cervical
Extracto
El inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 3 gen (
CDKN3
), que participan en la mitosis, es aumentada en el cáncer cervical (CC). Investigamos
CDKN3
ARNm como un biomarcador de la supervivencia y el potencial diana terapéutica para CC.
CDKN3
ARNm se midió en 134 cc y 25 controles mediante PCR cuantitativa. Un estudio de supervivencia a 5 años se llevó a cabo en 121 de estos pacientes CC. Por otra parte,
CDKN3
siRNAs específicos de investigación para investigar si
CDKN3
está implicado en la proliferación, la migración y la invasión en líneas celulares de cáncer cervical derivados (SiHa, CaSki, HeLa).
CDKN3
mRNA fue en promedio 6,4 veces mayor en los tumores que en los controles (p = 8 x 10
-6, Mann-Whitney). Un total de 68,2% de los pacientes que sobreexpresan CC
CDKN3
gen (doble cambio ≥ 17) murió a los dos años del diagnóstico, independientemente de la etapa y el VPH tipo clínico (cociente de riesgos = 5,0; IC del 95%: 2,5 -10, p = 3,3 x 10
-6, Cox de riesgos proporcionales de regresión). En contraste, sólo el 19,2% de los pacientes con menor
CDKN3
expresión murió en el mismo período. En la inactivación in vitro de
CDKN3
disminución de la proliferación celular, en promedio, 67%, aunque no tuvo ningún efecto sobre la migración celular y la invasión.
CDKN3
ARNm puede ser un buen marcador biológico de supervivencia y el potencial diana terapéutica en CC
Visto:. Barrón EV, Romano-Bassaure E, Sánchez-Sandoval AL, AM Espinosa, Guardado-Estrada M, Medina I, et al. (2015)
CDKN3
ARNm como un biomarcador para la supervivencia y la diana terapéutica en el cáncer cervical. PLoS ONE 10 (9): e0137397. doi: 10.1371 /journal.pone.0137397
Editor: Zhi-Ming Zheng, Instituto Nacional de Salud Nacional-Cancer Institute, Estados Unidos |
Recibido: 18 de diciembre de 2014; Aceptado: August 17, 2015; Publicado: 15 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Barrón et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, www.conacyt.mx), números de concesión 8135 /A1, 24341 (a JB ), Universidad Nacional de México (www.unam.mx), el número de concesión SDI.PTID.05.2 (JB), y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, www.conacyt.mx), beca (para EVB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : CC, el cáncer de cuello uterino; HPV, virus del papiloma humano; CDKN3, dependiente de ciclina inhibidor de quinasa 3; FIGO, la Federación Internacional de Ginecología Obstetrique; GAPDH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; RT-qPCR, PCR cuantitativa retro-transcripción; FC, el cambio veces; ROC, Receiver Operator característico; MW, prueba de Mann-Whitney; HR, Hazard ratio
Introducción
El cáncer cervical (CC) es el cuarto cáncer más común en las mujeres en todo el mundo [1]. Cada año se registran 530.000 nuevos casos, lo que es la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres de los países en desarrollo [2, 3]. Virus del papiloma humano (VPH) está presente en casi el 100% de los pacientes de CAC y se considera la causa principal para el desarrollo de CC. En todo el mundo, el HPV 16 es el tipo más frecuentemente detectado viral en CC, que se encuentra en aproximadamente el 50% de los casos, seguido de HPV 18 (15%) [4, 5]. Las vacunas utilizadas actualmente son muy eficaces en la prevención de las infecciones por VPH tipos 16 y 18. También previenen el desarrollo de alto grado neoplasia intraepitelial cervical asociados con estos virus [6, 7]. Sin embargo, puesto que estas vacunas sólo ofrecen protección contra algunos virus y la duración de la respuesta inmune es desconocido, se recomienda que las mujeres vacunadas siguen siendo inscritos en programas de detección precoz de CC [8, 9]. En muchos países, estas vacunas se han incorporado en los programas de vacunación para niñas de 9-12 años [10, 11]. A pesar de la aplicación de la vacuna, la historia natural de la enfermedad indica que un impacto en la incidencia de cáncer de cuello uterino no será visto por décadas. [10, 12]. Por otra parte, de acuerdo con la distribución de los tipos de VPH 16 y 18 entre los diversos grupos de edad, aproximadamente la mitad de las mujeres mayores de 50 años con CC no estaría protegido por tales vacunas preventivas [13]. Por lo tanto, es necesario mejorar los procedimientos de detección y tratamiento de CC temprano.
El tratamiento actual de CC incluye cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, o una combinación de estas terapias, dependiendo de la etapa clínica de la enfermedad. Aunque el éxito de estos métodos convencionales depende de la etapa clínica de la enfermedad, en general, la supervivencia del paciente disminuye con la etapa de la enfermedad [14]. Si bien existen terapias dirigidas para muchos tipos de cáncer [15], no existen terapias dirigidas específicas contra CC. oncoproteínas mutados, especialmente proteínas quinasas, son el blanco de la mayoría de los medicamentos contra el cáncer específicos de la diana [16]. Además, algunos de estos fármacos se dirigen a las proteínas normales upregulated en tumores, tales como HER2 /neu en cáncer de mama [17, 18]. Identificación de dianas moleculares aumentada en CC, que son esenciales para el crecimiento tumoral y ausente en el cuello uterino sano, es el primer paso hacia el desarrollo de medicamentos específicos para el tratamiento de CC.
La inhibición de la mitosis es un conocido estrategia de lucha contra el cáncer [19, 20]. Los fármacos que inhiben el proceso de la división celular son por lo general eficaces como agentes contra el cáncer. Los taxanos y alcaloides de la vinca, que inhiben la formación del huso mitótico, son ejemplos bien conocidos de estos fármacos. Sin embargo, su eficacia es limitada ya que también afectan la red de microtúbulos de las células que no se dividen afectar las funciones endoteliales y producir efectos neurotóxicos.
En un trabajo anterior, hemos demostrado que el gen "dependiente de ciclina inhibidor de quinasa 3 "(
CDKN3
), que está implicado en la mitosis, es upregulated en comparación con CC que en el epitelio cervical normal. Además, en un análisis preliminar de supervivencia de 3,5 años, incluyendo una pequeña muestra de CC pacientes (n = 42) positivos para HPV16, los altos niveles de expresión de
CDKN3
se han encontrado asociados con una menor supervivencia de los pacientes [21 ]. Estos datos sugieren que
CDKN3
pueden estar involucrados en la progresión del tumor, al menos en CC positivo para HPV16. No se sabe si la sobreexpresión de
CDKN3
también se asocia con una disminución de la supervivencia en pacientes positivos para el virus del papiloma humano CC distintos de HPV16.
Para demostrar de manera concluyente si la sobreexpresión de
CDKN3
está asociada con el tiempo de supervivencia reducida en pacientes CC, un análisis de supervivencia a 5 años se llevó a cabo en una muestra grande (n = 121). Esto incluyó un grupo de pacientes positivos para VPH distintos de HPV16 y un grupo más grande de pacientes HPV16-positivas. Por otra parte, para investigar si
CDKN3
está implicado en el proceso de carcinogénesis, se analizó el efecto de la inhibición de
CDKN3
la expresión de genes en la proliferación, migración e invasión de líneas celulares derivadas de HPV16 -positivas (SiHa y CaSki) y HPV18-positivas (HeLa) CCS.
Métodos
La selección de pacientes, diseño del estudio, y los puntos finales
Los sujetos del estudio incluyó a 134 pacientes diagnosticados con CC en el Departamento de Oncología y 25 mujeres con epitelio cervical (controles experimentales) normales evaluado en el Departamento de Obstetricia y Ginecología en el hospital general de México en la Ciudad de México. Las muestras de CC son un subconjunto seleccionado de entre un total de 462 pacientes con CC que fueron reclutados con los siguientes criterios de inclusión: diagnóstico clínico de CC invasivo en el Departamento de Oncología, no hay tratamientos anteriores, y nacido y residente en México con una ascendencia mexicana que se remonta dos generaciones. Los pacientes que cumplían los criterios de inclusión fueron reclutados posteriormente durante los períodos entre noviembre de 2003 y abril de 2005 y enero de 2006 hasta julio de 2007, y representaron aproximadamente el 80% de los pacientes diagnosticados de CC durante este período. Los criterios de selección para el subconjunto CC se basan en la disponibilidad de ARN de alta calidad extraído de la biopsia del tumor fresco con células tumorales más de 70% en el análisis morfológico y el tipo positividad viral de tumores. Sobre la base de la calidad de ARN, se seleccionaron mayoría de los casos (88%) durante el segundo período de reclutamiento. CC incluyeron 90 muestras positivas para el VPH 16 (42 informó anteriormente [21], que se actualiza con los datos de supervivencia a 5 años, y 48 nuevas muestras analizadas para este informe) y 44 positivos para otros tipos de VPH: 18, 31, 33, 35 , 45, 51, 52, 53, 58, 59 y 68. Las mujeres incluidas en este informe fueron comparables a los excluidos por razones de edad (media = 50 años), raza /origen étnico, la histología y el estadio del tumor. La frecuencia de los tipos de VPH en este subgrupo no era comparable a la frecuencia en la totalidad de la muestra [13], ya que se seleccionaron una mayor proporción de tumores HPV16-positivas. Los tumores de los pacientes CC se organizaron de acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología Obstetricia (FIGO) [22]. Dos muestras de biopsias fueron tomadas de los tumores durante los exámenes de colposcopia. Una muestra se dividió en dos partes iguales: una parte se fijó en formalina tamponada para el análisis morfológico y la otra parte, junto con la segunda muestra de biopsia, fue instantánea congelada en hielo seco y almacenados a -80 ° C hasta su análisis. Control de muestras cervicales se obtuvieron de los pacientes sometidos a histerectomía por miomatosis. La carrera y la edad media (49 años) de estos pacientes fue similar a la de los pacientes con CC. Ellos fueron diagnosticados previamente con un cuello uterino normal por citología y colposcopia. Inmediatamente después de recibir un fragmento cervical de la sala de operaciones, que diseccionado los epitelios exocervical bajo un microscopio estereoscópico para evitar las células del estroma. Sólo cuatro muestras (16%) fueron positivos para el VPH, pero las señales eran débiles. El criterio principal de valoración fue la supervivencia global a los 5 años. El protocolo de estudio fue aprobado por los comités científicos y la ética del Hospital General de México (número de autorización DIC /03/311/04/051) y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes antes de su inclusión.
ADN y ARN aislamiento
ADN se purificó a partir de muestras de biopsia usando un ADN genómico Kit PureLink (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se mantuvo a -20 ° C hasta su análisis. ARN total fue aislado de medio de la biopsia dividido usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La calidad del ARN se confirmó con electroforesis en gel de agarosa, como se demuestra por la presencia de ARN ribosómico intacto, con la banda 28S dos veces tan intensa como la banda 18S.
Detección y tipificación de HPV
la detección del VPH se realizó mediante PCR utilizando cebadores universales situados en los genes L1 de HPV
MY09
/
MY11
,
GP5 +
/
6+
, y
L1C1
, tal como se describe anteriormente [23-25]. El
HBB
gen se utilizó como control interno para evaluar la calidad del ADN. Los tipos de VPH se identificaron mediante la secuenciación de las bandas amplificadas utilizando el método del ciclo de secuenciación fluorescente (BigDye Terminator Ready Reaction Kit; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). El análisis de secuencia se realizó usando un sistema ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Cada banda secuenciado se analizaron con la herramienta de secuencia FASTA similitud [13, 26]. La identidad porcentual promedio de los tipos de VPH detecta fue del 98,7% si se compara con las secuencias de referencia.
Medición de
CDKN3
la expresión génica utilizando cuantitativa en tiempo real inversa-reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR)
la transcripción inversa del ARN total se realizó con la alta capacidad de cDNA Archivo kit (Applied Biosystems) en un volumen total de 20 mL. La mezcla incluye 2 g de ARN, 2 l de 10 x tampón RT, 0,8 l de mM dNTPs 100, 2 l de 10 cebadores × RT azar, 1 l de MultiScribe
TM transcriptasa inversa (5 U /l), y 1 l de inhibidor de RNasa (2 U /l). Las reacciones se incubaron a 37 ° C durante 120 min, y luego se almacenaron a -20 ° C.
CDKN3
la expresión génica se midió en 134 cc y 25 de cuello uterino muestras de control sanos epitelio de la transcripción-PCR cuantitativa inversa (RT-qPCR) utilizando sondas TaqMan.
GAPDH
se utilizó como control interno. Se utilizaron TaqMan genes ensayos de expresión (
CDKN3
, Hs00193192_m1;
GAPDH
, Hs02758991_g1; Applied Biosystems). Los experimentos se realizaron por triplicado en un volumen final de 20 l, que incluye 200 ng de molde de ADNc, 10 l de 2 × TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 l de 20 × TaqMan ensayo de la expresión génica, y 7 l de -RNasa libre de agua. El programa de ciclos se llevó a cabo en un Rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Australia), que se estableció como sigue: una etapa de activación PCR inicial a 50 ° C durante 2 min seguido de 95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos de punto de fusión de 95 ° C durante 15 s y recocido /extensión a 60 ° C durante 1 min. Medición de la expresión génica se basó en las curvas de calibración relativos construidas a partir de un 10 veces piscina diluido en serie de los ADNc CC que van desde 500 hasta 0,05 ng. La expresión de
CDKN3
gen se normalizó en cada muestra de tumor y el control de la intensidad de la referencia interna (
GAPDH
) usando un método descrito previamente [21]. Los valores de intensidad normalizados se miden en ng /mL. Una prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) se llevó a cabo para comprobar si una distribución normal de los datos de expresión génica. La expresión factor de cambio se calculó dividiendo la intensidad normalizada mediana de cada muestra de tumor por la intensidad normalizada mediana de las muestras de control. La significación estadística entre las medianas de los tumores y los controles se calculó con la prueba de Mann-Whitney (MW) prueba no paramétrica.
Identificación de
CDKN3
ARN variantes mediante RT-PCR y secuenciación de ADN
CDKN3
variantes de ARN se determinaron en el ADNc de 45 tumores, 22 de epitelio cervical normal, y tres líneas celulares (CaSki, Hela, y SiHA) mediante RT-PCR. Los primers utilizados para la RT-PCR fueron descritas anteriormente [27] o diseñados según publicó variantes de secuencias [28] (Tabla S1). Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuenciaron utilizando el método fluorescente del ciclo de secuenciación (BigDye Terminator Ready Reaction Kit; Applied Biosystems). El análisis de secuencia se realizó usando un sistema ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Las secuencias se analizaron con la herramienta de secuencia FASTA similitud [13, 26], software SeqScape (Applied Biosystems), y una herramienta de alineación ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
el análisis de supervivencia
Según FIGO pacientes con cáncer de cuello uterino recibió tratamiento individualizado basado en las directrices de tratamiento para el cáncer de cuello uterino de la Sociedad Americana del cáncer (S2 Tabla). Después de completar el tratamiento, cada paciente fue evaluado clínicamente cada 1, 3 o 6 meses por un oncólogo con experiencia. Los datos clínicos del estudio de seguimiento se obtuvo de la historia clínica de los pacientes. Además, un trabajador social realiza llamadas telefónicas y visitas domiciliarias a los pacientes cada 6 meses durante el estudio. Sólo 121 de los 134 pacientes explorados con QRT-PCR se incluyeron en el estudio de seguimiento, e incluyeron 83 muestras positivas para el VPH 16 y 38 muestras positivas para otros tipos de VPH, incluyendo HPV18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59 y 68. el análisis de supervivencia se realizó en todos los pacientes que recibieron tratamiento y fueron seguidos por lo menos 10 meses. Aquellos marcados con un asterisco en la Tabla S2 no recibieron tratamiento (n = 8) o se perdieron durante el seguimiento en los primeros 10 meses (n = 5). La mediana de tiempo después de los 121 pacientes fue de 64 meses después del diagnóstico inicial. Estado de vida se registró en el último seguimiento, la muerte fue causada por un tumor primario de cáncer de cuello de útero, excepto el caso marcado con un asterisco doble en S2 Tabla (R221), y los casos desconocidos se refiere a aquellos pacientes que perdieron la pista de su estado antes 60 meses de seguimiento (R251, R278, R289 y R379). Estos casos perdidos y el paciente fallecido por causas distintas al cáncer de cuello uterino (R221) fueron designados como censurado. Censurados y los pacientes fallecidos fueron seguidos por el número de meses que se indican en la Tabla S2. Se consideró que los pacientes pierden cuando no asistió a las citas médicas para el control de la enfermedad, no se encontraron en las visitas domiciliarias o no responder a las llamadas telefónicas. La causa de la muerte de todos los pacientes durante el seguimiento fue confirmado por la historia clínica y el certificado de defunción. La asociación de la FIGO, el tipo de VPH y
CDKN3
expresión con la supervivencia fue investigado por el análisis de supervivencia (véase más adelante en la sección de análisis estadístico).
Las líneas celulares
El CC líneas de células positivas para el VPH 16 (CaSki, SiHa) y HPV18 (HeLa) fueron proporcionados por el Dr. JC Gomora del Departamento de Biofísica de la CFI-UNAM, Ciudad de México. Las células fueron cultivadas con Modificado Medio (Gibco® DMEM Cat: 12100-038, Life Technologies, Grand Island, NY) de Dulbecco de Eagle suplementado con suero fetal bovino (Gibco® gato: 16000-044, Life Technologies) y el antibiótico-antimicótico solución ( Gibco® gato: 15240-062, Life Technologies) a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora. Las líneas celulares fueron autenticadas por repeticiones cortas en tándem de perfiles antes de los experimentos (datos no mostrados).
La transfección de siRNAs
Los experimentos se repitieron dos veces por triplicado. Un total de 2 × 10
5 Las células se sembraron en cada pocillo de una placa de doce pozos y se cultiva a 60 hasta 80% de confluencia antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con una mezcla de tres siRNAs específicos contra
CDKN3 gratis (
CDKN3
siRNA, sc-43877) siRNAs o de control que contienen tres secuencias revueltos que no conducirán a la degradación específica de cualquier saber ARNm celular (control siRNA-a, sc-37007), utilizando el reactivo de transfección siRNA (sc-29528) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (todos los regentes de Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA). Se exploraron diferentes concentraciones de siRNAs (80, 100, y 120 nM) para investigar la concentración apropiada para inhibir
CDKN3
ARNm en las líneas celulares, la incubación de las células 48 h después de la transfección. El
CDKN3
nivel de expresión génica se midió por RT-qPCR como se ha descrito anteriormente.
inmunofluorescencia tinción
CDKN3 expresión de la proteína se determinó en las tres líneas celulares transfectadas con el específico
CDKN3
o siRNAs revueltos por inmunofluorescencia. Las células transfectadas se cultivaron directamente en cubreobjetos depositadas en los pocillos de la placa. Células cultivadas de 96 h después de la transfección se fijaron en etanol absoluto durante 20 min a -20 ° C. A continuación, una solución que contiene 5% de albúmina de suero bovino en PBS y para la permeabilización de células se añadió Triton X-100 y se incubó durante 30 min 0,05%. (Cat. 118702; Abcam Biochemicals, Cambridge, MA) El anticuerpo policlonal de conejo primaria contra CDKN3, obtenido de Abcam, se diluyó 1: 200 en 5% de albúmina de suero bovino en PBS y 0,05% de Triton X-100. Se añadió un volumen total de 20 l a cada cubreobjetos, que se incubaron durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS, los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron incubando los cubreobjetos con 20 l de anti-anticuerpo secundario de conejo conjugado con FITC (1: 100; ZyMax
TM, Life Technologies Jackson Lab) 2 horas a temperatura ambiente. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI [4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro] (1: 1000; Invitrogen). Los ensayos se realizaron por triplicado. Como hemos informado anteriormente [21], en las diapositivas de tejido de epitelio cervical normal, este sistema de detección CDKN3, que implica anticuerpos primarios y secundarios, no dio ninguna señal (datos no mostrados). Del mismo modo, en experimentos de líneas celulares utilizadas para probar la especificidad del sistema, en la que no se incluyó el anticuerpo primario, el sistema de detección no dio ninguna señal (S1 Fig). Estos datos indican que nuestro sistema es específico para la detección de proteínas CDKN3. Las imágenes fueron vistos a 60 × magnificación utilizando un confocal de fluorescencia microscopio Olympus (Olympus FV1000, Center Valley, PA), y las imágenes digitales fueron adquiridas con una cámara CCD. La intensidad de la fluorescencia verde se cuantificó en 140 campos de cada experimento utilizando el software ImageJ [29].
La inmunohistoquímica (IH)
La expresión de la proteína de CDKN3 se determinó en 37 CC (22 y 15 positivos para HPV16 y otros virus del papiloma humano, respectivamente) y 21 muestras de control usando inmunohistoquímica (IH). Cinco microarrays de tejidos (TMA) se construyeron con cada uno conteniendo 10-12 CC y 4-5 controles. El ensayo se realizó como se describió anteriormente [21]. En resumen, el TMA se desparafinaron en xileno y después rehidratarse secuencialmente con concentraciones graduadas de alcohol. El anticuerpo primario contra CDKN3 (sc-475, 1: 100) se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Antígeno-anticuerpo complejos se detectaron utilizando el método de peroxidasa de avidina-biotina, con 3,3'-diaminobencidina-tetrahydrocloride como sustrato cromogénico (Cat. KO679 LSAB + Sys /HRP; Dako Cytomation-Carpinteria, CA, EE.UU.) y las secciones se contraste con hematoxilina. Los ensayos se realizaron por triplicado. Se identificó la localización celular de la inmunorreacción, y la intensidad se anotó 0-4, donde 0 indica ninguna tinción y 4 la más intensa tinción.
Western blotting
CDKN3 expresión de la proteína se determinó usando Western Blot en las tres líneas celulares transfectadas con el CDKN3 específico o siRNAs revueltos. Las proteínas fueron obtenidos en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de reactivo de lisis (Cat: 89900, Life Technologies). El contenido de proteína de cada lisado se determinó usando un ensayo de Bradford de proteína (Cat: B6916, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. Una muestra de 50 g de cada lisado se resolvió en 12% en geles de desnaturalización de poliacrilamida (con 5% de poliacrilamida gel de apilamiento) y se transfirió electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa. solución salina Después de bloquear con leche descremada en polvo 5% en Tris tamponada con más Tween (TBST), la membrana se incubó con un anticuerpo policlonal de conejo antihumano CDKN3 (sc-475 Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y un anticuerpo antihumano actina monoclonal de ratón (la anticuerpo monoclonal anti-actina fue amablemente donada por Manuel Hernámdez, Ph.D, CINVESTAV) durante la noche a 4 ° C. A continuación, la membrana se incubó con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (GE Healthcare Bio-Sciences) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar con TBST, las proteínas inmunorreactivas se desarrollaron utilizando el kit de quimioluminiscencia (GE Healthcare Bio-Sciences).
Ensayo de proliferación
Los experimentos se repitieron dos veces por triplicado. Las células transfectadas ya sea con los siRNAs específicos contra
CDKN3
de ARNm o de control de siRNAs se sembraron en cada pocillo de placas de veinte cuatro pocillos y se recogieron a las 24, 48, 72, y 96 h después de la transfección. La proliferación celular se midió con un método colorimétrico basado en la conversión de sales de tetrazolio en formazán por la actividad deshidrogenasa en la mitocondria activa (Vybrant
® MTT Ensayo de proliferación celular Kit, V-13154, Life Technologies). En pocas palabras, después de sustituir el medio de cultivo con 400 l de medio de cultivo fresco (Gibco ® DMEM sin rojo fenol, Life Technologies), 20 l de MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio ) se añadió una solución en cada pocillo, incluyendo los controles negativos sin células. Las células se incubaron a 37 ° C durante 3 h, entonces todo el medio de cultivo se retira y se sustituye con 350μl de sulfóxido de dimetilo (DMSO), se mezcló suavemente, y se incuba a 37 ° C durante 10 min. Las placas se leyeron con un espectrofotómetro a 560 nm (BioPhotometer Eppendorf). El crecimiento celular sigue una tendencia exponencial predicha por la ecuación y
t = y
0 * e
rx, donde y
t = absorbancia a tiempo específico, x = tiempo de incubación en horas, y
0 = a absorbancia constante en el tiempo = 0, y el crecimiento r = tasa. Tiempo de duplicación celular (Td) se calculó de acuerdo con dos métodos diferentes: 1) la fórmula: Td = (T
2-t
1) x [log2 /(log y
y t2-log
t1)], donde y
t1 es la absorbancia a t
1 (24 h), y
t2 es la absorbancia a t
2 (96 h), y 2) la fórmula Td = ln (2) /r. El efecto sobre la tasa de duplicación se calculó dividiendo el tiempo de duplicación de las células transfectadas con siRNAs específicos contra
CDKN3
por el tiempo de duplicación de las células transfectadas con siRNAs revueltos.
Invasion y la migración ensayos
Los experimentos se repitieron dos veces por triplicado. ensayo de invasión se hizo en un 24 pocillos Transwell cámara (BD BioCoat Matrigel ™ ™ Cámara Invasión#354480; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las células en suspensión en 250 l de medio libre de suero (5,0 x 10
4 células) se añaden a los filtros de matrigel recubierto en pocillos por triplicado. En el compartimiento inferior de las cámaras 500 l de medio acondicionado bovina fetal de suero se utilizó como atrayente quimioterapia. Después de 48 h de incubación a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora, se recogieron las células que invadieron a través de los filtros desde el compartimiento inferior y se tiñeron con MTT ensayo colorimétrico descrito anteriormente. El ensayo de migración se llevó a cabo con un procedimiento similar. Las células fueron cargados en transwell insertos de membrana de policarbonato (BD BioCoat Control ™ inserciones de 24 pocillos, cat#354578; Becton Dickinson) en pocillos por triplicado. Las placas se incubaron durante 22 horas a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora. Se recogieron las células que habían migrado al compartimiento inferior de las cámaras y teñidas con MTT ensayo colorimétrico descrito anteriormente.
El análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias en
CDKN3
expresión entre tumores y controles se calculó con la prueba de Mann-Whitney (MW) prueba no paramétrica. El análisis característico (ROC) curva receptor operador se realizó y se utilizó el índice de Youden [21] para seleccionar los mejores puntos de corte para distinguir los tumores de la muerte y los pacientes vivos en la formación conjuntos seleccionados al azar, utilizando los valores de expresión FC de
CDKN3
gen obtenido por RT-qPCR. En resumen, con todo el conjunto de la muestra, fueron creados al azar 500 conjuntos de entrenamiento de 60 muestras. Para categorizar los
CDKN3
datos de expresión génica cuantificados por QRT-PCR, análisis ROC se realizó en cada conjunto de entrenamiento. Este análisis se realizó para establecer una línea de corte para la expresión génica que representa esos valores con la mayor sensibilidad y especificidad para diferenciar entre pacientes muertos y supervivientes. entonces el conjunto de toda la muestra se analizó con la media de corte, calculada a partir de los valores de los 500 conjuntos de formación. Las muestras con
CDKN3
la expresión génica valores iguales o superiores al punto de corte se establece en 1 y aquellos con valores por debajo de la línea de corte se ponen a 0.
Se calculó el tiempo de supervivencia global acumulada por el método de Kaplan-Meier y se analizaron mediante la prueba de log-rank. Clasificación de la FIGO,
CDKN3
la expresión génica y el VPH tipo se incluyeron en los modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante y multivariable. La significación estadística entre las diferencias de medias en líneas celulares de experimentos se calculó con la prueba de la t. Todas las pruebas fueron de 2 caras, y los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de datos se realizó utilizando Sigma Stat y SPSS ver. 17 software.
Resultados
CDKN3
la expresión génica en el cáncer de cuello de útero
Los diagramas de caja (figura 1A) muestran claramente que
CDKN3
expresión fue significativamente mayor en CC que en el tejido cervical sano (FC = 6,4, p = 8 x 10
-6, prueba de MW). Además, cuando los especímenes de cáncer se agrupan de acuerdo con el estado de HPV16, una diferencia en la expresión, en comparación con el grupo de control, se mantuvo en ambos CC positivo para HPV16 (FC = 6,6; p = 8 x 10
-5, MW) y CC positivo para otros tipos de VPH (FC = 5; p = 8 x 10
-6, MW) (figura 1A). Aunque
se encontró CDKN3
expresión que se downregulated (FC & lt; 1) o el valor de FC era igual o menor que 1,5 en 10,4% (n = 14) de los tumores, principalmente de los tumores positivos para tipos de VPH aparte de HPV16 (p & lt; 0,05, prueba de Chi-cuadrado; la figura 1B), estos datos apoyan la conclusión de que
CDKN3
expresión se incrementó en la mayoría CC independientemente del tipo de VPH
la expresión. de la ciclina dependiente inhibidor de quinasa 3 (
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) se midió por RT-qPCR en 25 muestras de cuello uterino sanos normales y 134 muestras de cáncer cervical (CC) son positivos para el virus del papiloma humano (VPH) 16 (n = 90) o para otros tipos de VPH (n = 44), incluyendo 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59, y 68. (a) Intensidad de la expresión génica, expresado en valores Log2, en diagramas de cajas . Los límites superior e inferior de las cajas representan los percentiles 75 y 25ª, respectivamente. Las líneas negras y punteadas dentro de las cajas representan los valores de la mediana y la media, respectivamente, y los bigotes representan los valores máximos que se encuentran dentro de 1,5x el rango intercuartil desde el extremo de la caja y mínimo. Los valores fuera de este rango están representados por círculos negros. El factor de cambio (FC) se calculó dividiendo la media de cada grupo de CC por la mediana del grupo de control. Las diferencias estadísticas entre los grupos se calcularon utilizando la prueba de Mann-Whitney no paramétrico. (B) Frecuencia (%) de distribución de
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bloques FC, que se calcularon en cada tumor teniendo en cuenta la media del grupo de control.
Asociación de
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la expresión génica, estadio clínico y el tipo viral con la supervivencia
Hemos investigado si la regulación positiva de
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se asoció con una disminución del tiempo de supervivencia en 121 pacientes CC, y si cualquier efecto sobre la supervivencia dependíamos del estadio clínico y el tipo de VPH. Para establecer una línea de separación entre los pacientes vivos y muertos y el valor potencial de
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expresión como un marcador para la supervivencia, un promedio FC de corte se calculó usando las curvas ROC (ver Material y Métodos). El punto de corte promedio obtenido fue de FC = 17. De las 121 muestras, 83 fueron positivas para el VPH 16 y 38 para otros tipos de VPH (S2 Tabla). El tiempo medio de seguimiento fue de 64 meses desde el diagnóstico inicial. etapas clínicas (FIGO) de los 121 pacientes fueron IA1 (n = 1), IB1 (n = 35), IB2 (n = 29), IIA (n = 7), IIB (n = 35), IIIB (n = 9 ), y IV (n = 5). La supervivencia global de los pacientes era de 71,9% y para los estadios clínicos de la FIGO IA1 /IB1, IB2, IIA, IIB, IIIB y IV fueron 94,4%, 79,3%, 57,1%, 57,1%, 55,6% y 20%, respectivamente. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas (p = 1,2 x 10
-6, log-rank test, S2A figura).
Los pacientes con alta expresión de
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gen (FC ≥ 17