Extracto
La recombinación homóloga (HR) se requiere para el reinicio de las horquillas de replicación del ADN y la reparación colapsadas libre de errores de ADN de doble filamento se rompe (OSD). Sin embargo, HR no programada o hiperactivo puede conducir a la inestabilidad genómica y promover el desarrollo del cáncer. Los factores celulares que restringen los procesos de recursos humanos en células de mamífero recién están comenzando a ser dilucidado. El gen supresor tumoral p53 ha sido implicada en la represión de los recursos humanos a pesar de que sigue sin estar claro por qué p53, como el guardián del genoma, podría poner en peligro un proceso de reparación libre de errores. Aquí, se muestra por primera vez que p53 regula a la baja la formación de focos de la recombinasa RAD51 en respuesta al estrés replicativa en células de cáncer de pulmón H1299 de una manera que es independiente de su papel como un factor de transcripción. Encontramos que esta regulación a la baja de los recursos humanos no sólo es totalmente dependiente en el sitio de unión de p53 con la proteína de replicación A, sino también la serina 15 de sitio de fosforilación ATR /ATM. El análisis genético sugiere que ATR pero no ATM quinasa modula la función de p53 en HR. La supresión de HR por p53 se puede omitir en condiciones experimentales que causan OSD ya sea directa o indirectamente, en consonancia con la función de p53 como un guardián del genoma. Como resultado, p53 transactivación-inactivo no comprometa la resistencia de las células H1299 con el agente de reticulación entre hebras mitomicina C. En conjunto, nuestros datos apoyan un modelo en el que p53 juega un papel anti-recombinogenic en el puesto de control de la replicación de mamífero ATR-dependiente, pero hace no poner en peligro la capacidad de una célula para utilizar recursos humanos para la eliminación de OSD inducida por agentes citotóxicos
Visto:. Sirbu BM, Lachmayer SJ, Wülfing V, Marten LM, Clarkson KE, Lee LW, et al. (2011) ATR-p53 Restringe recombinación homóloga en respuesta al estrés replicativo, pero no limita ADN entre cadenas Crosslink reparación en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (8): e23053. doi: 10.1371 /journal.pone.0023053
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Mayo 2011; Aceptado: July 5, 2011; Publicado: 12 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Sirbu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NCI otorga R01 CA58985 (SNP) y R01 GM076388 (LZ), el Instituto Nacional del cáncer Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE en pulmón CA090578 P50 cáncer (HW, LZ), Departamento de Defensa W81XWH-06-1-0309 (HW ), la porción Federal de ingresos generados por el hospital general de Massachusetts en C06 CA059267, terapia de protones Centro de Investigación y Tratamiento (HW), y Deutsche Krebshilfe (Ayuda German Cancer) 10 hasta 1843-Da (JDD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
intercambios genéticos mediados por secuencias de ADN homólogas deben ser estrictamente regulados para mantener la estabilidad genómica [1]. Se necesita una vía activa la recombinación homóloga (HR) para la reparación y el reinicio de las horquillas de replicación del ADN colapsadas [2]. Las células con defectos en la HR se vean afectados en su capacidad para eliminar enlaces cruzados entre hebras de ADN (ICL) tal como se produce por ejemplo por la mitomicina C (MMC). ADN doble hebra se rompe (OSD) que se producen en la fase S después de la replicación o en el G2 son reparados por HR de una manera típicamente sin errores porque secuencia de ADN homóloga en la cromátida hermana puede servir como una plantilla exacta para su reparación. Por el contrario, los intercambios de ADN espontáneas entre secuencias homólogas en células creciendo vegetativamente tienen que ser limitadas y actividades de recursos humanos en las horquillas de replicación en punto muerto no siempre pueden ser deseables [1], [3], [4]. Los factores anti-recombinogénicas que restringen recursos humanos en células de mamífero recién están comenzando a ser dilucidado.
El supresor de tumores p53 juega un papel fundamental en el mantenimiento de la estabilidad genómica y la supresión de la transformación celular [1], [5] . Como consecuencia de ello, la función de p53 de tipo salvaje es interrumpido por mutaciones genéticas u otros mecanismos en la mayoría, si no todos, los cánceres humanos [5]. p53 ha surgido como un regulador multifuncional, que está en el centro de varias vías de señalización implicadas en la apoptosis, el control del ciclo celular, y la reparación del ADN. Muchas de las funciones de p53 están mediadas por la activación transcripcional de los genes diana [6]. Nosotros y otros han establecido un papel adicional transactivación-independiente de p53 en la supresión de procesos de recursos humanos a través de una variedad de sistemas de células y ensayos de [7], [8], [9], [10], [11], [12] , [13]. Por ejemplo, varias mutaciones de p53 como L22Q /W23S (p53QS), A138V, o V143A, que deterioran la capacidad de p53 para transactivate genes diana, incluyendo p21, no pongan en peligro la capacidad de p53 para regular a la baja HR [10], [14]. p53 parece afectar de recursos humanos a través de diversas proteínas y ADN interacciones directas [8], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23 ]. Una interacción directa con el monocatenario (ss) de la proteína de replicación de unión a ADN-A (RPA) parece inhibir la HR en una primera etapa, y las interacciones adicionales con BRCA2 y RAD51 puede servir al mismo propósito [9], [10], [ ,,,0],24]. Regulación a la baja de los recursos humanos depende de núcleo y de tetramerización dominios intactos de p53 [7], [8], [12], mientras aparece el extremo C-terminal prescindible [12], [13]. Los factores que regulan la supresión de aguas arriba HR mediada por p53 permanecen en gran medida desconocido [25].
múltiples observaciones enlace p53 directamente a la replicación del ADN. p53 co-localiza con los sitios de replicación [26], [27], se expresa en paralelo a la síntesis de ADN cuando las células vuelven a entrar en el ciclo celular [28], y migra hacia el núcleo en la fase S [29], [30] . La replicación de ADN dañado es bloqueado por p53
in-vitro
[31]. Después de inhibición de la elongación de replicación por hidroxiurea (HU), transcripcionalmente inactiva p53 se acumula en la fase S [32]. De acuerdo con estos datos, p53 regula a la baja HR si alargamiento replicación se bloquea [11], [33]. Lo que ha permanecido desconocido es si se requiere la actividad de transactivación de tipo salvaje de p53 por su papel de supresión de la replicación HR-asociado.
P53 es fosforilada directa o indirectamente por el ATM (ataxia telangiectasia mutada) y ATR (ATM y Rad3 relacionada con) las quinasas [34], [35], pero no se han establecido las consecuencias funcionales de estas modificaciones con respecto a la regulación de recursos humanos. ATM responde principalmente a DSBs y fosforila una red de sustratos [36]. ATM afecta tanto a recursos humanos, así como propenso a errores y sin errores de extremos no homólogos de unión [37], [38], [39]. La quinasa ATR juega un papel central en la respuesta al estrés replicativo, y la fosforilación de sustratos ATR inhibe colectivamente la replicación y mantiene las horquillas de replicación, evitando de ese modo la inestabilidad genómica [40], [41]. Es importante destacar que, HR se utiliza para reiniciar la replicación, pero también puede causar eventos inapropiados-capítulo de intercambio en bifurca en punto muerto si no se regula adecuadamente [40], [42]. En comparación con la levadura, las funciones anti-recombinogénicas del puesto de control de la replicación en células de mamíferos, son poco conocidos [40], [42].
A continuación, hemos demostrado por primera vez que la p53 deficiente transactivación regula a la baja en respuesta HR al estrés replicativo. Se establece que la supresión HR por p53 se produce dentro de sólo horas de estrés replicativo y depende de ambos, el sitio de unión RPA y ATR sitio de fosforilación de la serina 15, colocando así p53 en el punto de control de la replicación de los mamíferos. En contraste con el papel de p53 en la respuesta al estrés replicativo, la supresión de la reparación mediada por homología de OSD inducida directa o indirectamente aparece relajado, en consonancia con el papel de p53 como un guardián del genoma.
Resultados
La regulación diferencial de los recursos humanos mediante la transactivación de p53 con impedimentos
se ha demostrado previamente que la p53 suprime la AR, tras la inducción de estrés replicativo [11], [33]. Sin embargo, no se sabía si se requiere la actividad de transactivación de p53 para esta función. Para abordar esta cuestión, hemos utilizado células p53 nulo transfectadas de forma estable con un mutante p53 transactivación con impedimentos previamente caracterizado, p53QS [10]. Nos indujo la formación de focos RAD51 subnuclear por tratamiento de las células con inhibidores de la elongación de replicación, timidina y HU (Figura 1A, y los datos no se muestra). En respuesta a cualquiera de los fármacos, no había una supresión estadísticamente significativa de la formación de focos RAD51 en células p53QS-expresan, en comparación con los controles p53 null (Figura 1BC, Figura S1A). Como control, la magnitud de este efecto fue similar a la HR capacidad de p53 de tipo salvaje endógena suprime, aunque este experimento se realizó en una línea de células diferente, A549 (Figura S1B). En contraste, la Figura 1D muestra que p53QS no modulan la inducción focos RAD51 en las células expuestas a la radiación (IR), que produce OSD largo del ciclo celular ionizante, con cromátidas hermanas OSD que ocurre post-replicación y, en G2 reparado por HR.
(a) imágenes representativas de la formación de focos RAD51 subnuclear en H1299 células que expresan de forma estable p53QS o células p53 nulo tratados con timidina 5 mM (TdR) durante 24 horas. (B) Impacto de la condición de p53 (nulo frente QS) sobre la formación de focos RAD51 en células H1299 tratadas con TdR 5 mM durante 24 horas. Barras representan la media con el error estándar basado en 3 repeticiones independientes. (C) Efecto de la condición de p53 en la formación de focos RAD51 en H1299 células tratadas con hidroxiurea 1 mM (HU) durante 24 horas. Barras representan la media con el error estándar basado en 5 repeticiones independientes. (D) Impacto de estado de p53 sobre la formación de focos RAD51 en células H1299 6 o 16 horas (h) después del tratamiento con 2 Gy de radiación ionizante (IR). Barras representan la media con el error estándar basado en 2-5 repeticiones independientes. Todos los ejes Y indican el porcentaje de las células tratadas con al menos 10 focos RAD51 por núcleo después de restar el porcentaje de células no tratadas con niveles de fondo de focos RAD51. P-valores se basan en la prueba t de Student (dos colas).
Para modelar la reparación de DSB en sustratos se asemejan a las cromátidas hermanas alineados, modificamos un ensayo de recombinación utilizado previamente que hace que las células resistentes al ácido micofenólico sobre HR éxito. El bacteriana
gpt
gen en el pDT219 sustrato de recombinación se inactivó mediante la inserción de un sitio de reconocimiento de I-SceI en el sitio KpnI (Figura 2A). La adaptación de un modelo murino caracterizado previamente para estudiar las propiedades de transactivación-independiente de p53 [13], expresamos transactivación reducida p53-A135V en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) que lleva el sustrato pDT219 que alberga un sitio de reconocimiento para el corte raro-sitio- dirigido de meganucleasa I-SceI (datos no mostrados). Anteriormente puso de manifiesto que este mutante p53 es capaz de suprimir los eventos espontáneos de recursos humanos, de manera análoga a p53QS en las células humanas [10], [13]. Se evaluaron primero el efecto de este mutante para suprimir HR DSB-inducida usando la secuencia donante homóloga pΔ2, que es co-transfectó un vector de expresión de meganucleasa I-SceI. En este sistema, la reparación mediada por homología está mediada por tramos de homología ininterrumpida de 202 pb y 2333 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio de I-SceI, respectivamente. No se detectó una diferencia estadísticamente significativa en las frecuencias de recursos humanos inducidos por el OSD entre las células con y sin p53-A135V (Figura 2B). No hubo diferencias en las eficacias de transfección entre los diferentes clones (datos no mostrados). A continuación, se modificó el plásmido donante para reducir la longitud de compartir homología de secuencia con solamente 188 a 250 pb (pKEB1). Con esta modificación, el efecto supresor de p53 fue estadísticamente significativamente mayor a 10 veces (p & lt; 0,01). Del mismo modo, en un sustrato utilizado comúnmente basado en GFP recombinación, PDR-GFP, en la que HR es mediada por aproximadamente 400 pb de compartido homología de secuencia ininterrumpida flanquea el sitio de I-SceI, la transactivación con impedimentos humano o p53 murino suprimidos HR inducida OSD por varias veces (Figura S2).
(a) plásmido sustrato pDT219 lleva una copia del gen de gpt bacteriano inactivado por inserción de un sitio de reconocimiento de I-SceI en el sitio KpnI única de pSV2-gpt. eventos de recursos humanos fueron inducidos en 10.1 fibroblastos de embrión de ratón que llevan pDT219 por co-transfección de un vector de expresión I-SceI y un donante homóloga. pΔ2 se caracteriza por 202 pb y 2333 pb del ininterrumpida homología de secuencia compartida con pDT217, mientras pKEB1 solamente contiene 188 pb y 250 pb de homología flanquean el sitio de descanso. Después de co-transfección de pKEB1 o pΔ2 junto con un vector de expresión I-SceI, los recombinantes se marcaron en un ensayo de formación de colonias. (B) inducida por I-SceI frecuencias de recursos humanos obtenidos con pDT219 cromosómicamente integradas se representan frente a la condición de p53, (-) indica p53-null, (+) que indica la de deficiente transactivación p53-A135V mutante que es funcionalmente análoga a p53QS. Las barras representan la media geométrica con SEM de 3-6 experimentos independientes. La supresión relativa de HR en presencia de p53-A135V comparación con las células p53 nulo se indica para cada uno de los dos plásmidos donantes. La supresión relativa de recursos humanos se comparó con la prueba t no pareada (dos colas).
En conjunto, estos datos sugieren que p53 regula a la baja la transactivación con deficiencias de recursos humanos en respuesta al estrés replicativo, pero no afecta homología la reparación de DSBs mediada si la longitud de la homología compartida sea superior a & gt; 250-400 pb como sería típico para los intercambios entre cromátidas hermanas. La supresión observada de recursos humanos inducida por el OSD a la presencia de homologías cortos puede no estar relacionado con el papel de p53 en la regulación de la replicación HRR-asociado y que no se prosiguió.
supresión de recursos humanos requiere el sitio serina 15 de p53
en respuesta a la replicación estancamiento tenedor, p53 es fosforilada en la serina 15 (Figura S3 a, B) [34], [43]. Sin embargo, las consecuencias funcionales de esta modificación eran desconocidos. Hemos creado un fosfo-mutante de p53QS mediante la introducción de una serina 15 a la mutación de alanina (p53QS-S15A) (Figura 3A). También generó un mutante de unión de RPA-p53 (p53QM) por los ácidos, además, mutando aminoácidos 53 y 54, que fueron previamente demostrado ser importante para la supresión de HR [10]. Cuando se expresa de forma estable en las células p53 nulo (figura S4), todos de estos mutantes se asociaron con los perfiles del ciclo celular similares en respuesta al tratamiento de timidina (Figura 3B). Como se predijo, p53QM no fue capaz de suprimir la formación de focos RAD51 en las células de la timidina-tratada, y esto se observó en múltiples subclones (Figura 3C, y los datos no se muestra). Sorprendentemente, el bloqueo de la fosforilación de la serina 15 también abrogada por completo la capacidad de regular a la baja p53QS focos RAD51.
(A) Ilustración de mutaciones de p53 N-terminales introducidas por mutagénesis dirigida al sitio. Las construcciones mutantes se expresaron estable de un sitio de integración cromosómica común en células H1299 (ver Materiales y Métodos). distribuciones (B) del ciclo celular para H1299 clones que expresan de forma estable un mutante p53 N-terminal. TdR, timidina 5 mM durante 24 horas. (C) Efecto del estado de p53 en la formación de focos RAD51 timidina inducida, de manera análoga a los experimentos que se muestran en la Figura 1. p-valor, resultado de la prueba t (dos colas) comparar p53QS a las células p53 nulo.
para evaluar qué tan temprano en la respuesta al estrés replicativo se requiere el sitio de p53 S15, se estudió la cinética de la formación de focos. La figura 4 muestra que la formación de focos RAD51 ya se veía afectada dentro de las 6 horas de tratamiento timidina en-S15A p53QS células que expresan p53 nulo e. En consonancia con esta observación, se observó S15 fosforilación en células que expresan p53QS dentro de las 6 horas de tratamiento (Figura S3C). Por otra parte, p53QS suprimió la acumulación local de RPA a las 6 horas, en consonancia con los datos anteriores sobre la capacidad de p53 para inhibir la unión al ADN de una sola cadena, que es un paso necesario para la iniciación de HR (Figura S5) RPA.
El curso temporal de focos RAD51 inducida en timidina tratada H1299 clones se midió de forma análoga a los experimentos que se muestran en la Figura 1.
La dependencia de la supresión de recursos humanos mediada por p53 en ATR
El S15 El sitio de p53 es modificado por ATM y ATR quinasas [34], [44], [45], y ambas quinasas se ha demostrado que la promoción de los recursos humanos en las células con función de p53 de tipo salvaje deteriorada o perdida [39], [46], [47]. Como se esperaba, después del tratamiento con la cafeína, que inhibe la ATR, así como ATM, la capacidad de las células para formar focos RAD51 en respuesta a la timidina fue disminuido en gran medida (Figura 5A). Sorprendentemente, se derogó la capacidad de p53QS para reducir la formación de RAD51 en comparación con las células p53 nulo o p53QS-S15A. Para distinguir entre la función de ATM en comparación con ATR, las células tratadas con el inhibidor KU55933 ATM. En esta configuración, se ha conservado el efecto supresor de la HR p53QS, lo que indica una dependencia del ATR en lugar de ATM. Para confirmar este hallazgo, se trataron las células con siRNA dirigido contra ATR ATR ya que ningún inhibidor específico disponible. Suficiente agotamiento proteína ATR se logró después de la transfección doble siRNA, y células retenidas crecimiento normal durante la duración de 48 horas del experimento (Figura 5B, y datos no mostrados). Como ya se observó, hubo una reducción independiente de p53 de HR en las células tratadas ATR siRNA: el porcentaje de células p53 nulo positivos RAD51 focos se redujo en un 16% en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control, es decir, de 40% a 24% (Figura 4C). En comparación con las células control transfectadas siRNA, la supresión mediada por p53 relativa de HR en las células transfectadas ATR siRNA fue menos pronunciado aunque no abrogado por completo lo que es consistente con la función p53QS residual. En conjunto, estos datos sugieren que ATR regula HR a través dependiente de p53 y mecanismos -independiente.
(A) H1299 clones fueron tratados con timidina (5 mM durante 24 horas) con o sin cafeína concurrente (5 mM) o KU55933 (20 mM) de tratamiento. (B) Western blot que ilustra mediada por el agotamiento de siRNA de ATR en células H1299. sc, revueltos siRNA control. (C) Efecto de la condición de p53QS y el agotamiento de ATR en la inducción RAD51 focos, mide de manera análoga a la figura 1.
p53 no comprometer la respuesta a RAD51 OSD después de la timidina o MMC
HR se utiliza para la reparación de replicación tenedor y reinicio [2], un proceso que no debe ser rechazada por p53, ya que es necesaria para el mantenimiento de la estabilidad genómica y la supervivencia celular. Tras la liberación de una incubación de 24 horas con timidina (como se muestra en la Figura 4), se observó un aumento de la γ-H2AX focos, de acuerdo con la ocurrencia de DSB en las horquillas de replicación colapsados (figura 6A). Hubo un aumento relativo similar en focos RAD51 que era independiente del estado de p53 y consistente con HR-mediada reinicio tenedor (Figura 6B). Por lo tanto, en esta configuración, p53QS no ejerció un efecto supresor sobre la formación de focos RAD51.
(A) Tinción de γ-H2AX como un marcador de la formación de DSB, que ilustra aumento de DSB en ambos clones H1299 dentro de las 4 horas después de la liberación de timidina (5 mM durante 24 horas). (B) Evolución temporal de la inducción RAD51 focos, de forma análoga a la figura 4, después de la extracción de timidina. Para ilustrar el incremento similar en la inducción de focos RAD51 independientemente del estado de p53, el porcentaje de células con focos se normalizó a 0 en el tiempo 0 horas (h), es decir, en el momento de la eliminación de timidina. (C) Efecto de la condición de p53 en focos RAD51 indujo 4 horas después del tratamiento con mitomicina C (MMC) (0,5 mg /ml durante 1 hora). El eje Y indica el porcentaje de células con al menos 10 inducida focos RAD51 por núcleo. Resultados similares se observaron después de 24 horas (datos no mostrados). (D) Efecto de la condición de p53 en la formación de focos γ-H2AX 24 horas después del tratamiento con MMC. El eje Y indica el porcentaje de células con al menos 20 focos inducidos por núcleo. (E) la supervivencia de clones Clonigénicas H1299 con diferentes estado de p53. Todos los puntos de datos se basan en 2-3 experimentos repetidos independientes.
También células expuestas a la MMC agente de reticulación, lo que conduce a la generación de OSD en las horquillas de replicación colapsadas. Consistente con los datos de la Figura 6B, p53QS no suprimió la formación de focos RAD51 en respuesta a MMC (Figura 6C). Es importante destacar que no hubo diferencias en residual focos γ-H2AX en p53 nulo y p53QS células que expresan 24 horas después de la exposición MMC, lo que sugiere que p53 no compromete la reparación de DSB (Figura 6D). Por último, la expresión de p53QS no afectó la supervivencia de las células tratadas con MMC consistentes con los RAD51 y γ-H2AX niveles focos similares células que expresan (Figura 6E). Por el contrario, hubo un aumento ligero pero robusto en la resistencia a la MMC después de la expresión de cualquiera de las formas mutantes de p53. Curiosamente, un resultado similar se observó cuando se expresa el mutante p53-A135V en fibroblastos embrionarios de ratón (Figura S6). Los mecanismos por los que la p53-transactivación inactivo puede promover la supervivencia MMC no se habían determinado (ver Discusión).
Discusión
Mientras que el papel de p53 como un factor de transcripción que controla la apoptosis y la progresión del ciclo celular está firmemente establecidas, una gran variedad de estudios en el pasado & gt; 15 años ha atribuido una multiplicidad de funciones bioquímicas y celulares adicionales para p53 [1], [6]. Una función de transactivación de p53-independiente en la regulación a la baja de los recursos humanos ha sido descrita de forma reproducible por varios laboratorios, incluyendo el nuestro [7], [8], [10], [14], [48]. Debido a que el control cuidadoso de las actividades de recursos humanos es importante para la respuesta a las horquillas de replicación atascadas o colapsados, elucidar el papel de p53 en recursos humanos es fundamental para una mejor comprensión de la iniciación y progresión del tumor.
Hemos demostrado por primera vez que p53 regula a la baja HR en respuesta al estrés replicativa de una manera que es independiente de su papel como un factor de transcripción (Figuras 1, 2, 3). Nuestros datos son consistentes con la idea de que el papel de p53 en recursos humanos depende de las interacciones con el EPR y ATR quinasa, lo que plantea p53 en el puesto de control de la replicación del ATR (Figura 3, 5). En general, las funciones de anti-recombinogénicas del puesto de control de la replicación aún no se han establecido plenamente [40], [49]. En la levadura de fisión, el homólogo de Chk1 inhibe la función Mus81 y Rad60, evitando de este modo la recombinación no deseada [50], [51]. En eucariotas superiores, ATR fosforila BLM, un conocido factor anti-recombinogenic [52], [53]. Por otro lado, ATR se ha demostrado que la promoción de HR [46], [47]. De acuerdo con estos datos, nuestros hallazgos implican que tanto ATR y ATM promueven la formación de focos RAD51 en respuesta al estrés replicativa de una manera independiente de p53 (Figura 5). Por lo tanto, puede existir una regulación positiva y negativa (vía p53) de HR por ATR.
Con respecto a las posibles limitaciones de nuestro trabajo, una limitación inherente de los estudios de focos es que no se puede medir directamente las actividades de proteínas en la replicación horquillas (Figura 1, 3, 4). Sin embargo, los puntos finales focos son ampliamente utilizados en la literatura para determinar los mecanismos moleculares y los determinantes genéticos de recursos humanos [15], [46], [54]. En segundo lugar, una limitación similar se aplica a nuestro sistema de plásmido (Figura 2), que puede no ser una medida precisa de los eventos de recursos humanos fisiológicos que están bajo control p53. En tercer lugar, mientras que todos nuestros y otros datos sugieren que los p53QS humanos mutante y el ratón p53-A135V (o homólogo humano) son funcionalmente equivalentes en términos de supresión de HR de una manera transactivación-independiente (por ejemplo, la figura S2) [7], [10], [12], [13], no podemos excluir la posibilidad de que puedan existir diferencias desconocidas. Por último, también advertimos que los resultados obtenidos con una línea de células, como las células de cáncer de pulmón H1299 en este estudio, no pueden generalizarse fácilmente a otras líneas celulares.
¿Cuáles son los mecanismos moleculares por los que la fosforilación de p53 S15 podría suprimir HR? En un modelo publicado previamente, el secuestro de RPA de ssDNA inhibirá la carga subsiguiente de RAD51, y por lo tanto es un medio por el cual p53 suprime HR [10]. La p53 N-terminal compite con ssDNA para el dominio OB veces de N-terminal de RPA1 [55]. Por lo tanto, se especula que pueden existir mecanismos por los cuales la N-terminal de la fosforilación de p53 promueve la unión a RPA1, lo que afecta la afinidad de unión al ADNmc de los dominios de unión a ADN de RPA. Por ejemplo, la alteración del EPR ssDNA vinculante podría conducir a la liberación programada de EPR de ssDNA menoscabos con la carga adecuada RAD51, p53 o puede atrapar el EPR en ssDNA y retrasar la carga RAD51. Hay fuertes interdependencias entre los sitios de fosforilación de p53 N-terminal [56], [57]. En las células H1299, mutando S15 conduce a la reducción de la fosforilación S37 después de la irradiación [57]. Curiosamente, Lowry et al. encontrado recientemente evidencias de una región colapsada en el dominio de p53 intrínsecamente no estructurada con una estructura de bucle en torno a los residuos 34-36 [58]. Estos autores sugieren que la fosforilación S37 puede dar lugar a una conformación abierta de este dominio y de ese modo promover la unión a RPA1. Por lo tanto, la mutación de S15 deterioraría HR indirectamente a través de un efecto inhibidor sobre la fosforilación de S37 adyacente.
La noción de que p53 puede suprimir la reparación de DSB ha venido de una serie de estudios en términos del efecto de p53 en OSD dirigida al sitio en sustratos de plásmidos integrados cromosómicamente [7], [12], [59]. Se encontró que la magnitud del efecto supresor p53 se correlaciona con la longitud de la homología de secuencia presente (Figura 2, S2). Postulamos que el sistema pDT219 /pΔ2 (Figura 2) es representativa de cromátidas hermanas de reparación debido a la extensión de la disposición de homología de secuencia está en el rango de kilobases. Aunque reconocemos que una comparación entre diferentes sistemas de recombinación tiene salvedades, una dependencia del efecto supresor p53 de la longitud de homología está en excelente acuerdo con un estudio previo de Wiesmüller et al. [12]. Estos autores, que utilizan un panel de sustratos a base de EGFP cromosómicas, demostraron que la regulación a la baja de eventos de conversión de genes de p53 fue particularmente pronunciado cuando la longitud de la homología compartida se redujo a 168-233 pb. Es posible que la p53 crea un umbral entre homologías cortas y largas, que pueden ayudar en la prevención de la reparación propensa a errores y reordenamientos perjudiciales por la desalineación de ADN repetitivo. Tal modelo sería coherente con la observación de que la condición de p53 celular no tiene un efecto directo en la dirección de genes y los intercambios de cromátidas hermanas, que por lo general están mediadas por homologías largos en el orden de kilobases [60]. Este modelo también predice que p53 no afectará negativamente a la reparación de DSB de cromátidas causado por la radiación u otros agentes ionizantes, que está en línea con los datos de supervivencia de células [61]. Nuestros datos también sugieren que el dominio HR medida con un sistema de plásmido basado en I-SceI tales como PDR-GFP (Figura S2) no es siempre una buena marcador sustituto para la reparación HR-dependiente de daño en el ADN exógeno. Además, datos recientes sugieren que la HR reparación de cromosómica I-SCE-inducida OSD es dependiente del ciclo celular y sujeto a regulación transcripcional de p53 (Rieckmann et al., Sin publicar, 2011). Por lo tanto, es posible que las actividades de recursos humanos en respuesta al estrés o la replicación franca OSD están regulados diferencialmente por los de tipo salvaje y variantes mutantes de p53. Tampoco podemos descartar que los efectos reguladores pueden variar entre las líneas celulares.
Por último, p53 no comprometer la respuesta RAD51 focos y la supervivencia celular después de la exposición a la MMC agente de reticulación (Figura 6). Por el contrario, había incluso un ligero aumento en la supervivencia celular tras la expresión de mutantes de p53 de deficiente transactivación (Figura 6E, S6). El mecanismo subyacente queda por determinar, pero puede estar relacionado con una posible estabilización de complejos multi-proteína en el tenedor de replicación por p53 (LMM, HW, datos no publicados). El incremento observado en la resistencia MMC es consistente con otros informes que muestran que, en ausencia de apoptosis, la presencia de p53 se asocia con la resistencia a cisplatino [62], [63], [64]. Por el contrario, en sistemas de células o ensayos susceptibles a la apoptosis, la resistencia a agentes que dañan el ADN es causado por la pérdida de p53 de tipo salvaje [65], [66]. En general, el papel de p53 en la determinación de la supervivencia celular en respuesta a daños de ADN es claramente compleja y un reflejo de múltiples funciones de p53 en la apoptosis, el control del ciclo celular, y la recombinación de ADN. El estudio de estas cuestiones en los sistemas celulares definidos es una vía prometedora de investigación con potencial relevancia clínica para el tratamiento de tumores malignos mayoría de los cuales han perdido la función de p53. Además, la importancia biológica de la función de p53 en la regulación de recursos humanos, especialmente en relación con su papel en la supresión tumoral, aún no se ha establecido.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
células de cáncer de pulmón NCI-H1299 (p53-null) se obtuvieron de la ATCC y su uso ha sido publicado previamente [10]. células de cáncer de pulmón A549 también se obtuvieron de la ATCC. Fibroblastos embrionarios de ratón (BALB /c 3T3 10.1 clon, p53 nulo) fueron un regalo del Dr. Arnold Levine y su uso ha sido publicado [14], [61]. clones H1299 /FRT portadoras de diferentes mutantes de p53 se generaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Flp-In, Invitrogen). Brevemente, las células H1299 fueron electro-transfectadas con pFRT /LacZ seguido de zeocina selección (100 g /ml, Invitrogen) para establecer integrantes cromosómicos. Se seleccionaron los integrantes de una sola copia con baja actividad transcripcional basado en el reportero β-galactosidasa co-integrado para la transfección con construcciones diferentes pcDNA5 /FRT-p53, al mismo tiempo que pOG44 para la integración dirigida en el sitio FRT aceptor. Después de la selección con 400 mg /ml de higromicina (Invitrogen), las colonias se expandieron y se obtuvieron lisados de células enteras para evaluar la expresión de proteínas. Para algunos experimentos, las células H1299 lleva una p53QS azar integrado construyen (PRC /CMV L22Q /W23S, proporcionado amablemente por Anindya Dutta) fueron utilizados. MEFs se transfectaron con un vector de expresión para p53-A135V y seleccionaron con 500 g /ml de G418 (Fisher Scientific), como se describe anteriormente [13]. Todas las líneas celulares de la prueba libre de micoplasma.
ARN de interferencia
ATR fue el blanco de un oligonucleótido de siRNA previamente utilizado y validado, 5'-CCUCCGUGAUGUUGCUUGAtt -3 '(Applied Biosystems) [67]. Crecimiento exponencial células H1299 se sembraron 16 horas antes de la transfección. ATR siRNA o un control mezclado se diluyó en 100 l Opti-MEM (Roche) para dar una concentración final de 100 nM, y se mezclaron con 10 l de reactivo de transfección X-tremeGENE (Roche) en 100 l de Opti-MEM. La formación de complejos se dejó proceder durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de la adición gota a gota a las células. complejos de siRNA se incubaron con las células durante 4 horas, momento en que se cambiaron las células a tiempo medio de crecimiento normal. La transfección se llevó a cabo dos veces, 24 horas de diferencia, para lograr la precipitación óptima. Lisados de células enteras se obtuvieron a las 24 y 48 horas. Los lisados se desnaturaliza y se reducen, a continuación, se ejecutan en gel 3-8% Tris-Acetato (Invitrogen) durante 2,5 horas a 150 V. Las muestras se transfirieron a una membrana de PVDF con un aparato de semi-seco (BioRad) durante 1 hora a 12