Extracto
Cáncer de células madre similares (CSC) /células iniciadoras del cáncer (AIC) se definen como una pequeña población de células cancerosas que tienen alta tumorigenicidad. Además, CSC /CIC son resistentes a varias terapias contra el cáncer, y por lo tanto CSC /CIC se cree que son responsables de la recurrencia del cáncer después del tratamiento y metástasis a distancia. En los casos cáncer ovárico epitelial (EOC), con frecuencia se observa recurrencia de la enfermedad después de la quimioterapia, lo que sugiere células madre cancerosas ováricas /CIC están involucrados. Hay cuatro principales subtipos histológicos en EOC, y el adenocarcinoma seroso y adenocarcinoma de células claras son tumores malignos de alto grado. Por lo tanto, analizamos ováricos CSC /CIC de las líneas celulares de carcinoma de ovario (adenocarcinoma seroso y adenocarcinoma de células claras) y células de cáncer de ovario primario en este estudio. Se aislaron ováricos CSC /CIC como un aldehído deshidrogenasa 1 alta (alta ALDH1
) de la población de 6 líneas celulares (EOC 3 adenocarcinomas serosos y los adenocarcinomas de células claras 3) por el ensayo ALDEFLUOR. ALDH1
pilas de gran mostraron una mayor capacidad de formación de esferas, mayor tumorigenicidad y una mayor capacidad invasiva, lo que indica que las CSC de ovario /CIC se enriquecen en ALDH1
pilas de gran. ALDH1
pilas de gran también podrían ser aislados de 8 de 11 muestras de carcinoma de ovario primario. La tinción inmunohistoquímica reveló que los altos niveles de expresión ALDH1 en los casos de cáncer de ovario se relacionan con un peor pronóstico en los dos casos de adenocarcinoma seroso y casos de adenocarcinoma de células claras. Tomados en conjunto, los resultados indican que ALDH1 es un marcador de ovario CSC /CIC y que el nivel de expresión de ALDH1 podría ser un nuevo marcador biológico para la predicción de mal pronóstico
Visto:. Kuroda T, Hirohashi Y, T Torigoe , Yasuda K, Takahashi A, Asanuma H, et al. Células de cáncer ovárico (2013) ALDH1 de alta Stem-Como se puede aislar de células de adenocarcinoma de células serosas y claras, y ALDH1 alta expresión se asocia con un mal pronóstico. PLoS ONE 8 (6): e65158. doi: 10.1371 /journal.pone.0065158
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 8 Febrero 2013; Aceptado: 22 de abril de 2013; Publicado: 6 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Kuroda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (los números de subvención 16209013, 17016061 y 15659097) para la práctica de Investigación de Aplicaciones de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón, y para el cáncer Investigación (15-17 y 19-14) del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, Cancer Research Fund Ono (NS) y la Fundación de Ciencias de Takeda (YH). Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo Nacional de Investigación y Desarrollo del Centro del Cáncer (23-A-44). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es una enfermedad maligna con una alta mortalidad y es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo. [1], [2] síntomas oscuro y poco claros hacen que la detección del cáncer de ovario en la primera etapa difícil. [3] En general, el cáncer de ovario es relativamente sensible a la quimioterapia de primera línea basada en platino /taxano. [4] respuesta clínica completa (CR), a menudo se puede lograr por medio de cirugía citorreductora y quimioterapia en pacientes con cáncer de ovario avanzado; sin embargo, la mayoría de los pacientes con estadio avanzado tiene recurrencia de la enfermedad que es la razón de la alta mortalidad de esta enfermedad. [5] Algunos candidatos terapéuticos de fármacos diana molecular para el cáncer de ovario se habían probado, pero no se lograron mejoras notables en el pronóstico. [2], [6].
Los recientes avances en la investigación del cáncer ha revelado que los cánceres se componen de una población heterogénea de células y que sólo una pequeña población de células llamadas células madre, como el cáncer (CSC) /cáncer células -initiating (AIC) tienen un alto potencial (hipótesis de las células madre del cáncer) iniciadoras del tumor. CSC /CIC se definen como una pequeña población de células que tienen (1) alta tumorigenicidad, (2) la capacidad múltiple diferenciación y (3) la capacidad de auto-renovación. [7] - [9] Resultados del estudio reciente también han demostrado que las CSC /CIC están relacionados con la recurrencia del cáncer y la resistencia a la radiación o la quimioterapia. [10], [11] Por lo tanto, se cree que CSC /CIC para ser responsable de la recurrencia del cáncer y la metástasis a distancia, y la eliminación de los CAC /CIC tanto, es indispensable para la cura del cáncer.
Existen varios enfoques para la identificación de células madre cancerosas /CIC de los cánceres en una variedad de tejidos de órganos. [12] Estos enfoques incluyen (1) el uso de marcadores de la superficie celular tales como CD44
+ CD24
- /lowESA
+ [13], CD133
+ [14], CD44
+ CD117
+ [15], y CD166
+ [16], (2) la población lateral (SP) de ensayo [17], en el que la población de células que tiene la capacidad para bombear un medicamento (Hoechst33342 [18 ] o tinte Ciclo Violet [19]) a través del transportador de casete de unión a ATP es considerada como CSC /CICs, y (3) ensayo de ALDEFLUOR basado en el nivel de aldehído deshidrogenasa 1 () actividad de la enzima ALDH1. [20].
La función de ALDH intracelular es catalizar la oxidación de aldehído, y por lo tanto ALDH juega un papel importante en la homeostasis celular. Estudios recientes han revelado que tanto las células normales y cancerosas con niveles elevados de actividad ALDH1 tienen el potencial de funcionar como células madre y potenciales de la capacidad de auto-renovación y propiedades resistentes al estrés. [20] - [22].
También en el cáncer de ovario epitelial (EOC), algunos investigadores han sugerido la utilidad de la actividad ALDH1 para identificar los CAC /CIC. La existencia de células con alta actividad de ALDH (ALDH1high células, en comparación con las células ALDH1low) también se ha demostrado en líneas celulares de EOC y en muestras clínicas. [23] - [25] La correlación entre la actividad ALDH1 y el pronóstico de los pacientes, sin embargo, sigue siendo controvertido en la EOC. [26] Al mismo tiempo, la importancia de la expresión ALDH1 para cada subtipo histológico de EOC aún no ha sido aclarado
.
En este estudio, hemos identificado y evaluado la troncalidad de ALDH1
en pilas de gran serosa el adenocarcinoma y el adenocarcinoma de células claras de ovario, no sólo a partir de líneas celulares establecidas, sino también de las células del cáncer de ovario primario. También se analizó estadísticamente la asociación entre la expresión ALDH1 y el resultado clínico de los pacientes con cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Los ratones se mantuvieron y experimentó en conformidad con el directrices y después de la aprobación del Comité de Sapporo Escuela de Medicina de la Universidad de Medicina, Centro de Experimentación Animal con el número 08-006 permiso. Cualquier animal encontró poco saludable o enfermo fue sometido a eutanasia con prontitud. Todos los estudios fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) de Sapporo Medical University Hospital y el IRB del Hospital Hakodate Goryokaku. El consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki.
Líneas celulares y condiciones de Cultura y
En este estudio, 3 líneas celulares de adenocarcinoma seroso de ovario (CMOZ-2, HUOA y se utilizaron OVCAR-3) y 3 líneas de ovario claras de adenocarcinoma de células de células (ES-2, RMG-1 y TOV21G). CMOZ-2 (amablemente proporcionado por el Dr. Yabushita, Departamento de Obstetricia y Ginecología, Universidad de Medicina Aichi-, Aichi, Japón) [27], HUOA (amablemente proporcionado por el Dr. Ishiwata, Hospital de Obstetricia y Ginecología, Ibaraki, Japón) [28 ], OVCAR-3 y TOV-21G (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) se cultivaron en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). ES-2 células (ATCC) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich). células RMG-1 (JCRB Banco de Células, Osaka, Japón) se cultivaron en DMEM /F-12 (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). Cada medio fue suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Las células se incubaron en un 5% humidificado de CO
2 incubadora a 37 ° C.
El aislamiento de las células de cáncer primario de muestras clínicas
Todos los estudios fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) de Sapporo Medical University hospital y el IRB del hospital Hakodate Goryokaku. El consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki.
Los tumores sólidos se cortaron en fragmentos, lavada con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se centrifuga a 2000 rpm durante 10 minutos. A continuación, los agregados de células se incubaron a 37 ° C durante aproximadamente 30 min con 2 mg de calidad para investigación Liberase ™ (Roche, Basilea, Suiza) en 10 ml de Iscove modificado de Dulbecco Medium (IMDM, Life Technologies) hasta que se separa en células individuales. Las células obtenidas por estos procedimientos se analizaron mediante citometría de flujo como se describe a continuación.
Cell activado por fluorescencia ALDEFLUOR Ensayo y aislamiento por clasificación (FACS)
Se utilizó un kit de ensayo ALDEFLUOR (Stem Cell Technologies ™, Vancouver, BC, Canadá) para determinar la actividad de las células ALDH1 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se suspendieron en tampón de ensayo que contiene ALDEFLUOR 1 mol /l por 1x10
6 células del sustrato ALDH, boro-dipyrromethene-aminoacetaldehído (BAAA), y se incubaron durante 50 min a 37 ° C. Cada muestra se trató con 50 mmol /l de un inhibidor de ALDH-específica, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), como un control negativo. Las células teñidas se analizaron por BD FACSAria ™ II (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Las células se tiñeron con 1 g /ml de yoduro de propidio para evaluar su viabilidad antes del análisis.
Para el aislamiento de células epiteliales a partir de muestras de cáncer de ovario sólidos, se solucionaron células cancerosas epiteliales utilizando anti-CD326 (Ep-CAM) anticuerpo APC (BD Biosciences). Utilizamos microperlas anti-CD326 (BD Biosciences) y un sistema de autoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) para enriquecer las células epiteliales de la ascitis maligna de los casos de cáncer de ovario antes del ensayo ALDEFLUOR.
Análisis del Ciclo Celular y
in vitro
Cell Grow Análisis
ALDH1
y pilas de gran ALDH1
bajas fueron fijadas directamente con etanol al 70% después de la clasificación. A continuación, se resuspendieron en PBS que contenía 250 mg /ml de RNasa A (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 37 ° C y se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio durante 10 minutos a 4 ° C en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron con un citómetro (BD Biosciences), y los datos fueron analizados utilizando el programa de análisis del ciclo celular Mod-Fit
.
in vitro
ensayo de crecimiento celular, ALDH1
y pilas de gran ALDH1
baja células aisladas a partir de células RMG-1 CMOZ-2 y se sembraron en una placa de 6 pocillos a 5 x 10
4 células por pocillo. Después de la incubación durante 48 y 96 horas, las células se retiraron por el número de células viables tripsina y se determinaron utilizando Countess® (Life Technologies).
de formación de esferas de ensayo /sola célula de formación de esferas de ensayo
ALDH1
células bajas y altas ALDH1
se aislaron por FACS y luego cultivadas en platos de 6 pocillos superficie de fijación ultra-bajas (Corning, Tewksbury, MA, EE.UU.) a 1000 células por pocillo. Para el ensayo de formación de la esfera de una sola célula, tanto ALDH1
alto y ALDH1
baja se clasificaron en 96 pocillos platos de sujeción ultra bajas (Corning) en una sola célula por pocillo. Las células se cultivaron en medio de células madre, DMEM libre de suero /F12 (Life Technologies) suplementado con N-2 suplemento (Life Technologies), 20 mg /factor de crecimiento ml recombinante humano epitelial (Life Technologies), 10 mg /ml humana factor de crecimiento de fibroblastos básico (Sigma-Aldrich), 4 mg /ml de heparina (Sigma-Aldrich), 4 mg /ml de albúmina de suero bovino (Life Technologies), 20 g /ml de insulina humana, solución de zinc (Life Technologies), y 2,9 mg /ml de glucosa (Sigma-Aldrich). Se observó [29] El cambio morfológico diariamente bajo un microscopio de luz durante 14 días.
In vivo
tumorigenicidad
Ordenada ALDH1
células bajas y altas ALDH1 se resuspendieron a 1,0 x 10
2, 1,0 × 10
3 y 1,0 × mezcla de 10
4 células en 100 l de PBS y Matrigel (BD Biosciences) (1: 1). A continuación, se inyecta por vía subcutánea en cada mezcla de la derecha /izquierda media vuelta áreas de diabéticos no obesos /grave deficiencia inmunitaria-femenina combinada (SCID NOD /) ratones de 6 semanas de edad (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japón) bajo anestesia por inhalación de isoflurano. iniciación y progresión del tumor se observaron semanalmente hasta que los ratones se sacrificaron a las 7 semanas después de la inyección. volumen tumoral externa se calculó como 0,5 × × Dmax (Dmin)
2 [mm
3] (Dmax: eje largo, Dmin: eje corto de la masa).
tinción inmunohistoquímica para el tejido de cáncer de ovario
la tinción inmunohistoquímica de ALDH1 y Ki-67 se realizó con secciones fijadas en formalina, embebidas en parafina de 123 tejidos epiteliales de ovario cáncer (62 adenocarcinomas serosos, 37 adenocarcinomas de células claras, 18 adenocarcinomas endometrioide y 6 adenocarcinomas mucinosos) como descrito anteriormente. [30] [31] La recuperación del antígeno se llevó a cabo por las secciones ebullición 120 ° C durante 5 min en un horno microondas en citrato precalentado 0,01 mol /l de sodio (pH 6,0). actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% en etanol durante 10 min. Después del bloqueo con leche en polvo 1% no grasa en PBS (pH 7,4), las secciones se hicieron reaccionar con anti-ALDH1 anticuerpo de ratón monoclonal (1: 250, Sigma-Aldrich) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ki-67 (1: 100 , DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 hora seguido de incubación con biotina anti-ratón IgG (Nichirei) durante 30 min. Posteriormente, las secciones se tiñeron con complejo setreptavidin-biotina (Nichirei Biosciences, Tokio, Japón), seguido de incubación con 3,3'-diaminobencidina como cromógeno utilizado y la contra-tinción con hematoxilina. La tinción citoplasmática era considerado como positivo para ALDH1, y los núcleos de tinción se considera como positiva para Ki-67. Para la evaluación de la tinción ALDH1, los casos fueron divididos en dos grupos (ALDH1
grupo alto y ALDH1
grupo bajo) por las medianas (medianas de adenocarcinoma seroso la mediana y el adenocarcinoma de células claras de ser el 20% y 15%, respectivamente) .
Matrigel invasión de ensayo
La capacidad invasiva de las células se evaluó utilizando cámaras de invasión de Matrigel (BD Biosciences). Aislados ALDH1
altas y ALDH1
baja células (1,0 x 10
4) se sembraron en cada cámara superior en DMEM libre de suero. Las cámaras exteriores se llenaron con DMEM incluyendo 10% de FBS como un quimioatrayente. Las células se incubaron durante 48 horas, y las células invasivas se tiñeron con hematoxilina, se montaron en portaobjetos, y se contaron a 400 veces mayor campo superior mediante microscopía óptica.
Análisis estadístico
El análisis estadístico, los datos de ajuste y los gráficos se realizaron utilizando el paquete de software SPSS ver.19 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Los datos se muestran como media ±
SD Red de al menos 3 experimentos independientes, y la prueba t de Student se utilizó para evaluar las diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,05). La supervivencia global (OS), que se define como el intervalo de la fecha del primer diagnóstico hasta la fecha de la muerte de la progresión de la enfermedad y la supervivencia libre de progresión (PFS), que se define como el intervalo desde la fecha del primer diagnóstico hasta la fecha de progresión de la enfermedad, se calcula utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Asociaciones de expresión ALDH1 con estadio clínico, las metástasis de los ganglios linfáticos y la difusión se analizaron mediante el test de Fisher.
Resultados
El aislamiento de ALDH1
Las células de alta COE Líneas Celulares
Existen varios métodos para aislar células madre cancerosas /CIC ya se han descrito [12], y un aldehído deshidrogenasa 1 población de alto (ALDH1
alto) identificado por el ensayo fue descrito ALDEFLUOR ser enriquecido con CSC /CIC. [20] En consecuencia, analizaron líneas celulares de carcinoma de ovario mediante el ensayo ALDEFLUOR para aislar ováricos CSC /CIC. Investigamos 3 humano líneas celulares de adenocarcinoma de ovario seroso (CMOZ-2, HUOA y OVCAR-3) y 3 líneas celulares de adenocarcinoma de células claras humanos (ES-2, RMG-1 y TOV-21G) (Figura 1). ALDH1
alta población se identificó en todas las células de la línea de carcinoma de ovario, y la relación de ALDH1
pilas de gran varió de 0,7% para ES-2 células a 7,9% para las células TOV-21G. Podríamos aislar ALDH1
pilas de gran manera estable a partir de 4 líneas celulares (AMOC-2, ES-2, RMG-1 y TOV-21G), y por lo tanto utiliza estas líneas celulares para su posterior análisis.
ALDH1 se detectaron
pilas de gran en 3 líneas celulares de adenocarcinoma seroso (CMOZ-2, HUOA y OVCAR-3) y en 3 líneas celulares de adenocarcinoma de células claras (ES-2, RMG-1 y TOV-21G). SSC-A: análisis de conformación de cadena sencilla. BAAA: aminoacetaldehído boro-dipyrromethene-. FITC-A: análisis de isotiocianato de fluoresceína. Los porcentajes en las casillas indican ALDH1
altas proporciones de células. Diethylaminobenzaldehyde (DEAB), un inhibidor de ALDH-específico, se utilizó como control negativo.
Caracterización de ALDH1
células de elevada
Desde CSC /CICs son conocidos para formar esferas en condiciones de cultivo flotantes [29], se analizaron ALDH1
pilas de gran mediante un ensayo de formación de esferas. Un total de 10
3 células por pocillo se clasifica y se incubó en una placa de 6 pocillos en un entorno independiente de anclaje. En el día 10, ALDH1
pilas de gran derivadas de CMOZ-2 células mostraron una mayor capacidad de formación de esferas que el de ALDH1
células bajas. Resultados similares se obtuvieron de ES-2 células, las células RMG-1 y células TOV-21G (Figura 2A). Dado que el ensayo de formación de esferas no es adecuado para la cuantificación de las proporciones de los CAC /CIC en ALDH1
pilas de gran, se realizó un único ensayo de formación de esfera celular. se observó la formación de Esfera en el 4,86% de los pozos de ALDH1
pilas de gran derivadas de CMOZ-2 células y en el 3,13% de los pozos de ALDH1
pilas de gran derivadas de ES-2 células (Figura 2B). Por otra parte, fuentes de la ALDH1
baja células derivadas de ambos CMOZ-2 y ES-2 células no mostraron ninguna formación de esferas.
Un ensayo de formación de esferas Mil ALDH1
pilas de gran y ALDH1
baja células se cultivaron en una condición flotante. Las esferas se contaron en el día 10. Ampliación de imágenes: 100 ×. Criterio para el tamaño del esferoide: más de 100μm. Cada valor es la media del número de esferoides ± SD. * Los valores de p. B de células de ensayo individual de formación de esferas Ordenada ALDH1
y pilas de gran ALDH1
baja células se cultivaron en una condición flotante en una sola célula por pocillo. Las esferas se contaron en el día 12. Sólo ALDH1
a partir de células de alta CMOZ-s y ES-2 células iniciaron esferoides de células individuales. Magnificación de imágenes: 200 ×. Cada valor es la media del porcentaje de esferoides ± SD. C Matrigel invasión de ensayo Imágenes: células derivadas de ALDH1 Matrigel-invasor
células altas /bajas de células TOV-21G ES-2 y. Magnificación de imágenes: 100 ×. Cada valor es la media del número de células invasoras ± SD. * Los valores de p.
A continuación, se investigó la capacidad de invasión de ALDH1
alto y ALDH1
baja células mediante el ensayo de invasión de Matrigel. ALDH1
pilas de gran derivadas de las cuatro líneas de células mostraron una mayor capacidad de invasión de matrigel que hizo ALDH1
baja células (Figura 2C).
El estado del ciclo celular de ALDH1
pilas de gran y la de ALDH1
se analizaron las células bajas. Las proporciones de ALDH1
pilas de gran en fase S y G2 /M fase fueron mayores que la relación de ALDH1
baja células en la fase S y G2 /M fase (Figura 3A). Cell crecer análisis reveló que ALDH1
pilas de gran derivadas de células CMOZ-2 y RMG-1 tuvieron mayor tasas de crecimiento que los de ALDH1
baja células (Figura 3B).
Un análisis del ciclo celular ALDH1
células bajas y altas ALDH1
se analizaron mediante un ensayo de ciclo celular. El gráfico indica las proporciones de las células en la fase G0 /G1, S y G2 fase de fase /M. el análisis del crecimiento de la célula B Las capacidades de crecimiento de ALDH1
se investigaron y pilas de gran ALDH1
células bajas. Cada valor es la media del número de células ± SD.
Superior tumorigenicidad de ALDH1
Las células altas que la de ALDH1
Las células bajas
Para hacer frente a la
in vivo
tumorigenicidad de ALDH1
células bajas y altas ALDH1
a partir de líneas celulares de EOC, el trasplante de xenoinjerto en ratones NOD /SCID por ALDH1
alto y ALDH1
baja células derivadas de CMOZ-2 y células RMG-1 se llevó a cabo (Figura 4A, 4B y 4C). Como se muestra en la Tabla 1, se observaron tumores en 5 de 5 ratones (10
4 células de inyección), 4 de 5 ratones (10
3 células de inyección) de inyección y 2 de 5 ratones (10
2 células ) en el que los xenotrasplantes de ALDH1
se realizó pilas de gran derivadas de CMOZ-2 células. Por otro lado, se observaron tumores en sólo 3 de 5 ratones (10
4 células de inyección) y 2 de 5 ratones (10
3 células de inyección) en el que el xenotrasplante de ALDH1
se realizó células bajos. Además, la tasa de crecimiento de los tumores derivados de AMOC-2 ALDH1
pilas de gran fue significativamente más rápida que la de los tumores derivados de AMOC-2 ALDH1
células bajos (Figura 4C). Se obtuvieron resultados similares para las células RMG-1 (Figura 4B y 4C).
Un ALDH1
tumores altas /bajas derivadas de CMOZ-2 células. B ALDH1
tumores altas /bajas derivadas de células RMG-1. Foto: ratones NOD /SCID que fueron inyectados con 1,0 × 10
3 ALDH1
células de alta /baja y en el cual los tumores observados en ambos lados de la espalda. imágenes histológicas: tinción con hematoxilina-eosina (H-E, panel izquierdo), tinción inmunohistoquímica ALDH1 (panel central), Ki-67 tinción inmunohistoquímica (panel derecho) de ALDH1
tumores alta /baja. Magnificación de imágenes: × 400. curvas de crecimiento de C ALDH1
tumores altas /bajas derivadas de células RMG-1-2 y CMOZ. Columna de la izquierda: CMOZ-2 células, la inyección de 1,0 × 10
3. columna central: CMOZ-2 células, 1,0 × 10
2 de inyección. Columna derecha: células RMG-1, 1,0 × 10
3 de inyección. Cada valor es el volumen medio del tumor ± SD. * Los valores de p. D La inmunorreactividad a ALDH1 o Ki-67 de ALDH1
tumores altas /bajas derivadas de CMOZ-2 y RMG-1cells Cada valor es el porcentaje positivo media ± desviación estándar. * P valores.
aspectos histológicos de tumores derivados de ALDH1
1-RMG se investigaron y pilas de gran ALDH1
baja células que fueron aisladas de CMOZ-2 y células ( Figura 4A y 4B). Tumores derivados de CMOZ-2 ALDH1
y pilas de gran CMOZ-2 ALDH1
baja células mostraron adenocarcinoma pobremente diferenciado y no hubo diferencia significativa. Del mismo modo, los tumores derivados de RMG-1 ALDH1
pilas de gran y RMG-1 ALDH1
baja células mostraron pobremente diferenciado adenocarcinoma de células claras. La tinción inmunohistoquímica reveló que no había ninguna diferencia significativa en la tasa ALDH1-positiva entre los tumores derivados de AMOC-2 ALDH1
células y tumores de alto derivados de AMOC-2 ALDH1
células de baja, mientras que el tumor derivado de RMG-1 ALDH1
pilas de gran mostraron tasas positivas ALDH1 significativamente más altos que el de tumor derivado de RMG-1 ALDH1
células bajas (Figura 4D). Además, los tumores derivados de AMOC-2 ALDH1
pilas de gran y RMG-1 ALDH1
pilas de gran mostraron tasas significativamente mayor positivas para Ki-67 (MIB-1) que los de los tumores derivados de AMOC-2 ALDH1
células bajos y RMG-1 ALDH1
baja células (Figura 4D).
identificación de ALDH1
altos Las células en las muestras primarias EOC
Para detectar ALDH1
pilas de gran en el cáncer de ovario primario, se analizaron once materiales clínicos utilizando el ensayo de ALDEFLUOR (5 casos de células de cáncer de ovario sólidos y 6 casos de ascitis maligna de los casos de cáncer de ovario, que se resumen en la Tabla 2). Se identificaron las células epiteliales CD326-positivo en el cáncer de ovario tejidos sólidos, y las tasas positivas oscilaron entre 8,1% a 81,0% (Figura 5A, paneles superiores). se detectaron ALDH1
pilas de gran en 4 de los 5 casos, y positivas ALDH1
altas tasas de células variaron de 0,9% a 12,0% (Figura 5A, paneles inferiores). Además, se detectaron ALDH1
células con alto contenido de células CD326 positivas derivadas de la ascitis de cáncer de ovario en 4 de los 6 casos, y las tasas positivas de ALDH1
pilas de gran variaron de 1,7% a 4,2% (Figura 5B). Por lo tanto, la actividad ALDH1 determina usando el ensayo ALDEFLUOR podría ser un enfoque útil para el aislamiento de CSC /CIC de las células del cáncer de ovario primario.
Un análisis de las células de cáncer de ovario sólida El panel superior muestra la tinción primaria CD326. Porcentaje INDICAT tasa positiva para CD326 células. El panel inferior muestra de ensayo ALDEFLUOR de las células CD326 positivas. Izquierda: Paciente No.1, caso del estadio Ic adenocarcinoma de células claras. Derecha: Paciente N ° 3, caso de adenocarcinoma endometrioide fase Ic. B Análisis de las células de cáncer primario de ascitis de selección CD326 positivas se realizó antes del análisis ALDEFLUOR. Izquierda: Paciente Nº 4, caso del estadio IIIc adenocarcinoma seroso. Derecha: Paciente N ° 6, caso de células claras estadio IIIb y el adenocarcinoma endometrioide. CD326: molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). APC: aloficocianina zona. puntajes por ciento en cajas indican relaciones de CD326 positivas o ALDH1-actividad.
Asociación de alto nivel de expresión de ALDH1 es de mal pronóstico
Un total de 123 de cáncer de ovario epitelial los tejidos se tiñeron inmunohistoquímicamente con anticuerpo anti-ALDH1 (Tabla 3, Figura 6A). Las medianas de las tasas de ALDH1-positivas en los casos de adenocarcinoma seroso y casos adenocarcinoma de células claras fueron 20% y 15%, respectivamente. Por lo tanto, se dividió a los casos en dos grupos, ALDH1
grupo alto y ALDH1
baja del grupo, de acuerdo a las medianas. Como se muestra en la Tabla 3, no hubo correlación significativa del nivel de expresión de ALDH1 con la edad o con cada etapa clínica FIGO. Alto nivel de expresión de ALDH1 no mostró correlación significativa con estadios avanzados (etapa III + IV), el factor T, o la metástasis de los ganglios linfáticos en ambos casos de adenocarcinoma seroso y casos de adenocarcinoma de células claras. La prueba de log-rank reveló que un mayor nivel de expresión de ALDH1 se asocia con peor pronóstico, con una diferencia significativa en la SG de los pacientes con adenocarcinoma seroso (P = 0,006) y la SG de los pacientes con adenocarcinoma de células claras (p = 0,047) que los de menor nivel de expresión de ALDH1 (Figura 6B). mayor nivel de expresión de ALDH1 mostró una tendencia a la SSP corto que el de menor nivel de expresión de ALDH1, pero las diferencias no fueron significativas (adenocarcinoma seroso: p = 0,062; adenocarcinoma de células claras: P = 0,058).
tinción HE y ALDH1 tinción inmunohistoquímica de adenocarcinoma seroso de ovario primario (izquierda) y el adenocarcinoma de células claras de ovario primario (derecha) Parte superior izquierda del panel: tinción HE de ALDH1
altos espécimen. Alta panel de la derecha: ALDH1 tinción inmunohistoquímica de ALDH1
altos espécimen. Panel inferior izquierdo: H-E tinción de ALDH1
espécimen bajas. Panel inferior derecho: tinción inmunohistoquímica ALDH1 de ALDH1
espécimen bajas. Magnificación de imágenes: 400 ×. B log-rank test para ALDH1
bajos grupos de alto /de adenocarcinoma seroso de ovario y de pacientes con adenocarcinoma de células claras. adenocarcinoma seroso: 62 casos /adenocarcinoma de células claras: 37 casos. Los casos en el ALDH1
alta grupo son los casos con relación positiva para ALDH1 de más del 20% de los casos de adenocarcinoma seroso y el 15% de los casos de adenocarcinoma de células claras. A la izquierda: la columna: la supervivencia libre de progresión (SLP). Columna derecha: la supervivencia global (SG). * P valores.
Discusión
En este estudio, hemos aislado de ovario CSC /CIC con alta tumorigenicidad mediante el ensayo ALDEFLURO. Un ALDH1
alta población podría ser aislado no sólo a partir de líneas celulares de cáncer de ovario, sino también de las muestras de cáncer de ovario primario. Se han descrito varios métodos para el aislamiento de CSC /CIC. En efecto, células madre cancerosas de ovario /CICs se han aislado con éxito mediante el uso de diversos métodos, incluyendo el ensayo ALDEFLUOR [25], la población lateral (SP) el análisis [32], [33], y el uso de CD133
+ [34], CD44
+ CD24
- [35] y CD24
+. [36] Sin embargo, existe un informe que muestra que controversial un marcador CSC /CIC no funciona en algunos tipos de células. [37], [38] Por lo tanto, es esencial para validar la población de células aisladas por los marcadores CSC /CIC por varios tipos de análisis. En este estudio, hemos confirmado que el ALDH1
alta población tenía más alta tumorigenicidad y una mayor capacidad de formación de esferas. Estas observaciones indican que la ALDH1
pilas de gran hemos utilizado en este estudio se enriquecen con CSC /CIC. Ha habido pocos informes sobre el aislamiento con éxito de los CAC /CIC a partir de células de cáncer de ovario con remilgo. Se aislaron ALDH1
pilas de gran desde las 8 de 11 casos de cáncer de ovario primario. No hemos podido analizar ALDH1
pilas de gran de los cánceres de ovario primario debido a la limitación del número de células; Sin embargo, nuestro enfoque es un método posible y prometedora para aislar CSC /CIC de los cánceres de ovario primarios.
Los principales subtipos histológicos de EOC son adenocarcinoma seroso, adenocarcinoma de células claras, el adenocarcinoma endometrioide y el adenocarcinoma mucinoso, y estos subtipos son conocidos tener características diferentes en factor de riesgo de la carcinogénesis, aspectos de biología molecular y así sucesivamente. Más información acerca de los subtipos individuales es necesaria para mejorar la supervivencia de los pacientes. adenocarcinoma seroso es el subtipo histológico con peor pronóstico; Sin embargo, los casos de adenocarcinoma seroso a menudo son diagnosticados en una etapa avanzada. adenocarcinoma de células claras está aumentando gradualmente hasta casi el 12% de EOC en los países asiáticos, y la comparación de los casos en la misma etapa de 3 subtipos histológicos (adenocarcinoma de células claras, de adenocarcinoma endometrioide y el adenocarcinoma mucinoso) reveló que el adenocarcinoma de células claras es el peor pronóstico en cada etapas. Por lo tanto, se cree que el adenocarcinoma de células claras de ser el más alto grado EOC, recientemente. [39], [40] los casos de adenocarcinoma seroso se analizaron principalmente en estudios anteriores, y se han realizado pocos estudios en los que se analizaron los casos de adenocarcinoma de células claras. [23] - [25] En este estudio, se analizaron no sólo los casos de adenocarcinoma seroso, sino también a los casos de adenocarcinoma de células claras. Por lo tanto, esta información traerá idea de no sólo para los adenocarcinomas serosos, sino también la mayoría adenocarcinomas de células claras más alto grado.
Se encontró que 4 líneas celulares EOC incluyendo 3 líneas de adenocarcinoma de células claras fueron positivos para la formación de esferas con 1000 células /bien. Por otro lado, sólo dos líneas celulares (AMOC-2 y ES-2) mostraron formación de esferas en el análisis sola esfera celular. Estos resultados indican que las CSC /CIC, que tienen la capacidad de formar una esfera a partir de una sola célula, se enriquece en ALDH1
pilas de gran; sin embargo, las proporciones de los CAC /CIC no son tan altos incluso en ALDH1
poblaciones altas. Este resultado indica que el ensayo ALDEFLUOR es sólo un marcador sustituto de la CSC /CIC y que la combinación de ensayo ALDEFLUOR con otros marcadores podría ser un mejor enfoque para aislar células madre cancerosas /CIC.
En estudios anteriores sobre la tinción inmunohistoquímica, se obtuvieron resultados contradictorios con respecto a la asociación de la expresión ALDH1 con el pronóstico en EOC. Chang
et al
. informó que la expresión ALDH1 se correlaciona con un pronóstico favorable en el carcinoma de ovario seroso o no serosa [26], mientras que Deng
et al
. y Wang
et al
.