Extracto
ácido trans-retinoico (ATRA) ha sido ampliamente investigado para los tratamientos de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata.
HOXB13
, silenciados en los receptores de andrógenos-negativo (AR
-) las células del cáncer de próstata, juega un papel en la AR
- la detención del crecimiento de células de cáncer de próstata. En este estudio se intentó dilucidar los mecanismos que están implicados en la inhibición de la proliferación de AR
- las células de cáncer de próstata desencadenados por ATRA. Descubrimos que el ATRA fue capaz de inducir la detención del crecimiento y para aumentar
HOXB13
expresión en AR
- las células del cáncer de próstata. Tanto EZH2 y DNMT3b participaron en la represión de
HOXB13
expresión a través de un mecanismo epigenético que implica ADN y metilación de las histonas modificaciones. En concreto, EZH2 reclutó DNMT3b a
HOXB13
promotor para formar un complejo de represión. Por otra parte, el ATRA puede regular al alza
HOXB13
través de la disminución EZH2 y Dnmt3b expresiones y reduciendo sus interacciones con el
HOXB13
promotor. Al mismo tiempo, el nivel de metilación del
HOXB13
promotor se redujo en el tratamiento de ATRA. Los resultados de este estudio implicaron un nuevo efecto de ATRA en la inhibición del crecimiento de AR
-. Células de cáncer de próstata humano resistentes a través de la alteración de los
HOXB13
expresión como resultado de las modificaciones epigenéticas
cita: Liu Z, Ren G, C Shangguan, Guo L, Dong Z, Li Y, et al. (2012) ATRA inhibe la proliferación de las células del cáncer de próstata DU145 través de la reducción del nivel de metilación de genes HOXB13. PLoS ONE 7 (7): e40943. doi: 10.1371 /journal.pone.0040943
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Abril, 2012; Aceptado: 15 de Junio de 2012; Publicado: 13 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30971613, 31071149, 91019011, 30800557), y los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades central (09ZDQD01). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común en hombres en Europa, América del Norte y en varios países de África [1], [2]. La incidencia de cáncer de próstata ha aumentado tras el envejecimiento de la población en todo el mundo [3]. En la actualidad, las terapias convencionales tales como el tratamiento de la cirugía y de la hormona con frecuencia fallan para lograr el efecto satisfactorio. Además, las células cancerosas pueden adquirir las características de resistencia a la hormona y de la droga en virtud de estas tensiones de tratamiento [4]. Hasta el momento, han logrado esfuerzos para conquistar esta enfermedad maligna éxito limitado [5]. Por lo tanto, las investigaciones dirigidas al desarrollo de estrategias terapéuticas nuevas y más eficaces para el cáncer de próstata siguen siendo una oportunidad abierta.
HOXB13
gen pertenece a una gran superfamilia homeobox, muchos de los cuales son factores de transcripción que regular la especificación regional axial durante el desarrollo embrionario [6], [7]. expresión limitada de
HOXB13
se observó en la medida de caudal de la médula espinal, seno urogenital, y las células del colon y del recto de una manera independiente de andrógenos; pero expresa en la próstata con notable especificidad tisular para mantener su función fisiológica normal y para inducir la diferenciación terminal [8], [9].
HOXB13
es silenciado en los receptores de andrógenos-negativo (AR
-) las células del cáncer de próstata. Jung
et al
. [5] mostró que la expresión ectópica de
HOXB13
en una línea celular de cáncer de próstata inducida G1 detención del ciclo celular a través de la regulación negativa del factor-4 de las células T, pero no dio lugar a un cambio en la tasa de apoptosis. La sobreexpresión de
HOXB13
en AR
- células de cáncer de próstata dio lugar a una inhibición significativa del crecimiento celular [10]. Sin embargo, el mecanismo subyacente a este silenciamiento génico no se entiende completamente. Recientemente, hemos investigado las funciones del grupo Polycomb (PcG) proteínas y sus acciones epigenéticos en el silenciamiento de
HOXB13
en células de cáncer de próstata, y encontramos que había una interferencia entre la acetilación de histonas y los miembros de las proteínas PGC sobre la represión de la
HOXB13
expresión [11]. En este estudio, hemos proporcionado evidencia adicional de que las metiltransferasas de ADN (DNMTs) y proteínas PcG sinérgicamente inhibieron
HOXB13
actividad promotora.
-trans-retinoico (ATRA), el metabolito de vitamina A, obras de teatro un papel esencial en el desarrollo mediante la regulación de procesos celulares tales como la proliferación, la diferenciación y la migración [12]. ATRA implementa su efecto específico superfamilia de receptores nucleares de unión, los receptores del ácido retinoico (RAR). Los RARs formar un heterodímero con el retinoide X-receptor [13]. Estudios anteriores revelaron que el tratamiento de células leucémicas con ATRA dio como resultado la apoptosis, presumiblemente secundaria al proceso de diferenciación [14], [15]. Desde ATRA puede rectificar el crecimiento celular aberrante e inducir la apoptosis, se ha investigado ampliamente en ensayos preclínicos y clínicos para el tratamiento de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata y el cáncer temprano gástrico [16], [17]. En AR
- y las células de cáncer de próstata DU145 resistente drogas, ATRA se demostró aumentar la sensibilidad de las células a Anticancer agente docetaxel; sin embargo los mecanismos de lo sola ATRA induce la detención del crecimiento de las células siguen sin estar claros [18].
proteínas de ACV son represores global de la expresión génica a través de la formación de complejos Polycomb represivas (República Popular China), tales como PRC1 y PRC2 [19]. Varias proteínas PcG han sido implicados en las actividades oncogénicas [20]. Ha habido indicios de que se incrementa la actividad represora PcG durante la progresión del cáncer de próstata [21]. Por otra parte, algunos
PcG
También se encontraron productos de los genes que son necesarios para el silenciamiento estable de
Hox
genes a lo largo de
Drosophila
desarrollo [22]. Potenciador de Zeste Homologue 2 (EZH2), la subunidad catalítica de PRC2, posee una actividad histona metiltransferasa de histona 3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), que establece una señal represivo fuerte para la expresión de genes [19]. Se ha demostrado que la sobreexpresión ectópica de
EZH2
no sólo estimula la proliferación celular, sino que también promueve el crecimiento y la invasión celular independiente de anclaje
in vitro
[20]. Por el contrario, el agotamiento de los
EZH2 fotos: por pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) inhibe la proliferación celular y la apoptosis inducida en la próstata, de mama, de colon y de células de cáncer [23], [24], [25].
la metilación del ADN es una modificación epigenética importante que influye en la transcripción de genes. metilación del ADN en las células de mamífero se establece y mantiene por DNMTs. La metilación se inicia por DNMT3a altamente homólogos y DNMT3b, y heritably propaga por DNMT1 [26]. Entre estos tres enzimas, la regulación positiva de
DNMT3b
es una característica de muchas células cancerosas, y DNMT3b puede jugar un papel causal en la tumorigénesis [27]. Los estudios realizados en un modelo de ratón mostraron que la sobreexpresión de
DNMT3b
, pero no
DNMT3a
, promueve la tumorigénesis de colon en
ApcMin /+
ratones [28]. Un estudio previo demostró que la expresión de
HOXB13
fue controlado de manera dependiente de la metilación y su metilación se correlacionó positivamente con el grado del tumor y la invasión microvascular [29]. En las células de cáncer de colon,
HOXB13
, como un objetivo de DNMT3b, fue metilado en una isla CpG aguas arriba, y funcionó como un supresor tumoral en los tumores primarios de colon [26].
Desde hace DNMT3b no tienen dominios de unión al ADN, se necesita de transcripción co-factores para interactuar con secuencias de genes específicos [30]. Se ha sabido que muchos miembros de PCG como EZH2, poseen los dominios de unión de
HOXB13
promotor, y suprimir
HOXB13
expresión a través de la metilación de histonas [31]. Significativamente, EZH2 se ha implicado a desempeñar un papel clave en la mediación tanto de metilación de las histonas y la metilación del ADN de
HOXB13
gen en algunas células del cáncer [21], [32]. Además, hemos informado anteriormente que YY1 y la histona deacetilasa 4 (HDAC4) afectó el crecimiento de células de cáncer de próstata mediante la represión de
HOXB13
transcripción a través de la modificación de histonas [11]. Estos datos disponibles nos intrigó a especular que EZH2 podría ser capaz de reclutar a DNMT3b
HOXB13
promotor de reprimir su expresión a través de determinadas modificaciones epigenéticas.
El propósito de este estudio fue determinar los mecanismos que están implicados en la inhibición de la proliferación en AR
- células de cáncer de próstata desencadenados por ATRA. Nuestros resultados revelaron que ATRA inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata DU145 a través de la regulación positiva de
HOXB13
expresión reduciendo su nivel de metilación. Esto se logró mediante ATRA poner trabas a la acción de la EZH2 y DNMT3b, que son responsables de la metilación de
HOXB13
promotor. Los datos se deshicieron de este estudio pueden proporcionar pistas útiles para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la AR
- cáncer de próstata que implican el uso de ATRA y modificadores epigenéticos
Resultados
HOXB13 estaba involucrado. en inducida por ATRA DU145 crecimiento celular Arrest
ATRA se informó a ser capaz de inducir la detención del crecimiento celular, pero el mecanismo no está completamente claro. La sobreexpresión de HOXB13 en AR
- células de cáncer de próstata puede también dar lugar a una inhibición significativa del crecimiento celular. Para aclarar si HOXB13 juega un papel en la detención del crecimiento inducida por ATRA en células de cáncer de próstata, primero a prueba la tasa de supervivencia de las células en relación al tratamiento de ATRA. células DU145 se expusieron a concentraciones crecientes de ATRA (de 20 a 120 mM) durante 24, 48 y 72 h. Como se evidencia en la Fig. 1A y 1B, de hecho ATRA inducen la detención del crecimiento celular en las células DU145 de una manera dependiente de la dosis. Se observó alta citotoxicidad en 72 h. Mientras tanto, tanto HOXB13 ARNm y los niveles de proteína fueron elevados en las células DU145 por tratamiento ATRA (Fig. 1C). Además, verificó el efecto de ATRA en otro AR
- La línea celular del cáncer de próstata PC-3, y se observó el efecto dependiente de la dosis similar de ATRA sobre la detención del crecimiento celular, según lo revelado por ensayos de MTT (Figura S1.). Mientras tanto, tanto HOXB13 ARNm y los niveles de proteína también se elevaron en el tratamiento ATRA (Fig. S2).
(A) Efecto dependiente de la dosis de ATRA en la detención del crecimiento de células DU145. células DU145 se trataron con varias concentraciones de ATRA para 72 h. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 (n = 6). (B) Evolución temporal de la detención del crecimiento efecto de ATRA en células DU145. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 (n = 6). (C) ATRA aumento de la expresión en las células DU145 HOXB13. células DU145 se trataron con 80 M de ATRA para 72 h. ARN total fue extraído por RT-PCR (
uppe
r), y los extractos celulares totales se preparó para el Western Blot (
menor
). (D) La detención del crecimiento de células DU145 inducida por ATRA se invirtió parcialmente por supresión de la expresión HOXB13. El crecimiento celular potente se midió por ensayos MTT. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 (n = 6) guía empresas
A continuación, para poner a prueba el papel de HOXB13 en atra-. detención del crecimiento celular mediada DU145, transfectadas transitoriamente el
HOXB13
plásmido ARNsi en células DU145 tratadas con ATRA. La construcción y la eficiencia de interferencia de la HOXB13 siRNA fueron descritos en nuestro informe anterior [11]. Encontramos que desmontables de HOXB13 de siRNA aparentemente revirtió la detención del crecimiento celular inducida por ATRA (Fig. 1D). Esto implicó que la detención del crecimiento de células DU145 inducida por ATRA se asoció, al menos en parte, con la expresión de HOXB13.
DNMT3b Participó en la represión transcripcional HOXB13
HOXB13
gen se silencia en AR
- células de cáncer de próstata y la sobreexpresión de HOXB13 en AR
- células de cáncer de próstata dio lugar a una inhibición significativa del crecimiento celular [10]. Estamos entonces a analizar los acontecimientos moleculares que están implicados en
HOXB13
silenciamiento de genes en AR
- las células del cáncer de próstata. El promotor de
HOXB13
frecuencia se ha informado que se hypermethylated en diversos tipos de cáncer [33]. Para aclarar si el silenciamiento de
HOXB13
génica está mediada por la hipermetilación del ADN en AR
- las células del cáncer de próstata, se evaluó el estado de metilación de la
HOXB13
promotor mediante el uso de la PCR-secuenciación de bisulfito (BSP), y hemos encontrado que los
HOXB13
promotor fue metilado con mayor intensidad en las células DU145 en comparación con la de las células LNCaP malignas humildes (Fig. 2A, B).
ensayos de BSP mostró la metilación de islas CpG en el promotor HOXB13 en las células DU145 altamente malignos (a) y en las células LNCaP malignas humilde (B). (C) HOXB13 se upregulated en las células DU145 transfectadas con el plásmido DNMT3b siRNA, en comparación con las células transfectadas con el vector de control de siRNA. (D) BSP ensayos mostraron que el nivel de metilación del promotor HOXB13 reducida en las células DU145 transfectadas con siRNA DNMT3b (
menor
), en comparación con el control de siRNA (
superior).
Dado que el ADN metiltransferasa DNMT3b juega un papel importante en la metilación de los genes relacionados con el cáncer, y
HOXB13
se informó de que un gen diana de DNMT3b en los tumores primarios de colon [26], [27], nos especuló que DNMT3b también pueden estar involucrados en
HOXB13
transcripcional represión en células DU145. Para comprobar esta hipótesis, derribaron la expresión DNMT3b con un siRNA, y se encontró que la expresión HOXB13 fue aparentemente aumenta en las células DU145 y la eficiencia de interferencia de la DNMT3b siRNA se muestra (Fig. 2C). Los resultados de los ensayos de BSP mostraron que el nivel de metilación de
HOXB13
promotor en DU145 se redujo después de la precipitación de la DNMT3b endógeno (Fig. 2D, inferior), en comparación con las células de control (Fig. 2D superior). Estos resultados sugieren que la modificación metilación del ADN mediada por DNMT3b fue responsable del silenciamiento de
HOXB13 Hoteles en células DU145.
Las proteínas del PCG EZH2 y IMC1 participado en la represión transcripcional HOXB13
a continuación, nos sirve para determinar el factor de transcripción (s) que pueden participar en la regulación de
HOXB13
. Las proteínas PcG han informado a desempeñar un papel en la progresión de los cánceres de próstata y de mama, así como en el silenciamiento de
HOXs
[3], [21], [34], [35]. Primero se determinó que las expresiones de proteínas PcG EZH2 y IMC1 fueron significativamente mayores en las células DU145 altamente malignas que en las células LNCaP malignas humilde, y sus expresiones se correlacionaron negativamente a la expresión HOXB13, según lo revelado por RT-PCR y Western Blot (Fig. 3A, B).
El ARNm (A) y los niveles de proteína (B) de IMC1, EZH2 y HOXB13 en diferentes células de cáncer de tumores malignos de próstata, LNCaP y DU145. (C) Los niveles de mRNA de la EZH2 HOXB13 y en células DU 145 transfectadas con siRNA plásmido EZH2. (D) Los niveles de mRNA de HOXB13 y IMC1 en células DU 145 transfectadas con siRNA IMC1 plásmido. (E) Los niveles de proteína de HOXB13 y EZH2 en las células DU145 transfectadas con siRNA plásmido EZH2. (F) Los niveles de proteína de HOXB13 y IMC1 en células DU 145 transfectadas con siRNA plásmido IMC1.
Para aclarar aún más si EZH2 y IMC1 participaron en
HOXB13
transcripcional represión en el cáncer de próstata DU145 las células, se construyó EZH2 siRNA y BMI1 siRNA plásmidos y los transfectados en células DU145, respectivamente. Hemos detectado que tanto ARNm HOXB13 (Fig. 3C, E) y proteína (Fig. 3D, F) se upregulated niveles de EZH2 y cuando IMC1 fueron derribados. Las eficiencias inhibitorios de estos plásmidos en siRNA endógeno EZH2 y BMI1 en mRNA y los niveles de proteína se muestran (Figura 3C, D y E, F). Estos resultados indican que la EZH2 y IMC1 pueden reprimir la expresión HOXB13 por mediación de la modificación de las histonas metilación.
DNMT3b fue reclutado para HOXB13 Promotor por EZH2
Como co-represores de la transcripción, DNMTs no poseen canónica ADN vinculante dominios y por lo general son reclutados para regiones específicas de la cromatina por factores de transcripción [26], [30]. Significativamente, EZH2 se ha informado a desempeñar un papel clave en la mediación tanto de metilación de las histonas y la metilación del ADN de
HOXB13
gen en algunas células del cáncer [21], [32]. A continuación, queríamos determinar si EZH2 recluta DNMT3b a
HOXB13
promotor. Realizamos ensayos de chip para detectar cambios en la asociación de EZH2 en las tres regiones definidas (P1-P3) de la
HOXB13
promotor de la caída de la EZH2 endógena. La región P4 lejos aguas arriba se eligió como control negativo (Fig. 4A). Los resultados de chip demostraron que la abundancia de EZH2 en P1-P3 de
HOXB13
promotor se redujo cuando EZH2 endógena fue suprimida por
EZH2
siRNA en las células DU145. Al mismo tiempo, el nivel H3K27me3 asociado con la función EZH2 en P1-P3 fue aparentemente redujo (Fig. 4B).
(A) Diagrama de la Anking región 5 'del gen fl HOXB13. P1, P2 y P3 indican las tres regiones promotoras de genes HOXB13 analizado en los ensayos de chip, y P4 es un control negativo distal. ensayos (B) de chip en las células DU145 transfectadas con siRNA EZH2 y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-EZH2 y el anticuerpo anti-H3K27me3, respectivamente. ensayos (C) CoIP para detectar la asociación de DNMT3b con EZH2 en las células DU145. Celulares se prepararon extractos nucleares y se precipitaron con anti-EZH2 o anti-DNMT3b anticuerpo, y se detectaron por inmunotransferencia con anti-DNMT3b o anticuerpo anti-EZH2. (D) los ensayos de chip se realizaron en células DU145 transfectadas con siRNA EZH2 y el ADN se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-DNMT3b. Las cantidades de ADN precipitado se determinaron por PCR.
Por otra parte, los ensayos CoIP con extractos de células DU145 revelaron que los complejos se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-anti-EZH2 DNMT3b o, y podría ser detectada en inmunotransferencia por el anti los anticuerpos anti--EZH2 o Dnmt3b, respectivamente (Fig. 4C), sugiriendo que DNMT3b y EZH2 estaban presentes en el mismo complejo. Nuestros datos de chip en la Fig. 4D indicó, además, que la abundancia de DNMT3b en las tres regiones promotoras (P1-P3) se redujo a la caída de endógeno EZH2. Por lo tanto, estos resultados proporcionaron pruebas de que DNMT3b se reclutó a
HOXB13
promotor mediante EZH2.
ATRA Deterioro de EZH2 y DNMT3b Expresión y debilitó sus interacciones con HOXB13 Promotor
Hemos demostrado por encima de ese HOXB13 se downregulated de EZH2 y DNMT3b, y el tratamiento con ATRA dado lugar a un aumento de
HOXB13
expresión en células DU145. Para comprobar nuestra hipótesis de que el ATRA puede facilitar la expresión HOXB13 a través de menoscabar los efectos reguladores negativos de la EZH2 y DNMT3b en HOXB13, hemos examinado la expresión EZH2 y DNMT3b en las células DU145 tratados con ATRA 80 M, y 5-aza-2'- desoxicitidina (5 -aza-dc) se utilizó como el control de desmetilación. Los resultados mostraron que las expresiones de tanto EZH2 y DNMT3b se downregulated por tratamiento ATRA, tanto en los niveles de proteína y ARNm (Fig. 5A, B). Resultados similares se obtuvieron de un estudio paralelo utilizando otro AR
-. línea celular de cáncer de próstata maligno PC-3 (Fig. S2)
El tratamiento de 80 M de ATRA regula positivamente HOXB13 y downregulated EZH2 y expresiones en Dnmt3b nivel de ARNm (a) y el nivel de proteína (B) en las células DU145. 5-aza-DC se utilizó como control positivo desmetilación. Control 1 era etanol absoluto y el control isopıcnico 2 fue ácido acético isopıcnico (C) ATRA deteriora las ataduras de la EZH2 y DNMT3b, y redujo el nivel H3K27me3 al promotor HOXB13. ensayos de chip se realizaron en células DU145 tratadas con 80 M ATRA y se inmunoprecipitaron con anti-H3K27me3, anti-DNMT3b o anticuerpo anti-EZH2. Las cantidades de precipitado endógeno promotor HOXB13 ADN se determinaron por PCR. (D) BSP ensayos mostraron que la reducción de la metilación del promotor HOXB13 en las células DU145 después del tratamiento a 80 M ATRA, en comparación con el control sin tratar.
Nuestros ensayos de chip demostrado además que los enlaces de EZH2 endógena y DNMT3b en
HOXB13
promotor se redujo después del tratamiento con ATRA, y mientras tanto los niveles H3K27me3 en regiones P1-P3 aparentemente se redujo (Fig. 5C).
por otra parte, los ensayos de BSP reveló que el tratamiento con ATRA resultó en la reducción de nivel de metilación de las islas CpG en
HOXB13
promotor en contraste con la de las células DU145 no tratados (Fig. 5D). Al parecer, EZH2 reclutó DNMT3b a
HOXB13
promotor y provocó el silencio de genes mediante la inducción de la H3K27me3 y mediante el aumento de la metilación de las islas CpG. Por su parte, tanto la metilación del ADN y H3K27me3 de
HOXB13
promotor podrían reducirse en ATRA.
Discusión
ATRA juega un papel esencial en el desarrollo mediante la regulación de diversos procesos celulares y ha sido ampliamente investigado en ensayos preclínicos y clínicos como un agente para el tratamiento de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico precoz y el cáncer de próstata [16], [17]. Además, HOXB13 ha demostrado desempeñar un papel en la detención del crecimiento en AR
- de próstata [10], el cáncer colorrectal [26] y el carcinoma de células renales [29]. En línea con estos datos anteriores, los resultados de este estudio demostraron que el ATRA fue capaz de inducir la detención del crecimiento de dos AR
- (. La Fig. 1A y Fig S1) células de cáncer de próstata DU145 y PC-3 de una manera dependiente de la dosis , y este efecto se logró parcialmente a través de la promoción de HOXB13 mRNA y la producción de proteínas (Fig. 1C y S2, S3). Por el contrario, un informe reciente describió que desmontables de HOXB13 endógena por la interferencia de ARN en líneas celulares de cáncer de ovario humano se asoció con la proliferación celular reducida [36]. Estas descripciones contradictorias pueden ser el resultado de la diferencia aparente entre los órganos de ovario y otros, ya que es HOXB13 no expresado en el ovario normal [36], mientras que se expresa en un nivel alto en la próstata normal y el riñón [5], [29]. Sin embargo, los datos presentados en este informe proporcionan evidencia de que el tratamiento con ATRA inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata DU145, a través de un mecanismo que implicó la regulación al alza de HOXB13 mediante la reducción del nivel de metilación en el promotor del gen.
metilación del ADN y es catalizada mantenido por DNMTs. Ciertos DNMTs, expresadas en niveles relativamente bajos en las células somáticas, con frecuencia se upregulated en las células cancerosas. Los estudios de ganancia de función mostraron que DNMT3b pero no DNMT3a promueve la tumorigénesis de colon en APC
Min /+ ratones mediante la inducción de
metilación de novo
de múltiples genes que albergan las islas CpG [26]. También había indicación de que el agotamiento de DNMT3b produjo un aumento de tasa de apoptosis y la migración reducida de las células de cáncer de próstata PC-3 [37]. En este estudio, mostramos que la expresión HOXB13 fue silenciado en DU145 (Fig. S4), y los ensayos de BSP revelado que su silencio puede estar relacionado con la hipermetilación del promotor del gen (Fig. 2A). Se informó de que
HOXB13
gen era un objetivo de DNMT3b en células de cáncer de colon [26]. Por lo tanto, es importante entender la función de DNMT3b en el silenciamiento de
HOXB13
gen en células de cáncer de próstata DU145. Nuestros resultados demuestran que DNMT3b podría regular
HOXB13
transcripción a través de la alteración de la modificación de metilación del ADN en el promotor de gen, aunque desmontables de DNMT3b no redujo la metilación de CpG en
HOXB13
promotor como se esperaba (Fig. 2C, D). Al parecer, pueden existir otros mecanismos subyacentes a la mediada por DNMT3b
HOXB13
represión
.
En particular, normal y los patrones de metilación aberrante pueden ser mediados por proteínas de la cromatina rectores metiltransferasas de ADN de sus genes diana [38] . Más recientemente, se informó de la proteína EZH2 PcG para reclutar metiltransferasas de ADN, especialmente DNMT1 y DNMT3b, para poner en práctica el silenciamiento de la
Myt1
y
WNT1
loci través de la metilación del ADN [21], [32 ]. La sobreexpresión de EZH2 por lo general se produce en un diverso de enfermedades malignas, incluyendo los cánceres de próstata, de mama y de hígado, especialmente en casos avanzados [39]. Varambally
et al
[40] llegó a la conclusión de que la expresión desregulada de EZH2 puede ser una causa de la progresión del cáncer de próstata, además de ser un marcador que distingue el cáncer de próstata indolente de aquellos en riesgo de progresión letal. Nuestros resultados sugieren que PcGs participó en el desarrollo del cáncer de próstata. Hemos demostrado que la expresión de EZH2 y BMI1 era mucho mayor en las células DU145 que en las células LNCaP (Fig. 3A, B). Más interesante, encontramos que PcGs suprimió la expresión en células DU145 HOXB13. RT-PCR y ensayos de transferencia Western mostraron que la expresión HOXB13 se upregulated cuando EZH2 y BMI1 fueron derribados (Fig. 3C, D, E y F). Además, nuestros ensayos de chip revelaron que EZH2 era capaz de unirse directamente a la
HOXB13
promotor (Fig. 4B), y esto puede ser un mecanismo de silenciamiento de
HOXB13
en el cáncer de próstata maligno DU145 las células.
Se ha propuesto que la EZH2 reprime la transcripción de genes diana principalmente a través de dos mecanismos diferentes. El primero implica la unión de EZH2 para el promotor del gen diana para inducir la modificación H3K27me3, disminuyendo de ese modo la actividad del promotor [39], [41]. El segundo mecanismo sugiere que EZH2 recluta a un co-represor o complejo, tal como DNMT1 y DNMT3b, al promotor y este co-represor ya sea negativa afecta a otros factores que están presentes, o altera la estructura de la cromatina local para facilitar la represión [30], [35]. Al parecer, los resultados de este estudio están de acuerdo en general con ambos de los dos modelos. Específicamente, nuestros datos demostraron que EZH2 era capaz de unirse directamente a la
HOXB13
promotor para inducir la modificación H3K27me3 (Fig. 4B). Mientras tanto, nuestros datos también sugieren que EZH2 puede reclutar DNMT3b a
HOXB13
promotor para afectar el estado de metilación y por lo tanto reprimir la transcripción de genes (Fig. 4C, D). Estos resultados proporcionan evidencia adicional para una diafonía entre los dos mecanismos epigenéticos distintas en el gen silencio.
ATRA se utiliza generalmente en combinación con otros fármacos, tales como docetaxel, TSA y ácido zoledrónico en la terapia del cáncer de próstata [18], [42], [43], pero el mecanismo molecular de acción ATRA no está claro. El hecho de que la EZH2 recluta DNMT3b a la
HOXB13
promotor para reprimir la expresión génica, y que el tratamiento con ATRA en la regulación positiva de la expresión HOXB13, nos intrigó a proponer una hipótesis que el ATRA puede regular al alza HOXB13 través de la disminución de la nivel de metilación del gen inducido por la EZH2 y DNMT3b. Los resultados de este estudio validan que las expresiones de
EZH2
y
DNMT3b
disminuyeron después del tratamiento con ATRA, tanto en DU145 y PC-3 líneas celulares (Figura 5A, B y Fig. S2, S3 ). Además, los enlaces de EZH2 y DNMT3b sobre la
HOXB13
promotor y el nivel H3K27me3 con lo que se reduce en las células DU145 tratados con ATRA (Fig. 5C). Curiosamente, los ensayos de BSP revelaron que el nivel de metilación del ADN de la
HOXB13
promotor también se redujo en las células DU145 tras el tratamiento con ATRA (Fig. 5D).
Hay tres
RAR
genes, es decir,
RAR, β
y
γ
en las células, y todo lo que se requiere para la función de ATRA. Desde
RARβ
es silenciado en las células DU145, la sensibilidad de las células DU145 a ATRA es menor que la de las células LNCaP [44]. Mientras tanto, también se examinó el efecto de ATRA en 293 y 293T células, las dos líneas de células embrionarias de riñón humano normal. Como se esperaba, la sensibilidad de estas células a ATRA fue mayor que en las células DU145 (Fig. S5a). Notablemente, el tratamiento de la AR
- las células de cáncer de próstata con ATRA no cambiaron las expresiones de HOXB13, EZH2 y DNMT3b a nivel de mRNA (Fig S5B.), Lo que implica un mecanismo de acción diferente ATRA en este fondo de la celda en particular. Presumiblemente, las modificaciones epigenéticas mediadas por ATRA describen en este informe puede probablemente ser restringida a ciertos tipos de células cancerosas como AR
- las células del cáncer de próstata, ya que no ha habido informes de las modificaciones epigenéticas mediadas por ATRA en células normales hasta la fecha. Del mismo modo, las células PC-3 más malignas y resistentes a los medicamentos mostraron una sensibilidad aún mayor de ATRA que las células DU145 (Fig. S1).
Un informe anterior se deshizo de que la expresión reducida DNMT3b dio como resultado la hipometilación del
retinoblastoma (Rb)
,
RARβ
, y
poliposis adenomatosa coli (APC)
de genes promotores [37]. Presumiblemente, regulación a la baja de DNMT3b puede potenciar en parte la sensibilidad de las células DU145 a ATRA, y esto puede establecer una retroalimentación positiva entre el tratamiento ATRA y la regulación a la baja de DNMT3b para facilitar la expresión HOXB13, y por lo tanto para inducir la detención del crecimiento de las células DU145. En este estudio, se encontró que ATRA fue capaz de regular por incremento la expresión de HOXB13 y para inducir a las células DU145 detención del crecimiento como resultado de la metilación del nivel reducido de
HOXB13
. Esto plantea una cuestión de si un efecto sinérgico entre los inhibidores de ATRA y DNMTs, por ejemplo 5-aza-DC, existe. Los resultados de nuestro MTT y experimentos de PCR en tiempo real apoyaron esta hipótesis, ya que el tratamiento simultáneo de ATRA y 5-aza-DC exhibió una mucho más fuertes efectos inhibitorios a las células DU145 que cada uno de los dos fármacos solos (Fig. S6). Mientras tanto, la expresión de HOXB13 se reguló, pero ambos EZH2 y DNMT3b se downregulated notablemente en el tratamiento de los dos fármacos (Fig. S7).
En conjunto, los datos presentados en este informe apoyan un modelo de trabajo en el que HOXB13 , EZH2 y DNMT3b están implicados en la detención del crecimiento celular inducida por ATRA en células DU145 (Fig. 6). En concreto, el ATRA inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata DU145 mediante la reducción del nivel de metilación del promotor de
HOXB13
inducida por EZH2 y DNMT3b. En perspectiva, los datos resultantes de este estudio pueden proporcionar pistas útiles para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la AR
-. El cáncer de próstata que implican el uso de ATRA y modificadores epigenéticos
EZH2 se une directamente sobre el promotor y HOXB13 induce trimethylation de H3K27 para reprimir la expresión HOXB13. DNMT3b ha sido contratado para el promotor HOXB13 por EZH2 para inducir la hipermetilación del ADN que resulta en una mayor represión del gen. Mientras tanto, ATRA reprime EZH2 y DNMT3b expresión, y deteriora su unión al promotor HOXB13 para disminuir el nivel de metilación del promotor HOXB13, lo que resulta en la activación de HOXB13, que a su vez inhibe el crecimiento de células DU145. Por otra parte, la represión de DNMT3b también aumenta el
RARβ
expresión, lo que puede aumentar la sensibilidad de las células DU145 a ATRA. Un tratamiento combinado de ATRA y 5-aza-DC provoca efectos mejorados sobre HOXB13 regulación al alza y la inhibición del crecimiento de células DU145.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
DU145, PC-3, LNCaP, 293 y 293T células fueron adquiridos por el Instituto de Biología celular (Shanghai, china).