Extracto
Las células tumorales circulantes (CTC) a mediar en la diseminación metastásica de muchos tumores sólidos y enumeración de las CTC se utiliza actualmente como un indicador pronóstico de supervivencia en pacientes con cáncer de próstata metastásico. Alguna evidencia sugiere que es posible derivar información adicional sobre los tumores de análisis de la expresión de los CTC, pero la dificultad técnica de aislar y analizar los CTC individuales ha limitado el progreso en esta área. Para evaluar la capacidad de una nueva generación de MagSweeper para aislar CTC intactos para el análisis de aguas abajo, se realizó mRNA-Seq en CTC individuales aisladas de la sangre de pacientes con cáncer de próstata metastásico y en las células LNCaP de línea celular de cáncer de próstata solo claveteado en la sangre de donantes sanos. Se encontró que la MagSweeper aislado efectivamente CTC con una eficiencia de captura que coincidía con la plataforma CellSearch. Sin embargo, a diferencia de CellSearch, el MagSweeper facilita el aislamiento de los CTC en vivo individuales sin leucocitos contaminantes. Es importante destacar que, el análisis de ARNm-Seq mostró que el proceso de aislamiento MagSweeper no tuvo un impacto discernible sobre el perfil transcripcional de LNCaPs individuales aislados a partir de sangre humana de punta, lo que sugiere que cualquier perturbaciones causadas por el proceso MagSweeper relativa a la firma transcripcional de células aisladas son modestos. Aunque el ARN de las CTC paciente mostró signos de degradación significativa, en consonancia con los informes de las vidas medias cortas y la apoptosis entre los CTC, las firmas de transcripción de tejido de la próstata y de cáncer eran fácilmente detectables con un solo ARNm CTC-Seq. Estos resultados demuestran que la MagSweeper proporciona acceso a las CTC intactas y que estos CTC potencialmente pueden proporcionar información clínicamente relevante
Visto:. Cann GM, Gulzar ZG, Cooper S, Li R, S Luo, Tat M, et al . (2012) ARNm-Sec de cáncer de próstata Individual células tumorales circulantes revela Recapitulación de la expresión génica y las vías encuentran en el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (11): e49144. doi: 10.1371 /journal.pone.0049144
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de junio de 2012; Aceptado: 4 de octubre de 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Cann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Departamento de Defensa conceder W81XWH-10-1-0510 (a JDB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: GMC, Carolina del Sur, RL, SL, MT, SS, SG, MR, y AT están actualmente empleadas por Illumina. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Las células tumorales circulantes (CTC) son células que parte de un tumor primario o la metástasis y entrar en el torrente sanguíneo a través de la vasculatura con fugas que se plantea en torno a un tumor en crecimiento. Una vez en la sangre, CTC encuentran tensiones perjudiciales asociados con cizallamiento hemodinámica, condiciones de bajo oxígeno, la falta de sitios de anclaje, y ataque del sistema inmune [1], [2]. Un pequeño número de CTC sobrevivir y sin embargo extravasate en los tejidos circundantes a la semilla metástasis o sembrar de nuevo el tumor primario [3]. Descrito más de un siglo [4], las CTC se puede ahora enumeró utilizando la FDA aprobó plataforma CellSearch para proporcionar información de pronóstico en relación con la supervivencia del cáncer de mama metastásico, colon y pacientes con cáncer de próstata [5] - [7]. Yendo más allá de la enumeración, varios grupos han sugerido que el análisis genético y la transcripción de los CTC individuales podría ser aprovechada para tomar decisiones médicas personalizadas para la terapia del cáncer y proporcionar conocimientos sobre los procesos biológicos implicados en la metástasis [8] - [10].
Varios métodos han sido explotados para aislar CTC de glóbulos rojos y blancos (GB). Diferenciación de las propiedades físicas y marcadores de superficie de las CTC se han utilizado para su aislamiento por filtración [11], chip microfluídico [12], [13], centrifugación de densidad boyante [14], la selección inmunomagnética [15], [16], el enriquecimiento funcional y detección [17], [18], y automatizado de microscopía inmune [19], [20]. enriquecimiento inmunomagnético con perlas anti-EpCAM seguido por clasificación de células activadas por fluorescencia ha sido recientemente demostrado ser un enfoque eficaz para el aislamiento de las CTC relativamente libre de células hematopoyéticas [21]. De las plataformas actualmente en uso para el aislamiento de los CTC, la tecnología MagSweeper ofrece una gran facilidad de uso y acceso a las CTC altamente puros e intactos, individuales adecuados para el análisis genético y proteómico [22], [23].
CTC son generalmente presentes en números bajos en muestras de sangre de pacientes (típicamente 1 por 10
7 células nucleadas en la sangre) para la extracción de información máxima de CTC sola o disponibles aislado de muestra de sangre de un paciente es esencial. Siguiente generación de secuenciación de ADN es particularmente adecuada para una profunda interrogación de los genomas del cáncer y transcriptomes [24] incluso cuando se aplica en el nivel de células individuales [25]. En este estudio, se validó la realización de una nueva generación de la MagSweeper utilizando células de cáncer de próstata LNCaP con púas en la sangre normal. A continuación, realizó una comparación de sensibilidad captura de CTC de cáncer de próstata entre CellSearch y la MagSweeper en muestras repetidas de los pacientes. estudios de secuenciación del transcriptoma enteras de células LNCaP individuales reveló que el aislamiento MagSweeper tiene efectos mínimos sobre la expresión génica. Por otra parte, el mRNA-seq perfiles de transcriptoma mediada de CTC próstata individuales aisladas de la sangre del paciente metastásico se compararon con muestras normales de tejido de próstata y líneas celulares de cáncer de próstata sola. A pesar de célula a célula heterogeneidad y una amplia gama de la calidad del ARN CTC, una mayor expresión de genes relacionados con la próstata tal como el receptor de andrógenos (AR), KLK3 (PSA) y TMPRSS2 podían distinguirse en CTC próstata. pantallas bioinformáticas para los genes expresados 100 veces mayor en comparación con los CTC muestras normales de la próstata revelaron otras vías genéticas conocidas y firmas que se esperan de cáncer de próstata y el historial de tratamiento de su anfitrión.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue revisado y aprobado por el Consejo de cumplimiento de sujetos Humanos de Investigación de Stanford y se adhiere a las regulaciones de HIPPA. Todos los sujetos humanos firmaron un consentimiento antes de la muestra de sangre recogida informados. Se recogieron
Las muestras de pacientes y recogida de sangre
Las muestras de pacientes en tubos de 10 ml con EDTA (Becton Dickenson) y se procesan dentro de 12 horas desde su recogida. Las muestras se recogieron de acuerdo con las directrices especificadas y aprobadas por una Junta de Revisión Institucional y después del consentimiento informado. Para las comparaciones entre MagSweeper y CellSearch, una segunda muestra de 7,5 ml de sangre se recogió en un tubo de CellSave. Los ensayos se realizaron por CellSearch diagnóstico de Quest. El ARN total de tres tejidos de la próstata histológicamente normales se obtuvieron de próstatas extirpados quirúrgicamente bajo un protocolo aprobado por el IRB separada.
Cultura y célula Spiking
LNCaP, se compraron las células PC-3 y T24 y se cultivaron de acuerdo con las condiciones especificadas por la American Type Culture Collection (ATCC). células vivas y muertas siguiente disociación se determinaron por exclusión de azul de tripano. Para Rematar, las células se diluyeron a aproximadamente 3 × 10
3 células por ml y la concentración de células verificados mediante la detección y contando seis, diez alícuotas de microlitros de células manchadas en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Sin corrección de las células muertas sobre la base de la exclusión de azul de tripano se utilizó antes de clavar las células.
Bead Binding y la tinción de la superficie celular
perlas magnéticas personalizada 1,5 um recubiertas con estreptavidina fueron funcionalizados con un anticuerpo monoclonal biotinilado personalizada dirigido contra extracelular epítopo EpCAM humano. Dos 3,75 ml volúmenes de sangre por muestra se sometieron a lisis de glóbulos rojos con 10 volúmenes de 1 × PharmLyse (BD Biosciences) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células restantes se sedimentaron a 4 ° C durante 15 min a 300 x g. Los sedimentos celulares se transfieren con 2 x 1 ml alícuotas de 1% BSA /mM EDTA PBS /5 en un tubo de microcentrífuga de 2 ml de fondo plano (VWR International). Las células se sedimentaron entonces durante 5 minutos a 510 x g. Los sedimentos celulares se resuspendieron en un volumen total de 1 ml de 1% de BSA /EDTA PBS /5 mM que contiene 15 ul de Alexa 488 CD45 anti-humano (Life Technologies) y 30 ul de nuestros perlas anti-EpCAM personalizados. Las muestras se hicieron girar durante 30 minutos a 4 ° C seguido de la adición de 20 ul de ficoeritrina (PE) anticuerpo EpCAM monoclonal anti-humano (BD Biosciences 347198). Las muestras fueron luego girar a 4 ° C durante 30 minutos y después se transfirieron a un pocillo en una placa de 6 pocillos que contiene 6 ml de 1% BSA /PBS /5 mM EDTA. Las muestras se mezclaron una vez pipeteando arriba y abajo en una pipeta de 10 ml, y las placas se centrifugaron durante 5 minutos a 400 rpm, seguido de incubación durante 15 minutos a 4 ° C antes de MagSweeper aislamiento. En algunos experimentos con muestras enriquecidas, las células LNCaP se etiquetaron antes de clavar con CFDA (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante.
MagSweeper y aislamiento de los organismos unicelulares
putativos CTC se aislaron mediante dos ciclos de aislamiento MagSweeper. Las células aisladas después de la primera ronda de MagSweeping fueron puestos en libertad y se tiñen en un pocillo de una placa de 6 pocillos que contiene 500 nM de membrana impermeable DAPI (Life Technologies), de modo que las células de la membrana comprometida pudieron ser identificados. Después de una segunda ronda de células MagSweeping se dispersaron y se sedimentó a 400 rpm durante 1 min en un pocillo de una placa de 6 pocillos adherencia baja en 10% Superblock (ThermoFisher) /PBS. Los pozos fueron vistos con un microscopio invertido Olympus equipado para epiflouresence. CTC putativos fueron identificadas como células que se tiñeron positivas para el PE anti-EpCAM y negativo para Alexa 488 anti-CD45. CTC putativos que eran DAPI + se excluyeron del análisis adicional. DAPI CTC putativo negativos fueron aislados en 1 ul de 10% Superblock /PBS con un pipetteman en un tubo de 0,2 ml de PCR que contiene 2,5 ul de 5% ribonucleasa inhibidor (Life Technologies) /0.2% Triton X-100 (solución al 10%, Sigma) preparada en agua libre de nucleasa. Las células fueron recogidas congelaron en hielo seco y se almacenó a -80 ° C. pureza celular se midió como el número de células recuperadas de púas dividido por el número de células recuperadas de púas más el número de leucocitos.
Single Cell mRNA-Seq
se lisaron las células individuales y el ARN se transcribió inversamente utilizando el ARN de entrada ultra bajo SMARTer para el kit de secuenciación de Illumina (Clontech). cDNA se amplificó utilizando el kit Advantage 2 PCR (Clontech) para 18-25 ciclos antes de la conversión en una biblioteca de secuenciación de ADN compatible Illumina usando el Kit Prep muestra de ADN Nextera (Illumina) y 12 ciclos de PCR para amplificar la biblioteca. Las bibliotecas se cuantificaron usando un Bioanalyzer (Agilent) y qPCR utilizando un kit de Kappa Syber Green PCR (Kappa Biosciences) en una máquina IIlumina ECO qPCR. Se prepararon células de flujo de extremo pares usando 20:00 de la biblioteca Nextera por carril en un CBot (iluminación) y se secuenciaron usando solo 50 pb lee en una Illumina GAIIx.
Alineación
Los datos de secuenciación se recogió con versión 1.9 y FASTQ archivos RTA se generaron con Casava 1.8. Lee que no pasó el filtro estándar de calidad de Illumina fueron retirados por defecto. Las lecturas fueron alineados a hg19 con el sombrero de copa y v1.3.3 cuentas por transcripción se calcularon para hg19 en iGenomes utilizando la versión 1.1 de las mancuernas con las opciones: -GTF & lt; genes.gtf & gt; -max-haz-frags 20000000. gen por gen recuentos primas y fragmentos por kilobases del exón por millón de fragmentos mapeados (FPKM) se generaron a partir de los gemelos de archivo isoform.fpkm_tracking mediante la identificación de todas las transcripciones con el mismo nombre de genes y teniendo, respectivamente, la suma de cobertura multiplicado por transcripción de longitud /longitud de lectura por cada transcripción y la suma de la FPKM para cada transcrito. Los recuentos primas y FPKMs se utilizaron en todos los análisis de aguas abajo, a excepción de la etapa de control de calidad.
RNA-Seq Control de Calidad de Datos
El control de calidad (QC) se realizó usando un interno Illumina RNA-Seq guión de control de calidad. cobertura Base-por-base se calculó a través de un conjunto recogido a mano de genes de control de calidad 600 que se eligen de RefSeq y son altamente mappable y muy abundantes en las muestras universales ARN humano (UHR) (Agilent). medios altamente mapeables que & gt; 90% de las bases para una transcripción seleccionados tienen 100% mapeabilidad. Alta expresión en UHR significa que sólo los genes con cobertura media & gt; se seleccionaron 1 ×. Así que para una determinada transcripción 1000 pb de longitud que hay al menos 20 lecturas de 50 pb asignada a la misma. Los genes en este conjunto con más de 1 FPKM se utilizaron para calcular estadísticas adicionales. La mediana de la cobertura a través de todos los genes de control de calidad de longitud normalizada con más de 1 FPKM se trazó. Para cada gen de control de calidad con mayor que 1 FPKM, el coeficiente de variación se calculó a través del gen, y se determinó la media de todas las CVs.
no supervisada Clustering
no supervisada agrupación jerárquica [26 ] se hizo con la función de mapa de calor en R, con la distancia euclídea predeterminado que se utiliza como la disimilitud métrica. Para cada muestra, los 100 genes con la más alta FPKM fueron seleccionados y la piscina resultante de 312 genes que se utilizan en la agrupación.
LNCaP expresión análisis
bordeadora [27] se ha ejecutado utilizando tagwise moderado dispersiones con los contadores de carga por gen como entrada. La correlación entre las muestras se calculó basándose en el número de lecturas prima asignada a cada gen.
Los genes sobreexpresados en las CTC
Debido a la variabilidad inherente a los datos de una sola célula, junto con los diversos grados de descomposición de ARNm aparente observado en el CTC, se utilizó un método de umbral simple para identificar genes expresados sobre-. Para cada gen se calculó la proporción entre el 2
nd valor FPKM más alta entre el conjunto de los CTC a la FPKM en el ARN normal de la próstata. Se seleccionaron genes con una relación de al menos 100 × y al menos 10 Total de Lecturas en una de las CTC. GO ontologías se generaron utilizando el Sistema de Clasificación de la pantera (http://www.pantherdb.org/) [28].
Resultados
MagSweeper métricas para el aislamiento CTC
nuevo prototipo de la Magsweeper [22] fue desarrollado que es compatible con la operación en la mayoría de cabinas de seguridad biológica (Figura 1A). Para evaluar el rendimiento de esta plataforma, durante un período de 11 meses, a 100 células LNCaP se enriquecieron repetidamente en 3,75 ml de sangre normal y aislados con el MagSweeper (n = 54 experimentos y 11 donantes de sangre). Antes de remate, la viabilidad celular LNCaP medida por exclusión de azul de tripano fue del 89% ± 8%. Durante el aislamiento a partir de células LNCaP de sangre púas fueron marcados con fluorescencia con anticuerpos contra EpCAM y CD45 para distinguir las células LNCaP de glóbulos blancos, y se utilizó la membrana impermeable DAPI mancha nuclear para identificar las células muertas (membrana comprometidos). Post-aislamiento que se recuperó una media del 81% ± 16% de las células LNCaP en vivo de pinchos (EpCAM + /CD45- /DAPI-) (Figura 1B, línea azul), mientras que la tinción DAPI reveló un 12% ± 6% adicional de las células LNCaP aislados que la membrana se vieron comprometidas (EpCAM + /CD45- /DAPI +). Dado que el pico de células original contenía 11% de células muertas (medido mediante exclusión con azul de tripano) de recuperación de células positivas DAPI 12% después de MagSweeping indica que los daños en las células LNCaP se disparó durante todo el procedimiento es mínimo. Normal, muestras de sangre no enriquecido no produjeron células positivas EpCAM (datos no mostrados).
(A) Imagen de prototipo capó del MagSweeper. captura (B) Porcentaje de 100 células LNCaP se disparó en 3,75 ml de sangre normal (N = 54 experimentos y 11 donantes). Los círculos azules muestran el porcentaje de recuperaciones EpCAM en vivo significa (+) /CD45 (-) /DAPI (-) las células y los círculos rojos muestran las recuperaciones medias de membrana comprometida EpCAM (+) /CD45 (-) /DAPI (+) las células. Las barras de error representan +/- 1 S.D. (C) Porcentaje de captura y la pureza de 10 células LNCaP aislados tras clavar en 7,5 ml de sangre normal. Las barras azules son el porcentaje de recuperación media de células después de MagSweeper aislamiento (captura de células) y recoger y lugar manual de aislamiento sola célula (aislamiento de células) mientras que las barras de color púrpura muestran la pureza de las células LNCaP después de MagSweeper y aislamiento de células individuales (n = 6 experimentos y 4 donantes ). pureza de las células se calcula como el número de células de púas aisladas dividido por el número de células contadas púas más células blancas de la sangre contados. Las barras de error representan +/- 1 S.D. (D) de campo claro (BF) y las imágenes de los CTC teñidas con fluorescencia aisladas de un cáncer de próstata muestra de sangre del paciente, y la contaminación del CMB encontrado después del aislamiento MagSweeper. Barra de escala = 20 micras. (E) MagSweeper frente comparación CellSearch de muestras de pacientes. Las muestras con 0 CTC se les asignó un valor de 1 para fines de trazado.
Para evaluar la pureza de las células ultra-raras después de MagSweeping, 7,5 ml de sangre de donantes normales, se añadieron con 10 células marcadas CFDA (n = 6 experimentos y 4 donantes) y se procesa de acuerdo con nuestro protocolo para el aislamiento CTC. células LNCaP capturados fueron identificados por la detección fluorescente de CFDA, mientras que los glóbulos blancos contaminantes se identificaron por tinción de CD45 positiva. Después de separación magnética de una recuperación media porcentaje LNCaP de 63% ± se observó 25%. Enumeración de células CD45 positivas dio una pureza inicial de las células LNCaP aislados después de aislamiento de células MagSweeper de 10% ± 6% y 100% post aislamiento de una sola célula usando un método de selección y lugar (Fig. 1C).
a continuación realizó un análisis comparativo de MagSweeper frente CellSearch en la enumeración de CTC en muestras de sangre de pacientes con cáncer de próstata metastásico. En el momento de empate, se recogieron dos 7,5 ml de muestras de sangre, una muestra en un tubo de EDTA estándar para el aislamiento de células MagSweeper y un segundo en un tubo de CellSave para el análisis por un laboratorio independiente (Quest Diagnostics) utilizando el ensayo de CellSearch. tinción de inmunofluorescencia de las células aisladas MagSweeper identificó CTC como EpCAM positivo y negativo de CD45. CTC se distinguen fácilmente del CMB que eran CD45 positivo, negativo EpCAM (Fig. 1D). El número de CTC completamente purificados enumerados por el aislamiento y MagSweeper CellSearch se compararon y se encontró que razonablemente similares, con una tendencia leve observada hacia una mejor captura de CTC mediante el MagSweeper en las muestras con las cantidades de CTC bajas (Figura 1E).
MagSweeper aislamiento tiene efectos mínimos sobre la transcriptomes de células individuales
para evaluar si el proceso de aislamiento MagSweeper afectó al perfil transcripcional global de las células aisladas, se les practicó sola célula ARNm-Sec en 4 células LNCaP frescas justo antes de clavar en sangre, y en 4 LNCaPs después del aislamiento MagSweeper a partir de sangre normal de púas. Las células aisladas se almacenaron congelados durante al menos un mes para simular las condiciones de almacenamiento. Bioanalyzer rastros de ADNc amplificado a partir de un aire fresco y una célula aislada MagSweeper revelaron picos similares de peso molecular de los productos de amplificación con centro en aproximadamente 1000 pares de bases (Fig. 2A).
(A) Bioanalyzer traza de cDNAs amplificados a partir de una sola LNCaP validez de las células (LNCaP individual (pre)) y MagSweeping post (LNCaP individual (post)), y el control positivo (12 pg de ARN total LNCaP) y control negativo (control negativo). (B) Mapa de calor de las correlaciones entre los datos de RNA-Seq unicelulares MagSwept y fresco y tabla de correlaciones entre las muestras frescas y MagSwept. El amarillo indica correlaciones más altas y más bajas correlaciones rojos. (C) los rastros Bioanalyzer Representante de buenos, intermedios y pobres productos de amplificación de cDNA CTC. (D) Porcentaje de ruptura de la calidad del ARN CTC basado en la clasificación de los productos de amplificación de cDNA - verde indica buena calidad, las muestras son de color amarillo ARN parcialmente degradado y el rojo indica las muestras de ARN degradadas. (E) Secuenciado CTC, su calidad y ARN% alineación de filtro pasa-mRNA-Sec lee a la acumulación hg19 genoma humano. Paciente CTC CTC indica Identificación de pacientes individuales identificados como el número de paciente. número de CTC (B1.1). ARN de calidad se basa en los rastros Bioanalyzer de ADNc amplificado y alinear% es la alineación% del ARNm-Sec lee.
Para el estudio de los genes expresados diferencialmente entre fresco y MagSweeper aislado células individuales, lo primero que utilizó el Bioconductor bordeadora paquete. Se identificó sólo 1 de genes expresados diferencialmente como entre las células LNCaP aisladas-MagSweeper y controlar a una tasa de falso descubrimiento (FDR) de corte de 0,05 y ninguno en un punto de corte de 0,01.
También exploramos varios otros métodos para la identificación de diferencias entre las células aisladas frescas y MagSweeper. En primer lugar, para caracterizar el grado de variabilidad de célula a célula, nos preguntamos cuántos genes tenían una muy alta FPKM (& gt; 10) en al menos 1 de muestra y un FPKM muy baja (& lt; 0,1) en al menos una muestra. Se consideraron tres grupos diferentes de muestras: (1) 4 células frescas (2) 4 células MagSwept y (3) 2 2 fresco y las células MagSwept. El número de genes muy variables en cuatro células frescas (215), cuatro células MagSwept (268) y una combinación de 2 fresco y 2 células MagSwept (239) fue similar en todos los grupos y probablemente refleja célula a célula heterogeneidad. En otra comparación, se calculó la correlación del número de lecturas por genes entre cada par de muestras, y se encontró que las correlaciones dentro de los grupos eran más fuertes que el entre correlaciones grupo - es decir, las células no clúster basado en el método de aislamiento ( Figura 2B). Finalmente, en un estudio separado, nos encontramos con una expresión de microarrays de iluminación en piscinas de 10.000 células LNCaP de aislamiento antes y después de MagSweeper. De nuevo, no era alta correlación cruzada (R
2 = 0,985) entre las células y los controles que indican que MagSweeper produce alteraciones mínimas en la expresión de genes aislados MagSweeper (datos no mostrados).
mRNA-Seq de solo próstata cáncer de CTC
Hemos preparado cDNA amplificado de 67 CTC aisladas de pacientes con cáncer de próstata 13. CTC se aislaron después de MagSweeping basado en la tinción de inmunofluorescencia de células que eran (EpCAM + /CD45- /DAPI-). A diferencia de las células LNCaP cultivadas (Figura 2A), se encontró que había una amplia gama de tamaños de los ADNc amplificados en los CTC derivados del paciente, reflexivo de la calidad del ARN inicial. Nos caracteriza trazas de productos de amplificación en 3 grupos: 1) los que tienen picos centrados en torno a 1000 bps (buena calidad), 2) las trazas con productos de amplificación de longitud intermedia (parcialmente degradadas), y 3) las trazas con productos de amplificación de peso predominantemente de bajo peso molecular (degradado ) (Fig. 2C). Mirando a través de los 67 CTC, 21% tenían RNA de buena calidad, 37% eran parcialmente degradado, y 42% de las muestras se degrada (Fig. 2D). ARN de calidad tiende a ser un poco paciente específico - por ejemplo, el paciente 2 dado el número más alto (8/12) de las buenas muestras de ARN de calidad. El uso de ARN de calidad como guía, la secuencia de las bibliotecas de 24 CTC que incluían representantes de las tres clasificaciones de la calidad del ARN y secuencias alineadas con el genoma humano (build hg19). Basado en la puntuación de alineamiento de secuencias de más de cinco por ciento, datos de la secuencia de 20 CTC recogidos de 4 pacientes (P1, P2, P3 y P4) se seleccionaron para su posterior estudio en profundidad (Fig. 2E).
mRNA- ss calidad de los datos
Para evaluar la calidad de los datos ARNm-ss, la cobertura se calculó utilizando una secuencia de comandos de control de calidad y un conjunto selecto de genes de control de calidad 600 que son altamente expresado en mapeable y ARN humano universal (ver Métodos, ARN -Seq de datos de control de calidad para la definición). Los datos de secuenciación de la única LNCaP, las células PC-3, y T24 pasan las normas de control de calidad para & gt; 60% de alineación y & lt; 65% de la media CV alineación típicamente aplicadas a grandes conjuntos de datos de ARNm-Seq entrada RNA (Fig 3A). . Por el contrario, las CTC está representada superiores CV mediana de cobertura y menor porcentaje de alineaciones que las células cultivadas. parcelas de cobertura típicas para líneas celulares, tejidos de próstata normales, y las CTC se muestran en la Figura 3B. Las líneas celulares que se muestra una cobertura suave a través de la longitud de la transcripción, mientras que las muestras normales de la próstata tenían una ligera "sesgo 3, típico de muestras de tejido (Fig. 3B). Los CTC tenían una amplia gama de sesgo de la cobertura, tal como se muestra. Desde oligo-dT se utilizó para la síntesis de ADNc de primera, un sesgo 3-prime en los datos de cobertura sugiere la degradación del ARNm.
(A) Porcentaje de pasar el filtro (PF) que lee Alineados, porcentaje de alineaciones que se asignan a regiones codificantes, CV mediana de la cobertura, y el porcentaje de lecturas que se asignan a los cinco genes con el mayor número de mapeado lee. Para calcular el "CV Median", primero el CV de la cobertura se calculó a través de cada uno de 600 genes en un conjunto de recogida a mano de genes de control de calidad expresadas en el ARN humano universal (Agilent), y luego se toma la mediana de estos CV (teniendo en cuenta sólo los genes con al menos 1 × cobertura). El "% alineado" es el porcentaje de PF lee que se alinean con el genoma o a un sitio de empalme, con exclusión de las mitocondrias y el ARN ribosomal. Sobre la base de los datos históricos, valores esperados para CV mediana y% alineados son & lt; 65% y & gt; 60%, respectivamente. alineaciones de codificación son el% de lee ese mapa a los exones. El% de lecturas alineado con los 5 mejores genes para cada muestra se muestra (B) Ejemplos de la cobertura media longitud normalizada a través de los genes de control de calidad 600, a partir de muestras LNCaP.3, N.1, P2.1, P3.4 . La posición 0 es el extremo 5 'de las transcripciones y 100 es el extremo 3' extrema de la transcripción.
ARNm-Sec contenido de datos
Para entender la abundancia de transcripción, la variación y el rango de los CTC, se compararon las distribuciones de los valores de todos los ARN FPKM RefSeq detectados en los CTC y las células LNCaP (Tablas S1 y S2). Las mediciones de las transcripciones RefSeq con ≥10 FPKM revelan en las células LNCaP (n = 4) 4622 ± 136,2 transcripciones (con un rango de 4.485 a 4.786 transcripciones). Por el contrario, en los CTC (n = 20) el número de transcripciones RefSeq con ≥10 FPKM era de 2362 ± 865 transcripciones (con un rango de 1233 a 3987 transcripciones).
A continuación, se observaron los niveles de expresión de varios los responsables de la próstata y un marcador de leucocitos para establecer que las células derivadas de pacientes eran de origen prostático: receptor de andrógenos (AR), el antígeno prostático específico (PSA, KLK3), TMPRSS2, y el marcador CD45 de leucocitos en todas las muestras de CTC. La Figura 4A muestra la FPKM de cada uno de estos marcadores en CTC paciente, líneas de células de cultivo de tejidos y la próstata normal, con valores de & gt; 1 FPKM sombreada en verde. Todos menos uno de los CTC fue positiva para al menos uno de los marcadores de la próstata. LNCaP y la próstata normal mostraron una expresión esperada de estos marcadores de la próstata. PC-3 carecía KLK3 y AR expresan, como se esperaba [29], pero sí expresó TMPRSS2. Es importante destacar que todos los CTC y las líneas celulares fueron negativos para el marcador CD45 CMB. próstata normal, que se compone de muchos tipos de células incluyendo los glóbulos blancos, fue positivo para la expresión CD45 como fue el único de WBC que se sometió a mRNA-Seq. Por último, T24, una línea celular de cáncer de vejiga no expresó ninguna de estos marcadores. Para entender cómo CTC paciente se relacionan entre sí, se realizó un análisis de agrupamiento no supervisado de todos los CTC paciente. El análisis reveló que, con la excepción de dos CTC (P2.9 y P1.2), todos los CTC de pacientes individuales agrupados de una manera específica del paciente (Fig. 4B).
(A) Expresión de cáncer de próstata genes asociados. Para cada gen, se muestran fragmentos por kilobase del exón por millón de fragmentos mapeadas (FPKM) para cada CTC y los controles. FPKM valores superiores a 5 están sombreadas verde y los que tienen valores entre 1 y 5 están sombreadas de color verde claro. AR (receptor de andrógenos), KLK3 (antígeno específico de la próstata), y TMPRSS2are marcadores de tejido de la próstata. CD45 es un marcador de glóbulos blancos. líneas celulares de cáncer de próstata incluyen LNCaP y PC-3, mientras que T24 es un cáncer de vejiga, y WBC es una sola célula blanca de la sangre. Normal indica el tejido prostático normal. (B) el agrupamiento no supervisado de exceso de genes expresados en las CTC paciente. Las barras de colores en la parte superior de la figura indican los distintos pacientes, mientras que CTC individuales de los pacientes se enumeran en la parte inferior de la agrupación. (C) Clasificación funcional de los genes sobreexpresados en el uso de CTC ontología de genes (GO) clasificaciones. Para agrupar cada funcional del% de los genes sobreexpresados en cada categoría GO se indica.
CTC Pathway Analysis
Para encontrar los genes y las vías que se activan diferencialmente en las CTC se compararon transcripción los perfiles de los CTC a partir de tejido normal de la próstata y se centraron en los genes que estaban sobre expresados en los CTC. Para normalizar los datos de RNA-Seq basados en tamaños de genes y número de fragmentos mapeados, se utilizó el sombrero de copa y gemelos para determinar FPKM. Pensamos que los diversos grados de degradación del ARN en los CTC conducirían a conteo de falsos positivos de bajo genes expresados en el CTC, especialmente desde que la vida media de ARN varía de un gen a gen. Se utilizó un método de umbral manual para identificar los genes que se sobreexpresan en CTC. En concreto, se seleccionaron los genes que son al menos 100 veces mayor en al menos 2 de los CTC en comparación con el tejido normal de la próstata y que contenía al menos 10 mapeado lee en al menos una muestra.
Se identificaron 181 genes más -expresada en las CTC en comparación con el tejido normal de la próstata (Tabla S3). Para obtener una visión general de la gama de funciones biológicas asociadas con estas transcripciones, las anotaciones de ontología de genes que derivan de la base de datos GOslim usando el navegador Sistema de Clasificación Panther [28] (Fig. 4C) y clasificarse para los procesos biológicos. Fuera de 181 genes, 110 produjo 173 golpes de proceso que fueron clasificados en 14 procesos biológicos. Estos se muestran usando la característica de la compra Pantera Pie (Fig. 4C). Entre los 71 genes anotaciones restantes no clasificadas por GOslim, 37 eran los ARN no codificantes, incluyendo miembros de las familias del MIR, scaRNA, snar, SNORA, SNORD y VTRNA. Las transcripciones 34 restantes pudieron ser identificados usando GeneCards. El examen de las transcripciones clasificados por procesos biológicos reveló que un tercio se asociaron con cualquiera de los procesos metabólicos (23%, GO: 0008152) o el ciclo celular (10%, GO: 0007049), en consonancia con las células mitóticamente activas (Fig 4C.). ciclo celular y la mitosis asociados transcripciones en el conjunto de genes altamente expresado incluyendo TPX2, CCNA2, CCNB1 y B2, CDC20, CSK2, CDC2, CDKN3, CENPE, CD28, TOP2A, ORC1L, Nuf2, CDK1, KIF2C, PTTG1 y TTK.
Curiosamente, la lista contiene muchas transcripciones pertinentes a la biología del cáncer de próstata. Por ejemplo, los 3 CTC de paciente 1 expresaron altos niveles de SPINK1, una transcripción y la proteína identificada como elevada en fusión TMPRSS2-ERG cánceres de próstata negativo y asociado con el cáncer de próstata agresivo [30]. CTC de los pacientes 1 y 2 expresan altos niveles de BIRC5 (survivina), un gen de anti-apoptótica expresa en altos niveles en el cáncer de próstata resistente a la castración.