Extracto
La evidencia reciente ha sugerido que los activadores de AMPK se pueden aplicar como fármacos terapéuticos para suprimir el crecimiento de células cancerosas . Sin embargo, el mecanismo molecular de su función de supresión en las células cancerosas todavía no está claro. Aquí mostramos que los activadores de AMPK afectar el crecimiento de células de cáncer cervical mediante la reducción de DVL3, un regulador positivo en la señalización de Wnt /β-catenina y un reproductor de oncogénica en la tumorigénesis del cáncer cervical. Por Western blot y análisis de inmunohistoquímica, hemos demostrado que con frecuencia se DVL3 upregulated y se asocia con niveles elevados de β-catenina (
P
= 0,009) y CyclinD1 (
P = 0,009)
expresiones en cáncer de cuello uterino significativamente . la expresión forzada de DVL3 elevado β-catenina y aumenta el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino, la verificación de que la activación mediada por DVL3 /β-catenina Wnt está implicada en la oncogénesis del cáncer de cuello uterino. En el otro aspecto, hemos observado que el crecimiento de células de cáncer cervical fue notablemente suprimida por activadores de AMPK y tal inhibición del crecimiento celular estaba en concomitante con la reducción del nivel de proteína DVL3 de maneras dosis y dependientes del tiempo. Además, alteración de la actividad de señalización mTOR también redujo la expresión DVL3. Por el contrario, co-tratamiento con el Compuesto C (inhibidor de AMPK) podría derogar significativamente reducción DVL3 metformina inducida. Además, co-tratamiento con AM114 o MG132 (inhibidores proteosomal) podría restaurar parcialmente expresión DVL3 bajo el tratamiento de metformina. Más
in vivo
ensayo de ubiquitinación en revelaron que la metformina podría reducir DVL3 por la degradación de ubiquitina /proteasoma. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que muestra los mecanismos moleculares probables de que los activadores de AMPK suprimen el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino al dañar la síntesis de proteínas DVL3 través de la señalización de AMPK /mTOR y /o parcialmente promoviendo la degradación proteasomal de DVL3.
Visto: HT Kwan, Chan DW, Cai PCH, Mak CSL, Yung MMH, Leung THY, et al. (2013) AMPK Activadores suprimir el cáncer de cuello uterino crecimiento celular mediante la inhibición de DVL3 mediada por Wnt /β-catenina actividad. PLoS ONE 8 (1): e53597. doi: 10.1371 /journal.pone.0053597
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 22 Agosto, 2012; Aceptado: noviembre 30, 2012; Publicado: 2 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Kwan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Wong Verificar Ella Fundación de Caridad. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es uno de los cánceres ginecológicos más comunes en todo el mundo. Hasta la fecha, la causa más conocida de cáncer de cuello uterino es la infección por el virus del papiloma humano (VPH). La infección persistente por VPH promueve el desarrollo de lesiones precancerosas con el cáncer cervical [1]. Sin embargo, la infección por VPH por sí sola no es suficiente para transformar células huésped epiteliales a células cancerosas. Por lo tanto, otros factores, tales como la regulación de los oncogenes y la activación aberrante de las vías de señalización relacionadas, pueden estar implicados en la carcinogénesis cervical [2]. evidencias recientes han demostrado que la activación aberrante de la señalización /β-catenina Wnt está implicada de manera crucial en el desarrollo del cáncer [3], [4], [5]. La acumulación de β-catenina es el sello en la causa de la activación aberrante de la señalización /β-catenina Wnt que está estrechamente asociada a la carcinogénesis de cuello uterino [6], [7], [8], [9], y en particular en invasivo carcinomas cervicales [10]. Por lo tanto, la orientación esta vía puede ser un enfoque prometedor en la terapia molecular de esta enfermedad
.
AMP-activated proteína quinasa (AMPK) es un regulador maestro de sistema de energía celular [11]. actividad AMPK activado deteriora la diana de rapamicina en células de mamífero (mTOR) de señalización y su correspondiente p70S6 quinasa y la actividad de 4E-BP1 [12], lo cual inhibe la síntesis de proteínas [13], [14] y el crecimiento celular. Por lo tanto, no es sorprendente que la actividad de AMPK bajo favorece la carcinogénesis [15], [16]. Con este fin, numerosos activadores de AMPK farmacéuticos tales como A23187, A769662, 5-aminoimidazol-4-carboxamideribonucleoside (AICAR) y metformina han sido recientemente demostrado que ejercen efectos antitumorales en numerosos cánceres humanos [17], [18], [19 ], [20], [21], [22], [23]. En particular, la metformina se ha utilizado en varios ensayos clínicos en curso [24], [25], [26], [27]. Sin embargo, los mecanismos moleculares de los efectos antitumorales de estos activadores AMPK aún no han sido claramente dilucidado.
En este estudio, mostramos que DVL3 se reguló de manera significativa y se correlacionó con la actividad /β-catenina vía de cáncer de cuello uterino. Más importante aún, somos los primeros en proporcionar evidencia de que los activadores de AMPK inhiben el crecimiento de células de cáncer cervical a través de menoscabar la señalización /β-catenina vía mediada por DVL3 en células de cáncer de cuello uterino. Hemos demostrado que la inhibición de la síntesis de la proteína AMPK /mTOR mediada y el aumento de la degradación proteasomal fueron los mecanismos moleculares en la reducción de DVL3 exhibida por los activadores de AMPK. Nuestros resultados implican la importancia de la oncogénesis DVL3 en cáncer de cuello uterino y poner de relieve el valor terapéutico de la orientación DVL3 por activadores de AMPK en el tratamiento del cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Cinco líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa, SiHa, C33A, CaSki y C41) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) (autenticación líneas celulares se realizó mediante análisis de STR perfiles de ADN en-casa) y dos líneas de células epiteliales cervicales inmortalizadas ( NC104 y NC105) [6] (regalo del Prof. George. Tsao, Departamento de Anatomía de la Universidad de Hong Kong) se utilizaron en este estudio. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO2 en medio esencial mínimo o medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg) con 10% de suero bovino fetal (Gibco) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco).
plásmidos y transfección de células
se utilizó el-DVL3 GFP-etiquetados construcción que expresa para expresión de la proteína GFP /DVL3 [28], mientras que el plásmido pEGFP-C1 se utilizó como control negativo. El pCMV2-Flag /DVL3 se utilizó para el ensayo indicador de luciferasa TOP /FOP, mientras que ambos constructos pSuper8XFOPFlash pSuper8XTOPFlash y fueron amablemente proporcionados por el Dr. R. Luna (Universidad de Washington, Washington, EE.UU.). LipofectAMINE
TM 200 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) se utilizó para la transfección de células de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para el establecimiento de GFP-DVL3 expresan de forma estable células, se seleccionaron las células transfectadas con G418 durante 2 semanas y verificados por Western blot.
extracción de RNA y cuantitativa la transcriptasa inversa-PCR
El ARN total se extraída por el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ADN complementario se sintetizó usando el kit de reactivo de la transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City). La expresión de
DVL3
se evaluó por cuantitativos de la transcriptasa-PCR (q-PCR) en un sistema ABI PRISM ™ 7500 (Applied Biosystems) utilizando Taqman® Gene ensayos de expresión inversa; humana
DVL3 gratis (ensayo ID: Hs00610263_m1). El humano
18S rRNA gratis (ensayo ID: Hs99999901_m1) se utilizó como control interno
extracción de proteínas, Western Blot e inmunohistoquímica (IHC) analiza
se extrajo
lisado de proteínas. por lisis de las células de pellets con tampón de lisis 1X (10X tampón de lisis (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.), 1:100 PMSF, inhibidor de la proteasa y el agua destilada). Para el análisis de transferencia Western, las muestras que contienen una cantidad fija de proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y electrotransferencia a las membranas Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, EE.UU.). Membranas fueron borrados con 5% de leche desnatada durante 30 minutos y se incubaron con anticuerpos primarios; anti-pp70S6kinase, anti-p70S6 quinasa, anti-pAMPKα, anti-AMPKα, anti-CyclinD1 (Cell tecnología de señalización), anti-DVL1, anti-DVL2, anti-DVL3, anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , EE.UU.) y anti-β-catenina (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. Se utilizó anti-ratón o anti-conejo anticuerpo secundario conjugado con peróxido de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, OH) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham). Para el análisis inmunohistoquímico, matriz de tejido de cáncer cervical (CXC1021) (5 casos de cuello uterino /cervicitis normales y 97 los casos de cáncer de cuello uterino) (Pantomics Inc, CA, EE.UU.) se utilizó para la tinción inmunohistoquímica para DVL3, β-catenina y CyclinD1. Las secciones se immunostained con primaria anti-DVL3 (1:200 dilución) (NB110-59941, Novus Productos Biológicos, Littleton, CA, EE.UU.), anti-β-catenina (BD Biosciences) (1:200 dilución) y anti-CyclinD1 (1 :100 dilución) (H-295, Santa Cruz Biotehcnology). La incubación con solución salina tamponada con Tris se utilizó como controles negativos. Sus niveles de expresión se obtuvieron manualmente multiplicando el porcentaje de la proporción de área de la tinción immunopositive (0-100%) y la intensidad de la tinción (1, débil; 2, moderado; 3, intenso; y 4, muy intenso ). El factor de cambio de cada gen se calculó dividiendo su nivel de expresión de cada muestra de cáncer por el valor medio de su nivel de expresión de cuello uterino /cervicitis normal. El punto de corte (número de pliegues) de cada gen se determinó a continuación por sus niveles de expresión y la significación estadística. Todo sección de tejido fueron examinados y marcó de forma independiente por dos investigadores.
luciferasa reportero de ensayo
HEK293 células fueron transfectadas transitoriamente con 0, 50, 100, y 200 ng de pCMV2-Flag /DVL3 así ya sea como un pSuper8XTOPFlash o pSuper8XFOPFlash constructo informador de luciferasa. Todas las transfecciones se normalizaron con vector pcDNA3.1 (+). La actividad luciferasa se determinó utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). Las eficacias de transfección se normalizaron con la actividad de la luciferasa
Renilla
. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y en 3 experimentos independientes.
En Vivo
Ubiquitination Ensayo
El procedimiento se describe anteriormente [29]. Brevemente, se sembraron células C33A o Hela en placas de 100 mm de cultivo. El pcDNA-HA (Ub)
8 fue transitoria transfectadas en los tipos de células anteriores usando respectivamente Lipofeactamin kit de transfección 2000 (Invitrogen). El lisado celular se cosechó mediante el uso de tampón de lisis NET (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y EDTA 5 mM) con 1% de NP40, pH 8,0, PMSF 0,1 mM, y 1 mM completa cóctel TM inhibidor de la proteasa (Roche)) en el sedimento celular. Un mg de lisado celular se incubó con 1 g de ratón anti-IgG y anti-DVL3 (Santa Cruz) a 4 ° C. Después de la incubación, se añadieron 40 l de proteína A /G Plus perlas de agarosa (Santa Cruz) a cada muestra y se mezclaron por rotación durante la noche a 4 ° C. Después de la centrifugación, las perlas se lavaron cuatro veces con tampón de lisis NET, seguido de la adición de tampón de muestra que contenía DTT y se hierve durante 10 min antes de la electroforesis. Los inhibidores del proteasoma MG132, y AM114, se obtuvieron de Calbiochem (La Jolla, CA).
viabilidad de las células de ensayo
kit de proliferación celular (XTT) (Roche) se utilizó para medir la viabilidad celular para 5 días de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado.
ensayo clonogénico
Las células se dejaron crecer durante 2 semanas. Después de 2 semanas, se retiró el medio seguido de incubación con metanol durante 30 minutos y luego se tiñeron con cristal violeta durante 1 hora. Después de la tinción, las células se lavaron con PBS. Triplicación de cada muestra y tres experimentos independientes se realizaron y el número de células se contó por el sistema Gel-Doc.
análisis de los datos
de la t de Student (para datos paramétricos) y el de Mann- Whitney (para datos no paramétricos) se utilizaron para el análisis. El análisis clínico-patológica entre la expresión de DVL3, β-catenina, CyclinD1 y los parámetros clínicos se analizó mediante la prueba de tablas de contingencia y Pearson chi-cuadrado utilizando el software SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL). Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar. Un
P
-valor inferior a 0,05 fue considerado como significativo.
Resultados
DVL3 está regulada positivamente con frecuencia en células de cáncer cervical
evidencias emergentes han demostrado DVLs que son capaces de regular hasta-β-catenina y promover el crecimiento celular en el cáncer colorrectal [30], el mesotelioma pleural maligno [31] y el cáncer de pulmón no de células pequeñas [32], etc. lo tanto, examinar el patrón de expresión de DVLs ( DVL1, DVL2 y DVL3) en líneas celulares de cáncer de cuello uterino por Western blot. Nuestros datos demuestran que DVL3 pero tampoco DVL1 ni DVL2 fue significativamente hasta reguladas en un panel de líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa, SiHa, CaSki, C33A y C41), en comparación con las líneas de células del cuello uterino inmortalizadas (NC104 y NC 105) (Figura 1A ), lo que sugiere que DVL3 es upregulated predominantemente en células de cáncer de cuello uterino. A continuación examinó el nivel de mRNA de
DVL3
en estas líneas celulares en tiempo real de la transcripción inversa cuantitativa PCR (Q-PCR). Del mismo modo, la
DVL3
niveles de mRNA fueron significativamente mayores en líneas celulares de cáncer de cuello uterino en comparación con las líneas normales inmortalizadas cuello uterino de células (Figura 1B). En conjunto, estos hallazgos indican que DVL3 es la principal isoforma de DVLs con frecuencia hasta reguladas en las células de cáncer de cuello uterino.
(A) Western blot mostró que sólo el nivel de DVL3 pero no DVL1 y DVL2 fue significativamente arriba regulado en líneas celulares de cáncer de cuello uterino en comparación con las líneas celulares de cuello uterino normal. (B) en tiempo real Q-PCR reveló el ARNm de
DVL3
obviamente era mayor entre las líneas celulares de cáncer de cuello uterino, en comparación con las líneas de células de cuello uterino normal. El valor de NC105 se utilizó para normalizar otras líneas celulares. (C) El análisis inmunohistoquímico mostró que tanto DVL3 y β-catenina se upregulated en tejidos de cáncer de cuello uterino, en comparación con las muestras normales del cuello uterino. DVL3 se distribuye en la región citoplasmática, mientras que β-catenina se encuentra tanto en el citoplasmática y regiones nucleares. (Ampliación: 20x) ensayo (D) reportero de luciferasa reveló que la transfección transitoria del plásmido que expresa DVL3 podría aumentar β-catenina actividad transcripcional en células HEK293
La sobreexpresión de DVL3 y β-catenina en el cáncer de cuello uterino.
Para estudiar el significado de DVL3 y β-catenina en cáncer de cuello uterino, se examinaron las expresiones de DVL3 y β-catenina en una matriz de tejido de cáncer de cuello uterino (CX1021) utilizando análisis inmunohistoquímico (IHC). La inmunorreactividad de DVL3 sólo se observó en el citoplasma mientras que β-catenina localizada en ambos núcleos y regiones citoplasmáticas de tanto las células cancerosas normales y de cuello uterino (Figura 1C). análisis IHC mostró que se observaron notables aumento de expresiones de DVL3 y β-catenina en las secciones del tumor de cuello uterino, en comparación con las secciones de cuello uterino normal (Tablas 1 y 2). El análisis estadístico mostró que la alta expresión de DVL3 (rango & gt; 5 pliegues) se correlacionó significativamente con alto nivel de β-catenina (rango & gt; 7 pliegues, p = 0,009) (tabla 1). Sin embargo, no hubo una asociación significativa entre la expresión DVL3 y otros parámetros clínicos, tales como estadios tumorales (
P = 0,369)
, clasificación (
P = 0,658
), metástasis (
P
= 0,243), β-catenina (
P
= 0,009) y CyclinD1 (
P
= 0,009). Por otra parte, la sobre regulación de β-catenina (rango & gt; 7 pliegues) se asoció significativamente con tumores de alto grado (
P = 0,049
) y la sobre-expresión de CyclinD1 (
P
= 0,009), pero no hubo correlación significativa con las fases del tumor (
P = 0,189)
y la metástasis (
P = 0,345
) (Tabla 2). Tomados en conjunto, estos resultados indican que el aumento de la expresión de DVL3 se correlaciona con la β-catenina que está implicado en el desarrollo del cáncer de cuello uterino.
DVL3 aumenta la proliferación de células de cáncer cervical
DVLs son importantes moléculas de transducción de señales que median la actividad de señalización /β-catenina vía para controlar el crecimiento celular. Para resolver si DVL3 podría promover la actividad de señalización Wnt /β-catenina, se realizó el ensayo de indicador de luciferasa dual. Transfección de plásmido DVL3 expresan en células HEK293 aumentó β-catenina actividad transcripcional de una manera dependiente de la dosis (Figura 1D), lo que sugiere que DVL3 es un regulador positivo de la Wnt /cascada de señalización β-catenina. A continuación, para investigar si DVL3 promueve la proliferación celular a través de la activación de la vía Wnt /β-catenina en el cáncer de cuello de útero, dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino (C33A y SiHa) de forma estable con la expresión de DVL3 se establecieron utilizando DVL3 plásmido que expresan GFP-etiquetados humanos. El análisis de transferencia Western reveló que β-catenina fue significativamente elevado en GFP-DVL3 clones estables en C33A (C-G25 y C-G28) y SiHa (S-G18 y S-G-20) (Figura 2A). Funcionalmente, ensayo de proliferación celular XTT reveló que la expresión ectópica de DVL3 mejora de forma significativa la proliferación celular en GFP-DVL3 clones estables de SiHa (
P Hotel & lt; 0,05) y C33A (
P Hotel & lt; 0,001) células (Figura 2B). Además, ensayo clonogénico reveló que había 2-3 veces mayor en el número de colonias en las células SiHa de forma estable que expresan GFP-DVL3 (S-G18 y S-G20) (
P
& lt; 0,05) y C33A (células C-G25-G28 y C) (
P Hotel & lt; 0,05), respectivamente, en comparación con sus controles de vectores (Figura 2C). En conjunto, estos hallazgos sugieren que DVL3 aumenta la actividad de la señalización de Wnt /β-catenina y promueve la proliferación de células de cáncer cervical.
(A) de transferencia de Western mostró que de manera estable sobre-expresión de GFP-DVL3 elevada expresión de β-catenina en C33A (C-G25-G28 y C) y SiHa (S-G18 y G20-S). ensayo (B) XTT reveló un aumento significativo de la proliferación celular en células de cáncer cervical con la expresión estable de GFP-DVL3 (C-G24 y C-G28;
P
& lt; 0,05) (S-G18 y S- G-20;
P Hotel & lt; 0,05). (C) ensayo clonogénico mostró que dos veces y tres veces se encontró que el número de colonias en GFP-DVL3 ectópica expresando células C33A (C-G25 y C-G28) (
P
& lt; 0,05) y células SiHa (S -G18 y S-G20) (
P Hotel & lt; 0,05) en comparación con sus controles de vectores
activadores AMPK reducen DVL3 en células de cáncer de cuello uterino
Numerosas. estudios han demostrado que los activadores de AMPK pueden inhibir el crecimiento celular en el cáncer, particularmente en el cáncer cervical
in vitro
[21], [33], [34]. Por lo tanto, se examinó el efecto de los activadores de AMPK en la expresión de su actividad de señalización Wnt /β-catenina relacionada DVL3 y en células de cáncer de cuello uterino. AICAR tratamiento resultó en una reducción significativa de los niveles DVL3 en tres líneas celulares de cáncer de cuello uterino (Figura 3A). Otro activador de AMPK, A23187, activa AMPK a través de su quinasa aguas arriba (CaMKK) al aumentar el nivel de calcio citosólico [20], la expresión DVL3 también reducida en las células C33A y SiHa de una manera dependiente de la dosis (Figura 3C). Con el fin de evaluar adicionalmente el efecto de A23187 en la expresión DVL3, C33A y CaSki fueron tratadas con 1,25 M A23187 y se recogieron a diferentes puntos de tiempo. se observó disminución de DVL3 después de 10 y 12 horas en C33A y CaSki, respectivamente, y no se observó DVL3 después de 12 y 24 horas para las dos líneas celulares (Figura 3D). A fin de evaluar si la reducción de DVL3 mediada por activadores de AMPK es un proceso universal, dos conocidos activadores de AMPK, A769662 y metformina, se utilizaron. A769662 es un thienopyridone que activa AMPK a través de la interacción con el α- y β-subunidad de la AMPK. Al A769662 tratamiento, la expresión DVL3 fue abolida en una forma dependiente de la dosis en SiHa y C33A (Figura 3B). Además, la metformina es un activador de AMPK muy común, así como un potencial medicamento contra el cáncer [22]. Tras el tratamiento de la metformina, varias líneas celulares de cáncer de cuello uterino muestran respuestas diferenciales a la metformina y mostraron agotamiento de DVL3 de una manera dependiente de la dosis (Figura 3E), junto con ningún cambio en el nivel de mRNA de
DVL3
en C33A y HeLa (Figura 4A), lo que sugiere que la reducción de DVL3 regulada por activadores AMPK estaba asociada con eventos post-transcripcionales. Tomados en conjunto, estos datos implican que los activadores de AMPK pueden reducir DVL3 y este efecto es un proceso universal.
(A) Tras el tratamiento de AICAR, se observó una reducción de aproximadamente el 80% del nivel de DVL3 entre C33A, C41 y CaSki. (B) Tras el tratamiento de A769662 a diferentes dosis (0, 50 y 100 mM), una reducción -100% 20-30% y 80% de DVL3 en SiHa y C33A pudieron observarse respectivamente. (C) tras el tratamiento con A23187 a diferentes dosis (0, 1,25 y 2,5 M) durante veinte horas, las células C33A y SiHa mostró una reducción del 80-90% de la expresión DVL3 de una manera dependiente de la dosis. (D) En el tratamiento de 1,25 M A23187, la disminución de DVL3 pudo observarse al cabo de 10 y 12 horas en C33A y CaSki, respectivamente, mientras que se observó una reducción adicional del 100% de DVL3 a las 12 y 24 horas para las dos líneas celulares. (E) En el tratamiento de la metformina, se observó una reducción del 60-80% de DVL3 en Hela, SiHa, CaSki, C41 y C33A de una manera dependiente de la dosis.
(A) q- en tiempo real análisis PCR demostrado que la metformina no tuvo ningún efecto sobre la expresión de
DVL3
la expresión de ARNm en las células C33A y HeLa. (B) Análisis de transferencia Western reveló que el compuesto C podría disminuir el decremento de DVL3 mediada por la metformina. (C) XTT ensayo de proliferación celular mostró una reducción significativa de la proliferación celular en C33A (
P
& gt; 0,001), SiHa (
P
& gt; 0,001) y las células HeLa (
P
& gt; 0,001) tratados con metformina en una forma dependiente de la dosis. (D) ensayo clonogénico mostró una notable reducción del número de colonias formadas en HeLa y C33A tratados con metformina en una forma dependiente de la dosis.
activación AMPK es crucial para la reducción de DVL3 mediada por AMPK activadores
a pesar de la importante función de los activadores de AMPK es activar la actividad de AMPK, numerosos estudios han evidenciado que algunos activadores AMPK pueden ejercer efectos fuera de la meta [35], [36]. Por lo tanto, es de interés para examinar si activadores AMPK reducción mediada de DVL3 depende únicamente de actividad de señalización AMPK. Se utilizó un inhibidor de la AMPK potente, el compuesto C, para contrarrestar el efecto de la metformina sobre la activación de AMPK. Consistentemente, se observó una reducción de DVL3 después del tratamiento de la metformina en C33A y SiHa (Figura 4B), sin embargo, la disminución de DVL3 se suprime con la adición de compuesto C. (Figura 4B). Estos datos sugieren que la reducción de DVL3 mediada por la metformina es principalmente a través de actividad de señalización AMPK.
activadores AMPK alteran la proliferación de células de cáncer cervical mediante la reducción de la actividad /β-señalización Wnt y DVL3
Tenemos demostró que la expresión ectópica de DVL3 podría mejorar la proliferación celular en células de cáncer cervical. Por lo tanto, para obtener una mayor comprensión de la función de DVL3 empobrecido en minimizar Wnt /β-catenina de señalización y la proliferación celular mediada por los activadores de AMPK, las células C33A, SiHa y HeLa fueron tratados con metformina y sus tasas de proliferación fueron examinados mediante el ensayo XTT. Nuestros resultados demuestran que la metformina reprimió significativamente la proliferación celular en C33A (
P Hotel & gt; 0,001), SiHa (
P Hotel & gt; 0,001) y las células HeLa (
P Hotel & gt; 0,001) (Figura 4C). Además, ensayo clonogénico también reveló que el número de colonias se redujo en un 20 y 50% en C33A y células HeLa, respectivamente (Figura 4D). Estos resultados manifiestan que la inhibición del crecimiento de células de cáncer cervical por activadores AMPK se atribuye a la reducción de DVL3.
AMPK actividad /mTOR es esencial para el agotamiento de DVL3
activadores AMPK son capaces de activar AMPK y modular su cascada aguas abajo, tales como el control de la traducción de la síntesis de proteínas a través de la inhibición de mTOR vía [12], [13], [14]. Por lo tanto, razonó el bloqueo de la actividad /mTOR AMPK puede imitar los efectos de los activadores de AMPK en la disminución de DVL3. Se empleó un inhibidor de mTOR (rapamicina) para inhibir la actividad de mTOR. La rapamicina inhibe la actividad quinasa de mTOR para inactivar p70s6k, la consecuente eliminación de cierta traducción de la proteína [37]. Tras el tratamiento de la rapamicina, DVL3 se redujo en líneas celulares de cáncer de cuello uterino (C33A, C41, CaSki, HeLa y SiHa) de una manera dependiente de la dosis. Además, se observó la inactivación de p70S6K en concomitante con la reducción de DVL3 en células HeLa y SiHa tratadas con 1 nM de rapamicina (Figura 5A). En conjunto, la reducción de la síntesis de proteínas podría reducir la expresión DVL3 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino y que la disminución de DVL3 mediada por activadores AMPK es principalmente a través de la cascada de señalización AMPK /mTOR.
(A) La rapamicina inactivado p70S6 quinasa actividad y la síntesis de proteínas abortado de DVL3 en todas las líneas celulares de cáncer de cuello uterino (C33A, C41, CaSki, HeLa y SiHa) de una manera dependiente de la dosis. (B) inhibidor Proteasomal, AM114, restauró la DVL3 reducida mediada por la metformina en C33A. (C) inhibidor Proteasomal, AM114, no pudo restaurar la DVL3 reducida mediada por la metformina en SiHa y HeLa. (D)
En vivo
ensayo mostró que la ubiquitinación DVL3 se degradó como proteína DVL3 poli-ubiquitinated ((Ub) n-DVL3) en el modelo de células C33A. C33A células fueron transfectadas con pcDNA-HA (Ub)
8 plásmido. Tanto MG132 o AM114 y metformina se utilizaron para mejorar la cantidad de productos de proteína DVL3 polyubiquitinated ((UB) n-DVL3). Los lisados celulares se incubaron con anti-DVL3, y los inmunoprecipitados se sondearon con anticuerpos anti-HA. La misma membrana se volvieron a sondar con anti-DVL3 para detectar la expresión de DVL3.
activadores AMPK también promueven la degradación proteasomal de DVL3
Varias líneas de evidencia han demostrado que son DVLs estrechamente regulada por mecanismos de degradación proteasomal en el que la pérdida de factores implicados en las vías de ubiquitinación conduce a la acumulación de DVLs [28], [38]. Así, razonó que la degradación proteasomal podría servir como un mecanismo alternativo atribuido a los activadores de AMPK mediada por la reducción DVL3. Utilizamos AM114, un inhibidor de proteasoma, para suprimir la ubiquitina /proteasoma degradación. Al co-tratamiento con AM114 y metformina, se observó la expresión DVL3 restaurada en C33A pero no en SiHa y células HeLa (Figura 5B y 5C). El
in vivo
ensayo de ubiquitinación en demostró además que DVL3 en las células C33A podría degradarse a través de la vía ubiquitina /proteasoma porque se observó la formación de productos ubiquitina-DVL3 tras el tratamiento de metformina y tales productos ubiquitina-DVL3 se mejoraron aún más cuando co-tratamiento con AM114 o MG132 (Figura 5D). Estos datos indican que la degradación proteasomal también juega un papel en la reducción de DVL3 mediada por activadores AMPK.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que DVL3 era aberrante sobre-expresó y significativamente correlacionado con el aumento β-catenina en el cáncer cervical. Nuestros datos también demostraron que DVL3 podría promover el crecimiento del cáncer de cuello de útero a través de la activación de la vía de señalización de Wnt /β-catenina. Más importante aún, hemos abordado el uso potencial de activadores de AMPK en la reducción de DVL3 y por lo tanto inhibir el crecimiento de células de cáncer cervical. Además, este es el primer informe que muestra los posibles mecanismos moleculares de cómo los activadores de AMPK afectar el crecimiento de células de cáncer de cuello de útero a través de la diafonía entre AMPK y la señalización Wnt /β-catenina.
activación aberrante de la señalización /β-catenina Wnt vía ha sido documentada en diversos cánceres humanos incluyendo el cáncer cervical [39]. De hecho, las evidencias de montaje han demostrado que DVLs que son reguladores positivos de la ruta de señalización /β-catenina Wnt son frecuentemente upregulated en una variedad de cánceres humanos [32], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Los DVLs sobreexpresados están estrechamente asociados con el aumento de la actividad /β-catenina en los cánceres humanos [31], [32], [47]. Sin embargo, se sabe muy poco sobre el papel funcional de DVLs en el cáncer de cuello uterino. En este documento, se observó que DVL3, pero tampoco DVL1 ni DVL2, fue significativamente hasta reguladas y asociada con la actividad de señalización Wnt /β-catenina aumentada y el crecimiento de células de cáncer cervical.
Numerosos estudios han informado de que las quinasas aguas arriba de AMPK, como LKB1, es frecuentemente mutado y borrado en pulmón, cáncer de mama y especialmente de cuello uterino [21], [48], [49], lo que reduce las actividades de AMPK para el crecimiento de células de cáncer. De hecho, la actividad baja de la AMPK es un evento común que favorece el crecimiento de células de cáncer [15], [16]. Por lo tanto, la AMPK es un objetivo crucial en la terapia del cáncer. Nosotros y otros grupos han demostrado previamente que varios activadores AMPK podría suprimir el crecimiento de células de cáncer [21], [22], [50]. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la represión permanecen en gran parte sin explorar. Anteriormente, el grupo de Kohno mostró que la metformina reduce el nivel de proteína de β-catenina a través de la regulación de su fosforilación dependiente de la degradación de [51]. Esto nos dio una pista de que la metformina puede regular los reguladores de aguas arriba de la Wnt /cascada de señalización β-catenina. En este documento, hemos demostrado que la notable reducción de DVL3 podría ser inducida por múltiples activadores de AMPK, lo que sugiere que los activadores de AMPK universalmente reducen DVL3. De acuerdo con informes anteriores sobre el efecto antitumoral de la metformina a través del nivel CyclinD1 en el cáncer de próstata y cáncer de mama [52], la regulación de abajo-[53], la reducción de la expresión DVL3 es también en simultáneo con los niveles disminuidos de β- catenina y su diana aguas abajo, CyclinD1, que es responsable del control del ciclo celular. Sorprendentemente, la metformina sólo afecta el nivel de proteína de DVL3 pero no su ARNm, lo que indica que la regulación de DVL3 mediada por los activadores de AMPK se basa en la modificación post-transcripcional.
Como múltiples activadores AMPK podría reducir DVL3, especuló que la AMPK la actividad es esencial en dicha regulación. Con el fin de probar si activadores AMPK ejercen sus efectos sobre DVL3 través de la activación de AMPK, un inhibidor de la AMPK, compuesto C, se co-tratado con metformina en células de cáncer cervical para contrarrestar el efecto de la activación de AMPK. Como era de esperar, el compuesto C disminuyó la función de la metformina en la atenuación de la expresión DVL3. Estos resultados manifiestan que los activadores de AMPK podría reducir DVL3 través de la modulación de la actividad de la AMPK, y este efecto no se derive de funciones fuera del objetivo de AMPK activadores '. De hecho,
in vitro los ensayos de proliferación de células
también revelaron que el uso de activadores de AMPK (por ejemplo, metformina) podría reducir la proliferación celular. Proporcionamos evidencia sólida de que los activadores de AMPK, especialmente la metformina, ejercen un efecto de regulación hacia abajo en DVL3 y por lo tanto reducir los niveles de expresión de β-catenina y CyclinD1, y en última instancia atenúan la proliferación celular. Más importante aún, somos los primeros en demostrar que los activadores de AMPK ejercen su efecto antiproliferativo a través de la reducción de actividad de señalización de Wnt /β-catenina y DVL3. activación de la AMPK juega un papel necesario en la supresión de desarrollo de tumores en el cáncer cervical.