Extracto
Recientemente, hemos demostrado que el Trichosanthin (TCS), un agente prometedor para el tratamiento de adenocarcinoma cervical, inhibe la proliferación de células HeLa a través de la vía de señalización /MAPK /CREB PKC. Además, TCS reguladas por la expresión de Bcl-2 ha sido abrogada por un oligonucleótido señuelo (OGN) al elemento de AMP-sensible cíclico (CRE). El OGN señuelo bloqueó la unión de la proteína CRE vinculante (CREB) a Bcl-2. Estos resultados sugieren que la expresión génica mediada por CRE puede jugar un papel fundamental en la proliferación de células HeLa. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto de TCS sobre las detenciones del ciclo celular, en particular, si los genes implicados en el ciclo celular fueron reguladas por la CRE. Nuestro presente estudio muestra que las detenciones de S, G1 y G2 /M fases fueron acompañados por la significativa baja regulación de la ciclina A, D1 y CDK 2, 4 en células HeLa, ciclina D1, E y CDK 2, 4 en Caski y células C33A, y ciclina a, B1, e y CDK 2 en las células SW1990. Sin embargo, las detenciones del ciclo celular se invirtieron a través de la importantes sobre regulación de la ciclina D1 A y, por el tratamiento combinado de TCS y CRE. En conclusión, estos datos demuestran por primera vez que las detenciones del ciclo celular específicos en las células cancerosas pueden ser inducidos por TCS mediante la inhibición de la unión de CREB al CRE en genes relacionados con la proliferación celular
Visto:. Wang P, Huang S, Wang F, Ren Y, Hehir M, Wang X, et al. (2013) El AMP cíclico-elemento de respuesta regulados detenciones del ciclo celular en las células cancerosas. PLoS ONE 8 (6): e65661. doi: 10.1371 /journal.pone.0065661
Editor: Hong Wanjin, Instituto de Biología Molecular y Celular, Biopolis, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Noviembre 2012; Aceptado: April 25, 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071653), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (Y2111136), teclas avanzadas de la Ciencia y Programas tecnológicos de Ningbo (2011C51005), Fundación de Ciencias Naturales de la ciudad de Ningbo (2011A610050) y KC Fondo Magna Wong en la Universidad de Ningbo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Trichosanthin (TCS), un componente activo aislado de las raíces tuberosas de la hierba medicinal china
Trichosanthes kirilowii
[1], es un agente prometedor para el tratamiento del cáncer [2]. Nuestros informes anteriores mostraron que TCS inhibió la proliferación de células HeLa adenocarcinoma cervical [3] a través de la vía de señalización /MAPK /CREB PKC [4]. Además, TCS reguladas por Bcl-2 expresión [5], que fue abrogada por un elemento AMP-sensible cíclico (CRE, TGACGTCA) oligonucleótido señuelo (OGN), el bloqueo de la proteína de unión a CRE-(CREB) sitio de unión en Bcl-2 [6]. Estos resultados sugieren que la expresión génica mediada por CRE puede jugar un papel fundamental en la proliferación de células HeLa.
Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto de TCS en la detención del ciclo celular de las células HeLa, carcinoma escamoso de cuello uterino (Caski y C33A celular), y el carcinoma pancreático humano (células SW1990), sobre todo, si los genes relacionados con el ciclo celular fueron regulados por el OGN CRE señuelo.
en el presente estudio, hemos explorado aún más los efectos de TCS en la proliferación de las células cancerosas, las detenciones del ciclo celular en el progreso de la proliferación celular y la función de la CRE en la regulación del ciclo celular.
el objetivo de este estudio fue investigar los efectos de TCS en la proliferación celular del cáncer y el efecto de la CRE en TCS-inducida detenciones del ciclo celular. Una cuestión importante es si las ciclinas CRE-combinado jugaron un papel crítico en la regulación de la detención del ciclo celular en estas células cancerosas.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo
Las células cervicales (HeLa, Caski, C33A) y células SW1990 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.). HeLa, Caski, C33A [7] y células SW1990 [8] fueron cultivadas en monocapa en medio RPMI 1640 (Gibco, NY, EE.UU.) y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Bio Whittaker, Inc., Walkersville, MD, EE.UU.), en una de CO
2 incubadora (Forma Scientific, EE.UU.). El medio se reemplazó dos veces por semana, y las células se pasaron cada 4-5 días en una proporción de 01:03.
Célula de tratamiento
Las células se sembraron a 2 x 10
6 células /placa en placas de 100 mm en el medio basal. En la confluencia, se lavaron brevemente con PBS y después se trataron con TCS (compañía de farmacia Jinshan, Shanghai, China). Control de las células se incubaron en medio TCS-libre.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se evaluó con Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) usando los métodos descritos anteriormente [3 ], [4], [9].
El tratamiento de las células con Cre-OGNs
CRE señuelo OGN (5'-TGACGTCAGAGAGCGCTCTCTGACGTCA-3 ') y OGN de control (5'-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA- 3 ') se convirtieron en fosforotioato OGNs (Invitrogen Carlsbad, CA, EE.UU.) como se describe anterior [5], [6], [10].
Preparación de citosólicas y nucleares proteínas
La se realizaron preparaciones de proteínas citosólicas y nucleares, como se describe anteriormente [6], [11], [12]. En resumen, al final de cada tratamiento designado, las células se lavaron brevemente con PBS frío y se lisaron mediante el desguace de ellos en 0,5 ml de tampón hipotónico frío (10 mM HEPES, KCl 40 mM, MgCl 3 mM
2, ditiotreitol 1 mM, 0,2 % NP-40, 1 g /ml de aprotinina, leupeptina 2 mM, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 40 mM de fosfato de p-nitrofenilo, ortovanadato de sodio 1 mM y 50% de glicerol). Los lisados se recogieron y se incubaron en hielo durante 5 min, después se centrifugó a 15.000 × g durante 20 s. Se recogió el sobrenadante y se guarda como las fracciones citosólicas. El sedimento (es decir, núcleos de las células) se resuspendió en tampón hipertónico (HEPES 20 mM, KCl 420 mM, MgCl 1,5 mM
2, EDTA 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM, 0,2% NP-40, 1 g /ml de aprotinina, 2 M leupeptina, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 40 mM de fosfato de p-nitrofenilo, ortovanadato de sodio 1 mM y 25% de glicerol). Después de la incubación en hielo durante 60 min, las muestras se centrifugaron a 15.000 xg durante 20 min y se recogieron y se guardan como extractos nucleares los sobrenadantes. Las fracciones citosólicas y nucleares extractos se hirvieron durante 10 min y se disolvieron en SDS PAGE al 8%.
análisis del ciclo celular
En el análisis de citometría de flujo del ciclo celular, 1 × 10
6 células se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS y se fijaron con 70% durante la noche etanol enfriado con hielo. Las células fijadas fueron tratados con 25 mg /ml de RNasa A a 37 ° C durante 30 min y luego se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (50 g /ml, Sigma) solución durante 30 min en la oscuridad. La intensidad de la fluorescencia de las células individuales se midió con un citómetro de flujo (Beckman Coulter, Miami, FL, EE.UU.). Se contaron al menos 10.000 células [13].
análisis de transferencia de Western
lisados de células totales se prepararon por lisis de las células con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación y la concentración de proteína se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas (Bio -Rad). Para el análisis Western blot, 50 g de cada muestra se procesó como se describe [14]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-ciclina A, B1, D1, E, anti-CDK2, 4 y anti-actina (Señalización Celular Thehnology, Inc., Beverly, MA). Los anticuerpos secundarios fueron acoplados a peroxidasa de rábano picante y se detectaron por quimioluminiscencia (Bio-Rad, Hercules, CA). Las cantidades relativas de proteínas inmunorreactivas en cada banda se determinaron mediante el escaneo de análisis densitométrico de las películas de rayos X.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron tres veces. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ANOVA se utilizó para evaluar las diferencias entre los grupos. Datos reportados como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron significativas si
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Resultados
Efectos de TCS en la proliferación de células cancerosas
TCS de 20-100 mg /ml inhibió la proliferación de células de 3% a 70% después del tratamiento durante 24 h (Fig. 1). Se encontró que la concentración inhibitoria 50% (IC
50) de TCS en las células Caski y C33A a ser de 60 mg /ml, más bajo que en HeLa y células SW1990 (100 g /ml) (Tabla 1).
TCS inhibió la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
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Efectos de TCS en el progreso del ciclo celular y el ciclo celular proteínas reguladoras
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células HeLa se trataron con indicado Las dosis de TCS durante 24 h. El número de células de la fase S aumentó significativamente (A) y las expresiones de ciclina A, D1 y CDK2, 4 disminuyó significativamente (B). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
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Caski células fueron tratadas con dosis indicadas de TCS durante 24 h.. El número de células en fase G1 aumentaron significativamente (A) y las expresiones de ciclina D1, E y CDK2, 4 disminuyeron significativamente (B). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control).
SW1990 células fueron tratadas con dosis indicadas de TCS durante 24 h. El número de células en G2 /M fase aumentaron significativamente (A), las expresiones de la ciclina A, B1, E y CDK2 disminuyeron significativamente (B). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control).
Efectos de la CRE-señuelo sobre el progreso del ciclo celular y regulador proteínas
las detenciones de S, G1 y G2 /M fases inducida por TCS en HeLa (Fig. 5), Caski (Fig. 6) y SW1990 (Fig. 7) las células, fueron significativamente atenuada por el combinado tratamiento de TCS y CRE (A, B). Se encontró que las disminuciones inducidas por el TCS de la ciclina A y D1 fueron marcadamente revertido por la adición de CRE, en células HeLa (. 5, C, D FIG), las células Caski (. 6 Fig C, D) y células SW1990 ( la Fig. 7 C, D).
aumento
TCS inducida del número de células en la fase S fue atenuada significativamente por el tratamiento combinado de TCS + CRE (A, B). La expresión regulada hacia abajo de la ciclina D1 A y fue revertida por TCS + CRE. No se observó ningún efecto sobre otras proteínas (C, D). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
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aumento del número de células
TCS-inducida en la fase G1 fue significativamente atenuada por TCS + CRE (a, B). La expresión regulada hacia abajo de la ciclina D1 fue revertido por el tratamiento de TCS + CRE. No se observó ningún efecto sobre otras proteínas (C, D). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control,
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p Hotel & lt; 0,05 en comparación con TCS).
aumento del número de células en G2
TCS inducida /fase M fue atenuada significativamente por el tratamiento de TCS + CRE (a, B). la expresión regulada hacia abajo de la ciclina A fue revertido por el tratamiento de TCS + CRE. No hubo ningún efecto sobre otras proteínas (C, D). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes (*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control,
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Discusión
Este estudio mostró, por primera vez, que TCS ejerce efectos citotóxicos sobre la viabilidad de células de cáncer de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1). células Caski y C33A fueron sensibles a su efecto inhibidor sobre la proliferación celular (Tabla 1). Los resultados de los mecanismos anticancerígenos Es muestran claramente que el aumento de la fase S en células HeLa acompañó a la disminución de las células T
1 fase, mientras que el número de células T
2 de fase no cambió. En las células Caski y C33A, aumento significativo del G
1 fase y disminución de S y G se observaron células
2 fases. En las células SW1990, un aumento de G
2 /M fase las células se acompaña de una disminución de las células T
1 fase, sin ningún cambio que se encuentra en el número de células en fase S (Tabla 2).
Investigación de los cambios en múltiples moléculas reguladoras que participan en el ciclo celular mostró que la expresión de la ciclina a, D1 y CDK 2, 4 en células HeLa (Fig. 2), ciclina D1, e y CDK 2, 4 en Caski y C33A las células (Fig. 3), ciclina a, B1, e y CDK 2 en células SW1990 (Fig. 4) fueron significativamente las reguladas. El bloqueo de la sitio de unión de los genes del ciclo celular para CREB por OGN, un señuelo CRE, impidió la ciclos celulares M detenido-TCS S, G1 y G2 /en HeLa (Fig. 5 A, B), Caski (Fig. 6 A, B células) y SW1990 (Fig. 7 A, B), respectivamente. El TCS mediada baja regulación de la ciclina A, D1 en células HeLa (Fig. 5 C, D), la ciclina D1 en las células Caski (Fig. 6 C, D) y ciclina A en células SW1990 (Fig. 7 C, D) fueron invertidos por la combinación de CRE y TCS.
Estos resultados confirmaron y ampliaron nuestros informes anteriores que muestran que TCS tiene un efecto citotóxico sobre las células del cáncer [3], [4], y en parte reveló los mecanismos que subyacen a la activación de la proteína CREB [5], [6]. Sin embargo, no se ha informado anteriormente si la detención del ciclo celular mediada por TCS se produce a través de la combinación de CRE y de destino genes. El presente estudio muestra que la CRE señuelo OGN atenuó la disminución de la expresión de ciclina D1 A y que resulta del tratamiento de TCS, y revocó la detención del ciclo celular
.
El ciclo celular está fuertemente mediada a través de una compleja red de positivo y moléculas reguladoras del ciclo celular negativa tales como las CDK, CKIs y ciclinas [15], [16]. Se ha informado de que la formación de complejos de D /CDK4 y ciclina E /CDK2 activa ciclina controla la progresión a través de la fase G1 (transición G1 /S). Además, la ciclina A se une y activa CDK2, la promoción de G1 /S y G2 /M del ciclo celular transiciones. A finales de G2, la ciclina B /CDK2 se activa, lo que permite la entrada en mitosis [17]. En el presente estudio, se encontró que las expresiones disminución de ciclina A, D1 y CDK2, 4 fueron asociados a la detención de la fase S en células HeLa (Fig. 2). Las expresiones disminución de ciclina D, E y CDK2, 4 estaban relacionados con la fase G1 en las células Caski y C33A (Fig. 3). Las expresiones de ciclina A, B1 y CDK2 fueron significativamente las reguladas en las células SW1990, detenido en la fase G2 /M (Fig. 4). También se encontró que CDK2 se redujo significativamente en las líneas celulares. Este resultado concuerda con la idea de que la CDK2 tiene una función distinta y esencial en el ciclo celular de los mamíferos, y su mutación o la inhibición provoca un bloque de fase G1 [18].
se informa de la activación de genes que llevan CRE que se produzca por la fosforilación de CREB en Ser 133 y la unión a secuencias de consenso de CRE en la región promotora de genes [19], [20]. picos de fosforilación de CREB durante la transición G1-S y luego disminuye gradualmente desde la fase S a la fase M [21]. En combinación con nuestros informes anteriores resultados [4] - [6], [9], es lógico plantear la hipótesis de que los genes de proliferación celular, que lleva el sitio de CRE, se unen a CREB y afectar su nivel de fosforilación, lo que interfiere con la división celular
CRE localiza aguas arriba del mRNA sitios de inicio. Tiene un papel clave en la ciclina A [22], [23] y D1 [24], [25] la expresión a través de la activación de CREB [26] - [28]. Un estudio previo mostró que la asociación de CREB con quinasa relacionada con vaccinia-1 (VRK1) se produjo de una manera por células dependiente del ciclo desde finales de G1 a la fase S. Además, VRK1 mejora específicamente la actividad de CRE en promotor de ciclina D1, facilitando el reclutamiento de CREB fosforilado a este locus [29]. Giampuzzi et al también encontró que una disminución significativa de la proteína CREB vinculante para el promotor de ciclina D1 condujo a una inhibición dramática de expresión de la proteína ciclina D1 en la lisil oxidasa (LOX) células -up regulados [30]. Este fenómeno también se confirmó en células de fibroblastos [31], célula endometrial [32], INS celular [33], células de hepatocitos [34] y otras líneas de células [21], [35], [36]. Además, un número de observaciones sugiere ciclina A desempeña un papel fundamental en la transición /M en células de mamífero S y G2 y este papel es consistente con su asociación preferencial con CDK2, en lugar de CDC2, durante la fase S [37], [38] . CRE se confirmó que se requiere para la activación eficaz del promotor de la ciclina A en células de músculo liso de aorta [39], células de fibroblastos [40] y las células de carcinoma embrionario humanos [22]. El presente estudio muestra claramente que el tratamiento combinado de TCS y CRE atenuó la disminución de la ciclina A y la expresión D1, invirtiendo de esta manera el efecto de TCS en la detención del ciclo celular. Por lo tanto, se sugiere que el factor de transcripción CREB es uno de los reguladores de aguas arriba de la detención del ciclo celular inducida por TCS en las células cancerosas.
Conclusión
Nuestros resultados muestran, por primera vez, que induce TCS detenciones del ciclo celular específicos en las células cancerosas mediante la inhibición de la unión de CREB al CRE en genes relacionados con la proliferación celular.