AKT1 mutante ADNc (figura 1A). CES murinos fueron blanco y se cribaron por transferencia de Southern para identificar los clones que llevaban el alelo recombinante (Fig 1B) y para la expresión inducida por Cre del transgén (Fig 1C). Cre que responde a
R26-AKT1
E17K
mESCs se utilizaron para generar ratones quiméricos. la transmisión de la línea germinal del alelo fue confirmada por PCR (Figura 1D) en noqueado-
Para expresar AKT1 mutante en el epitelio pulmonar se utilizaron dos sistemas diferentes:. instilación intranasal de un adenovirus que lleva la recombinasa Cre (Ad-Cre) o el apareamiento de
R26-AKT1
E17K
ratones con
TTF1-Cre
ratones [38,39]. El uso de
TTF1-Cre
ratones permiten la expresión del transgén en el epitelio bronquial [39]
, [40] mientras que la instilación de Ad-Cre presenta las ventajas de permitir la activación somática del transgén en y áreas parcheadas de no seleccionar de antemano el tipo de célula en la que se expresa el transgén.
en la primera serie de experimentos, cruzamos el
R26-AKT1
E17K
ratones con
TTF1-Cre
. La figura 2A muestra la deleción de la casete loxP en los tejidos pulmonares de los
R26-AKT
E17K
; TTF1-Cre
ratones; La figura 2B muestra en tiempo real RT-PCR la expresión de AKT1 mutante en el pulmón y la figura 2C muestra los niveles de Akt fosforilada y /o sustratos AKT (GSK3α /ß, FoxO1) aumentó en los pulmones de los
R26-AKT
E17K
; TTF1-Cre
ratones en comparación con
R26-TTF1-Cre
hermanos de camada. Se midió la expresión de AKT1 por RT-PCR en cinco tejidos adicionales (cola, músculo, riñón, bazo, corazón e hígado) derivados de R26-AKTE17K; TTF1-Cre y R26-TTF1-Cre camada ratones y los resultados se muestran en la Fig S1. Como se muestra, no se observa expresión en diferentes tejidos de los pulmones.
A. El análisis por PCR de ADN de pulmón de
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre
y control de camada. ΔStop TPA: LOX-P transcripción flanqueado señal de parada de terminación. B. expresión de mRNA relativa de AKT1 humana por Q-RT-PCR de ARN de los pulmones de
R26; TTF1-Cre
,
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre
. Los datos se presentan a partir de análisis repetidos como la media ± desviación estándar. C. Representante análisis de inmunotransferencia de pAKT, AKT1 total y proteínas de señalización corriente abajo en extractos de proteínas totales de todo el pulmón de
R26; TTF1-Cre
y
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre
ratones, respectivamente. DELAWARE. Representante H & amp; E tinción de los pulmones de los
R26; TTF1-Cre
y
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre
, respectivamente. Magnificación como se indica. F-G. tinción pAKT representante de los pulmones de
R26;. Nkx2
1-Cre
y
R26-AKT1
E17K
; Nkx2
.
1-Cre
, respectivamente. Magnificación como se indica.
Ratones de 2 (n = 10), 6 (n = 8) y 12 (n = 11) meses de edad se sacrificaron como puntos finales.
TTF1-Cre
ratones no mostraron evidencia de enfermedad de hasta 12 meses de edad (n = 7). Por el contrario, el análisis histopatológico reveló la presencia de lesiones hiperplásicas en el pulmón de los 12 meses de edad
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre
ratones (figura 2D y 2E). Estos ratones mostraron hiperplasia moderada de la bronquial y /o epitelio bronquial terminal con núcleos polarizados. epitelio alveolar era normal, aunque se observó atelectasia en algunos ratones. La inmunotinción con anti-pS473 demostradas niveles de activación de Akt aumentó en los pulmones hiperplásicas de
R26-AKT1
E17K
; TTF1-Cre
ratones en comparación con el control o
TTF1-Cre
ratones (figura 2F y 2G).
también activado el AKT1 mutante
E17K transgén mediante la administración intranasal de Ad-Cre (10
6, 10
7 uFP) en 6-12 semanas de edad
R26-AKT1
E17K
ratones. Después de 6, 9 y 18 meses (n = 8, 8 y 7, respectivamente) se sacrificaron los ratones y se analizaron los pulmones. No se observaron anormalidades pulmonares en
R26-AKT1
E17K
tratado con disolvente solo (PBS) ratones (n = 7) (Figura 3A). Por el contrario, prácticamente todos los
R26-AKT1
E17K
ratones desarrollaron bronquial moderada y /o hiperplasia bronquiolos terminales a los 9 meses después de la administración de Ad-Cre (Figura 3B y 3C).
AD. Representante H & amp; E tinción del epitelio pulmonar de los
R26-AKT1
E17K
ratones tratados con disolvente solo (no infectado) o infectadas con Ad-Cre (9 y 18 meses de edad , respectivamente). Magnificación como se indica.
Para caracterizar mejor las lesiones detectadas en las transgénico
R26-AKT1
E17K
ratones, se evaluó la hiperplasia pulmonar mediante el análisis del número de de las capas epiteliales en el epitelio bronquial y el porcentaje de la hiperplasia sobre toda la superficie de 3 secciones en serie derivada de representante
R26-AKT1
E17K
ratones después de 6 (n = 3) y 9 (n = 3) meses a partir de la administración de Ad-Cre (código de ratones#7a-#12a). Como controles hicimos uso de la misma cantidad de
R26-AKT1
E17K
tratado con disolvente solo (ratón#código 1a-#6a) ratones, respectivamente. Se realizó la cuantificación de las capas epiteliales y de las áreas hiperplásicas como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Imágenes representativas de las puntuaciones asignadas por el número de capas se muestran en la Fig S2.
lesiones hiperplásicas fueron clasificados sobre la base del número de capas epiteliales y el porcentaje de la hiperplasia. Evaluación de las capas epiteliales, la puntuación de 1: 1-2 capas de células epiteliales, la puntuación 2: 2-3 capas de células epiteliales, la puntuación de 3: & gt; 4 capas de células epiteliales (n = 6 ratones /grupo; 3 secciones en serie /ratón ). La evaluación de la magnitud de la proliferación, la puntuación de 1: hiperplasia de 1-20% de las secciones totales analizados; Resultado 2: hiperplasia de 21-60% del total de las secciones analizadas; Resultado 3: hiperplasia de 61-100% del total de las secciones analizadas (n = 6 ratones /grupo; 3 secciones en serie /ratón). Las lesiones se clasificaron de acuerdo con una puntuación combinada resultante de la suma de la puntuación de las capas y la puntuación del porcentaje de la hiperplasia observada (p & lt; 0,05; t de Student).
Entre los ratones de control puntaje Capa fue 1 a 4 de cada 6 ratones y 2 para 2 de cada 6 ratones. hiperplasia puntuación global fue de 1 5/6 y 2 1/6 de los ratones. Por el contrario, de la
R26-AKT1
E17K
puntuación de los ratones de la capa fue de 1 1/6 ratones y 2 de 5/6 ratones y Global puntuación de hiperplasia fue 1 a 2/6 , 2 por 2/6 2/6 y 3 para los ratones. Por último, encontramos que
R26-AKT1
E17K
ratones presentó una puntuación combinada de la hiperplasia de 3,8 ± 0,4 que fue significativamente mayor que la de los ratones de control (2,5 ± 0,3) ( n = 6 /grupo; p & lt;. 0,05)
a continuación, se investigó si las lesiones hiperplásicas observados fueron proliferativa o por immonostaining de Ki67 y p21 relacionadas con la senescencia. Los resultados se resumen en la Tabla 2 y las imágenes representativas de la tinción de Ki67 y p21 en los pulmones del ratón se muestran en la figura S3. Se encontró que el número medio de núcleos Ki67 positivas en ratones R26-AKTE17K transgénicos (11,1 ± 1,2, n = 5) era más de 2 veces mayor en comparación con los ratones control (4,6 ± 0,49, n = 3). Por el contrario, no se observó ninguna diferencia significativa de la tinción de p21. Estos resultados sugieren que las lesiones hiperplásicas inducidos por AKT1
E17K en el pulmón de ratones transgénicos son resultado del aumento de la proliferación celular.
Es de señalar que después de 18 meses de tratamiento, dos de cada siete
R26-AKT1
+ /E17K
ratones tratados con Ad-Cre desarrollaron un solo nódulo cada uno, que se diagnosticó como adenocarcinoma bronquio-alveolar con patrón papilar que consiste en cuerdas y nidos de células epiteliales rodeadas por estroma fibrovascular escasa (Fig 3D). análisis de inmunotinción demostró altos niveles de pAKT en el hiperplásico y lesiones neoplásicas de
R26-AKT1
E17K
ratones infectados con Ad-Cre en comparación con los pulmones de los ratones no infectados (Fig 4A 4C).
pAKT inmunotinción de tejidos pulmonares de
R26-AKT1
E17K
ratones tratados con disolvente solo (A) o infectadas con Ad-Cre después 9 y 18 meses después de la infección, respectivamente (B, C).
en conclusión, parece que el mutante AKT1
E17K alelo induce hiperplasia moderada de los bronquios y /o bronquiolos terminales que, en a largo plazo y a baja frecuencia, puede progresar a carcinoma manifiesta.
Mutant AKT1
E17K coopera con carcinógenos químicos
en las células humanas, AKT1
E17K promueve la proliferación y migración cuando se expresa en células bronquiales inmortalizadas por el Adeno 12 /SV0 virus híbrido [30]. Para investigar si las mutaciones AKT1 son capaces de cooperar con otros éxitos oncogénicos también
in vivo
, hicimos uso de carbamato de etilo (uretano), un compuesto químico presente en el humo que se ha utilizado ampliamente para modelar de forma experimental la carcinogénesis pulmonar multietapa [41].
R26 o R26-AKT1
E17K
hermanos de camada eran o infectado con Ad-Cre (10
6-10
7 UFP) o tratado por disolvente solo antes de ser expuesto a uretano (1 mg /g) y se analizaron después de 6 o 9 meses. Multiplicidad y el tamaño de los tumores de pulmón /resultaron ser significativamente mayor en
R26-AKT1
E17K
ratones infectados con Ad-Cre. Al ser relativamente resistente a uretano,
R26-AKT1
E17K
ratones que no habían sido previamente expuestos a Ad-Cre desarrolló nódulos en 1 de cada 6 ratones a los 6 meses y en 1 de 4 ratones a los 9 meses después de la administración de uretano, respectivamente (Fig 5A). Por el contrario, casi todos los
R26-AKT1
E17K
ratones que habían sido infectadas con Ad-Cre antes de la administración de uretano, presentado nódulos pulmonares tanto después de 6 (n = 4) y 9 (n = 6) meses de tratamiento. El número medio de tumores desarrollados por los ratones mutantes tratados con uretano e infectadas con Ad-Cre fue 3 /ratón a los 6 meses y 7 /ratón a los 9 meses; Por el contrario, los ratones tratados solamente con uretano desarrollado & lt; 0,15 tumor /ratón a los 6 meses y de 1,6 tumores /ratón a los 9 meses (Fig 5A). En particular, el tamaño de los tumores desarrollados por los ratones mutantes tras la infección con Ad-Cre fue dependiente de la dosis de Ad-Cre administrado (Fig 5B).
A. Pulmón número de tumores de
R26-AKT1
E17K
infectadas con Ad-Cre (6 y 9 meses después del tratamiento, respectivamente). Cada punto representa un ratón; barras representan las medias ± SD. ** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05. B. El diámetro de los tumores de pulmón generados por uretano en
R26-AKT1
E17K
ratones tratados con dosis crecientes de Ad-Cre. Las barras representan diámetro del tumor ± SD significa. * P & lt; 0,05. C, D. Representante H & amp; E tinción de las lesiones pulmonares desarrollados en
R26-AKT1
E17K
ratones tratados con disolvente o Ad-Cre, como se ha indicado, 9 meses después de la administración de uretano . E, F. Phosporylated AKT tinción de las lesiones pulmonares desarrollados en
R26-AKT1
E17K
tratados con disolvente o Ad-Cre, como se ha indicado, 9 meses después de la administración de uretano ratones. Magnificación como se indica.
Los tumores generados por uretano en el
AKT1
E17K
fondo fueron diagnosticados de adenomas /adenocarcinomas bronquio-alveolar que se presentaron con mayor frecuencia patrón papilar (Fig 5C y 5D). Una observación final fue que, a diferencia de los tumores generados en los ratones de control que demostraron poco o moderada tinción para pAKT, los generados en
R26-AKT1
presentó E17K
ratones un aumento marcado en pAKT tinción (Fig 5E y 5F). Por último, analizamos
Kras
estado en ratones tratados con uretano. Se extrajo el ADN de los tumores de parafina-fijados con formol microdissected de ratones tratados con uretano seleccionados (2 ratones tratados con uretano solo y 4 ratones tratados con uretano más Ad-CRE). La región que abarca el codón 61 en el exón 3 de
Kras
gen se amplificó y se sometió a secuenciación de ADN Sanger. El análisis de secuencia de los tumores demostró la presencia de un A & gt; G de transición en el codón 61 que conduce a la sustitución Q61 con R. Ver S4 Fig para cromatogramas representativos. Estos resultados indican que AKT1
E17K podrá cooperar con los eventos oncogénicos inducidos por uretano en pulmón de ratón (es decir,
Kras
mutaciones de ganancia de función), acelerando así la progresión de los tumores manifiestos.
el ratón, células de Clara alinean el epitelio bronquiolar y expresan la proteína Clara 10 (CC10) asociado a células alveolares de tipo II, mientras que las células (AT2) residen en los alvéolos y expresan la proteína C surfactante (SPC) [42-44].
por lo tanto, para caracterizar las células que constituyen las lesiones pulmonares inducidas por AKT1
E17K en el ratón, se realizó inmunofluorescencia indirecta para SP-C y CC10 en secciones de pulmón FFPE derivados de
R26-AKT1