Extracto
Desde hace más de una década, la citoquina interleuquina-12 (IL-12 ) ha sido utilizado, ya sea solo o en combinación con otros medicamentos, como un tratamiento para el cáncer. Las numerosas propiedades antitumorales de IL-12 todavía generar interés en el uso clínico de esta citocina, a pesar de que ha demostrado toxicidad cuando se administra sistémicamente. Como un enfoque para superar esta toxicidad, numerosos laboratorios han intentado inducir la expresión de IL-12 en el sitio del tumor. Sin embargo, para los tumores que son difíciles de eliminar quirúrgicamente o para el tratamiento de las metástasis diseminadas, la expresión sistémica de esta citocina todavía permanece como el método más eficaz de administración. Sin embargo, la búsqueda de enfoques alternativos para el uso de IL-12 en el tratamiento del cáncer y desentrañar la base de los efectos de lado de 12 IL siguen siendo un desafío. En el presente trabajo se demuestra que la expresión sistémica de IL-12 a través de inyección hidrodinámica de la IL-12 de ADNc es capaz de inducir diferentes tipos de lesiones hepáticas asociadas con una patología tóxico. Sin embargo aquí nos informe de que la toxicidad hepática está disminuida y la supervivencia de los ratones mejorados en ausencia del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Esta observación está en contraste con varios modelos murinos y los ensayos clínicos que postulan gamma interferón (IFN) como la citocina principal responsable de la toxicidad de IL-12. Además, nuestro trabajo demuestra que cuando IL-12 cDNA es co-inyectados con IL-18 cDNA o cuando los ratones se tratan previamente con una dosis baja de IL-12 cDNA antes de recibir una dosis alta de IL-12 cDNA, los niveles sistémicos de TNFa están casi completamente abrogada, lo que resulta en una mayor supervivencia y un menor daño hepático. Es importante destacar que la abrogación de la señalización de TNF no afecta a la fuerte actividad anti-tumor de IL-12. Por lo tanto, la neutralización de TNF con antagonistas ya aprobados para uso humano ofrece un enfoque prometedor para abrogar la IL-12 efectos secundarios durante el uso de esta citoquina para el tratamiento de cáncer de
Visto:. Barrios B, Baez NS, Reynolds D , Iribarren P, Cejas H, HA Young, et al. (2014) La extinción de TNFa La producción durante la inmunoterapia del cáncer es crucial para la supresión de los efectos secundarios debido a la expresión sistémica de IL-12. PLoS ONE 9 (2): e90116. doi: 10.1371 /journal.pone.0090116
Editor: Irving Coy Allen, Virginia Tech University, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Septiembre, 2013; Aceptado: 27 de enero de 2014; Publicado: 28 Febrero, 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Programa de Investigación Intramural del Centro para la Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer (NCI) , Institutos nacionales de Salud, y también por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (Argentina) y la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC, Argentina). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el inmunomodulador y funciones anti-angiogénicas de la IL-12 han sentado los fundamentos para la explotación de esta citocina como agente anticancerígeno. Hace más de una década, los ensayos clínicos que administran IL-12 para el tratamiento de tumores, incluyendo el linfoma de células T [1], el linfoma no Hodgkin [2], melanoma [3], el cáncer de ovario [4], el sarcoma de Kaposi [5] y carcinoma renal [6] fueron iniciados. Sistémica de IL-12 se demostró que era capaz de suprimir el crecimiento tumoral, metástasis y angiogénesis
in vivo
[7] - [11], pero su uso se ha asociado con la dosis significativo y la toxicidad dependiente de horario, lo que representa un obstáculo importante para su aplicación clínica [1], [3], [4], [6], [7]. toxicidad de grado 1-4, ha inhibido el uso de IL-12 como una terapia del cáncer. Sin embargo, los enfoques alternativos para el uso de IL-12 están bajo investigación intensiva en modelos animales de cáncer y en ensayos clínicos recientes [12] - [16]
Varios ensayos clínicos que utilizan IL-12 han demostrado que el aumento. los niveles de IFN de citoquinas inflamatorias se asociaron con diferentes grados de hepatotoxicidad y otros efectos secundarios tóxicos [2], [4], [6], [17]. Además, en varios modelos murinos, la expresión de IFN inducida después de la administración de IL-12 se encontró que era responsable de la mayoría de los efectos adversos observados [18] - [21].
Utilizando diferentes modelos de tumores murinos, hemos informado anteriormente que los niveles sistémicos de IL-12 solo o junto con IL-18, inducidos después de la inyección hidrodinámica de los respectivos ADNc, abrogadas por completo el crecimiento del tumor subcutáneo y pulmonar y metástasis hepáticas [10]. Además, la co-expresión de IL-12 + IL-18 fue capaz de mejorar la supervivencia por la disminución de los efectos de lado de 12 IL [10]. Nuestro trabajo anterior también demostró que IFN fue parcialmente responsable de los efectos de lado de 12 IL. Además, nuestros datos demuestran que el aumento de la supervivencia de la IL-12 + IL-18-ratones tratados se asocia con principios de la producción de IL-10 y una reducción de los niveles séricos de IFN y TNF [10]. En este contexto, el presente trabajo demuestra que mediante el uso de inyección hidrodinámica para inducir sistémica co-expresión de IL-12 + IL-18 ADNc o por pre-inyección de una dosis baja de IL-12 cDNA antes de una gran dosis de IL-12 ADNc, se observó el aumento significativamente la supervivencia como la hepatotoxicidad. Curiosamente, los dos métodos demuestran que este efecto está muy asociada con la abrogación de la expresión de TNF, una citoquina inflamatoria que también juega un papel patológico en estado de shock y sepsis
in vivo
LPS tratamiento [22] - [25]. En conjunto, los datos presentados en este trabajo contribuye a nuestra comprensión de la base de los efectos secundarios de la IL-12-sistémica. Además, proponemos que en función del sistema utilizado para inducir sistémica expresión de IL-12; diferentes mediadores tóxicos podrían ser los protagonistas de efectos secundarios adversos. Por otra parte, los datos presentados en este manuscrito pueden servir como base para el desarrollo de nuevos enfoques para disminuir la toxicidad de IL-12 en el diseño de futuras terapias para el tratamiento del cáncer que implica esta citocina.
Materiales y Métodos
Los ratones y las células de líneas
C57BL /6 (B6), los ratones 6-10 semanas de edad, fueron utilizados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos. Óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) knock out (KO), TNFa KO y los receptores TNF uno ratones (TNFαR1) KO en un /6 antecedentes genéticos C57BL se adquirieron de los Laboratorios Jackson, Bar Harbor, ME, EE.UU.. cuidado de los animales se proporciona de acuerdo con los procedimientos descritos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH-Publicación No. 86-23, 1985). Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso de Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Nuestra instalación de animales ha obtenido NIH garantía de bienestar animal (la garantía de que no. A5802-01, Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio, NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). Con el fin de evitar sufrimiento de los animales, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical rápidamente. Durante la inyección el interior del bazo (I. S.) tumor de células, un tiempo más corto de la cirugía se aplicó y las incisiones se hicieron tan mínimo como sea posible durante el procedimiento. Durante la recuperación de la cirugía, los ratones fueron colocados en mantas calientes y sus ojos se hidrataron con una solución salina. Los animales se colocaron de nuevo en jaulas después de la recuperación total a partir de la cirugía.
células de melanoma B16-F10 se obtuvieron de American Type Culture Collection. La línea celular estaba libre de infección por Mycoplasma y probado por PCR cada 6 meses. las células de melanoma B16-F10 se cultivaron en DMEM que contiene 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, 100 aminoácidos no esenciales g /ml de estreptomicina, y a 37 ° C, 5% de CO
2.
hidrodinámico Las inyecciones de ADNc
El procedimiento de transferencia génica hidrodinámica se ha descrito anteriormente [10], [26]. Brevemente, los animales se inyectaron en la vena de la cola en menos de 8 segundos con los ADNc respectivos disueltos en 1,6 ml de solución de cloruro de sodio estéril al 0,9% y se dividieron en 3 grupos, de control: 5-15 g de ORF cDNA de control de vector vacío, IL- 12: 5 g de IL-12 cDNA (pscIL-12, gen de fusión p40-p35) e IL-12 + IL-18: 5 g de IL-12 cDNA (pscIL-12, gen de fusión p40-p35) más 10 mg de la IL-18 cDNA (pro-IL-18 pdef). Todos los plásmidos de expresión utilizan el alargamiento promotor 1-α humano para conducir la transcripción.
El
in vivo
efectos observados tras la inducción de citoquinas son puramente debido a la expresión de los ADNc de citoquinas y no por LPS contaminación. ratones WT y TLR4 KO desarrollan niveles y la cinética de la expresión de TNF similares después de IL-12 de tratamiento de ADNc que indica la ausencia de LPS en la preparación de ADNc de citoquinas utilizado para la inyección (datos no mostrados).
bazo muestras
Para el análisis de citoquinas de
in vitro
células estimuladas, bazos fueron destruidos, agotado de células rojas por incubación en tampón ACK (Biowhittaker, Walkersville, MD), se lavaron y se volvieron a suspender en medio suplementado (RPMI 1640 de lisis, 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, 5 × 10
-5 M 2-mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM y aminoácidos no esenciales). Las suspensiones celulares se contaron y se estimularon
in vitro
con medio suplementado, anti-CD3 de anticuerpos recubiertos (Ab) (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) a 2 mg /ml o LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 1 mg /ml durante 72 h en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO
2.
ensayos
citoquinas y ALT
Los sueros se analizaron para la citoquina producción por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los kits utilizados fueron: mIL-10, mIFNγ, mTNFα (BD-Pharmingen, La Jolla, CA). aminotransferasa (ALT) de suero de alanina se determinaron utilizando un kit colorimétrico específico (Wiener Laboratorios) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
análisis histopatológico del tejido hepático
Los hígados obtenidos de ratones en los diferentes tratamientos grupos se recogieron el día 15 de tratamiento posterior de ADNc, se fijaron en 4% de formaldehído y luego se incluyeron en parafina. 6 micras secciones se prepararon y hematoxilina /eosina (H /E) o ácido periódico de Schiff (PAS) las manchas se aplicaron a las secciones. Secciones, sin identificación, se analizaron para determinar alteraciones de los tejidos bajo un microscopio óptico por un patólogo.
La citometría de flujo análisis
Para la tinción multicolor, Abs fluorocromo conjugado (BD-Pharmingen, La Jolla, CA ) en contra de marcadores de linaje se utilizaron en diversas combinaciones. En resumen, los receptores de Fc sobre las células se bloquearon con un anti-CD16 /32 Ab durante 30 min a 4 ° C y se lavan. Las células fueron teñidas para marcadores de la superficie durante 30 minutos a 4 ° C, se lavaron dos veces y se analizaron por citometría de flujo con un BD FACS Canto ™ II citómetro (BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.). Por citometría de flujo clasificación de células, los esplenocitos de IL-12 + IL-18-ratones tratados ADNc se tiñeron con CD4-fluorocromo marcado (clon RM4-5), CD8 (clon 53-6,7), CD11b (clon M1 /70) y CD11c (HL3 clon) anticuerpos (BD-Pharmingen, la Jolla, CA) y se ordenan en una pureza de 97 a 99% usando un clasificador de MoFlo (Dako Cytomation).
extracción de ARNm y análisis
el ARN total fue aislado utilizando un procedimiento de extracción con fenol /cloroformo de un solo paso (Trizol; Invitrogen Life Technologies). RT-PCR se realizó con 100 ng de ARN total para cada muestra (Super Escritura III un paso RT-PCR con el platino Taq, Invitrogen), que consiste en una reacción de transcripción inversa de 15 minutos a 45 ° C, 40 ciclos de desnaturalización a 94 ° C (15 s), hibridación a 55 ° C (30 s) y extensión a 68 ° C (60 s), con una extensión final de 5 min a 68 ° C. Los cebadores utilizados fueron:. INOS, el sentido 5'-ACG TTT GGG AAT GGA GAC TG-3 ', 5'-GTT antisentido GCA TTG GAA GTG AAG CGT TTC-3'
Western inmunotransferencia
Los esplenocitos se lisaron con 150 l de tampón de lisis enfriado en hielo y se centrifugaron a 14.000 rpm, 4 ° C durante 5 min. extractos de proteínas se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE 10% y se transfirieron a una membrana de PVDF Immun-Blot (BIO-RAD, Hercules, CA). Las membranas se bloquearon con 5% de leche, 0,1% Tween-20 en TBS toda la noche a 4 ° C y luego se incubaron con anticuerpos primarios durante 3 h a temperatura ambiente. Después de la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA), se detectaron las bandas de proteína con un Super Señal Substrato quimioluminiscente (Pierce) y la película BIOMAX-MR (Eastman Kodak, Rochester, NY).
se añadió Arginase Ensayo de actividad
Triton X-100 (0,1%, 100 l) a los pellets de esplenocitos que fueron tratados a continuación, como se indica. Después de 30 min de incubación, Tris-HCl y MnCl
2 mezcla (100 l) se añadieron a las células durante 10 min a 56 ° C. Las placas se incubaron con L-arginina (100 l) a 37 ° C durante 30 min, y después un H
2SO
4 /H
3PO
4 /H
mezcla 2O ( se añadió 800 l) y se calentó con acetona α-isopropilideno nitrobenceno (50 l) a 95 ° C durante 30 min. El complejo en cada pocillo se diluyó 20 veces con PBS para detectar la densidad óptica (OD) a valores de 540 nm con un espectrofotómetro UV.
ensayo de metástasis hepática y tumor subcutáneo crecimiento
C57BL /6 y los ratones KO eran TNFαRI se inyectados con células de melanoma B16-F10 (0.5 × 10
6 células /0,5 ml 0,9% de solución de cloruro de sodio) para el análisis de la metástasis hepática. Tres días más tarde, los ADNc fueron entregados por inyección hidrodinámica. Once días más tarde, se recogieron los hígados y se determinó el número de metástasis bajo un microscopio de disección.
Para evaluar el crecimiento de los tumores subcutáneos, fueron rasurados ratones C57BL /6 y TNFαRI KO inyectados por vía subcutánea y en el costado izquierdo con 1 x 10
6 células de melanoma B16-F10 en 0,2 ml de una solución de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Después de 10-14 días, cuando los tumores sólidos eran visibles (4-5 mm de diámetro), los ratones se inyectaron hidrodinámicamente con los ADNc designados. El crecimiento tumoral se controló con un calibre. Día 0 se corresponde con el día en que se administraron los ADNc.
El análisis estadístico
Para la significación estadística, los datos se analizaron por medio de un Student
t
prueba (comparación de 2 grupos experimentales) o prueba de ANOVA (composición de más de 2 grupos experimentales) con p & lt; 0,05 considere significativa. test no paramétrico (Kruskal-Wallis) se utilizó cuando
n
fue menos de 10. mouse curvas de supervivencia se representaron como Kaplan - Meier parcelas utilizando GraphPad Prism versión 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) y una p & lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Los cambios en el número de leucocitos después de la expresión sistémica de IL-12 o IL-12 + IL18
Hemos demostrado previamente que. agotamiento de las células T y las células NK /NKT aumenta la supervivencia de los ratones tratados con IL-12 [10]. Sin embargo, una toxicidad residual persiste después de agotamiento //célula NKT T NK, lo que sugiere que otros tipos de células también pueden ser parte de los efectos de IL-12-adverso [10]. Como un primer paso a la investigación de este problema se analizaron los cambios relativos en el número de leucocitos presentes en el bazo (y el hígado, que no se muestra) en comparación con los ratones control. Como se ve en la Figura 1, el número de NK y NKT subconjuntos son muy reducidos hasta 50 días después del tratamiento después de la administración de cualquiera de IL-12 o IL-12 + IL-18 ADNc. Estos datos parecía bastante sorprendente ya que el agotamiento de células /NKT NK se correlaciona con la mejora en la supervivencia de ratones tratados con IL-12 cDNA. Sin embargo, cuando se evaluó el fenotipo de las células NK obtenidas de ratones IL-12 tratadas, se observó que expresan altos niveles de IFN y el marcador de activación temprana CD69 (datos no mostrados). Estos datos sugieren que a pesar de que se encuentran en un número muy bajo, las células /NKT NK demuestran un fenotipo activado y por lo tanto puede ser parcialmente responsable de la toxicidad observada después de la expresión sistémica de IL-12.
C57BL /6 ratones se inyectaron hidrodinámicamente con el control, IL-12 y /o IL-18 ADNc. Hasta 50 días después de la inyección, los animales fueron sacrificados y se obtuvieron células individuales suspensiones de células esplénicas. El porcentaje de los diferentes subconjuntos se obtuvo mediante tinción linaje superficie con la combinación de los siguientes: Abs NK1.1, CD3, CD11b, CD19, CD4 y CD8 y se analizó por citometría de flujo. el número de células relativas de las diferentes poblaciones de células se calcularon dividiendo el número de células absolutos obtenidos de los ratones tratados con citocina por los números de células absolutos obtenidos a partir de ratones de control. Los datos se expresan como la media de un grupo de 4 experimentos diferentes (total n = 12 ratones por grupo). * 12 + 18 y 12 versus control p & lt; 0,05,
#12 vs 12 + 18 p. & Lt; 0,05
También observó una alteración en el número de linfocitos T después de la administración de ADNc de citoquinas. Mientras CD4
+ T células muestran una celularidad inferior durante la mayor parte de los períodos de tiempo analizados, CD8
+ células T se someten a una expansión en número durante la primera semana después del tratamiento, pero, posteriormente, volver a los niveles normales (fig.1).
a continuación se evaluó la población de macrófagos (Mφ) en los ratones tratados. IL-12 sola induce un aumento temprano en números Mφ mientras que en contraste, el número de estas células en ratones IL-12 + IL-18 tratadas no se expande (días 2 y 3 post-tratamiento). Por otra parte, a pesar de que los números Mφ alcanzan un pico más alto de la IL-12 + IL-18 ratones tratados durante el día 10, vuelven a los niveles normales durante el día 50 post-tratamiento, mientras que el número de Mφ en el grupo de IL-12 tratada sigue siendo elevada . El hecho de que un papel patogénico para estas células en otro modelo murino de IL-12 + IL-18 expresión sistémica se ha informado anteriormente [19], la hipótesis de que los mediadores producidos por Mφ podrían ser responsables, al menos en parte, para el tóxico efectos secundarios observados después de tratamiento sistémico IL-12.
El equilibrio entre el óxido nítrico (NO) la actividad de arginasa expresión y sugiere un perfil más inflamatoria en los macrófagos de tratado con IL-12 en comparación con IL-12 + IL-18 ratones tratados con
a continuación, se investigó el papel de NO como base para efectos de lado de 12 IL como es sabido NO ser inducida por Mφ en presencia de IL-12 + IL-18 [27] . La generación de NO por los neutrófilos y los monocitos se incrementa en pacientes sépticos y su persistencia se asocia con un pobre resultado clínico [28]. Por otra parte, el exceso de formación de NO juega un papel importante en la patogénesis de shock y fallo múltiple de órganos durante la sepsis y en la lesión pulmonar aguda [29]. En este contexto, se analizaron en primer lugar si NO /iNOS se expresa en nuestro modelo experimental. Como puede verse en la figura 2A, la expresión de ARN de iNOS es significativamente hasta reguladas en ambos IL-12 y IL-12 + ratones temprano después de la administración de ADNc 18-tratados y persiste durante al menos 15 días después del tratamiento (datos no mostrados). Curiosamente, el análisis de proteínas reveló que después de 15 días después del tratamiento, la expresión de iNOS es todavía hasta reguladas en los ratones tratados con IL-12 pero inferior o no se observa la expresión de la IL-12 + IL-18-ratones tratados (Fig. 2B) . Por otra parte,
in vitro
los niveles de NO evaluados en día 15 post-tratamiento de los esplenocitos estimulados con LPS mostraron una menor expresión en células obtenidas de IL-12 + IL-18-ratones tratados (datos no mostrados). Estos datos nos condujeron a determinar si la menor expresión de iNOS /NO en IL-12 + IL-18 tratadas con ratones podría explicar el resultado mejora de la supervivencia observada en este grupo, en comparación con los ratones IL-12 tratadas con [10]. Sorprendentemente, cuando monitorizamos la supervivencia en ratones WT y iNOS KO después de IL-12 o IL-12 + IL-18 administración de ADNc, se observó que la falta de expresión de iNOS no mejora la resistencia a los tratamientos (Fig. 2C). Estos resultados nos llevaron a la hipótesis de que el NO puede no estar directamente involucrado como mediador tóxica de estos tratamientos, pero la relación entre la expresión del NO Mφ /arginasa se podría proporcionar información acerca del ambiente inflamatorio que resulta de los diferentes tratamientos. De acuerdo con ello, la figura 2D muestra que los esplenocitos de los ratones IL-12 tratadas tienen actividad de arginasa significativamente menor en comparación con esplenocitos de IL-12 + ratones tratados con IL-18. Junto con los datos de iNOS, se concluye que la relación de NO /arginasa es mayor en los ratones tratados con IL-12 solo que en ratones tratados con IL-12 + IL-18. Este resultado sugiere que el tratamiento con IL-12 + IL-18 induce un fenotipo de macrófagos menos inflamatoria en comparación con ratones IL-12 tratadas.
(A) Análisis de RT-PCR de la expresión génica de iNOS en esplenocitos obtenidos a partir de los ratones inyectados con los ADNc designados, 12 + 18 y 12 vs control de p & lt; 0,05. (B) Análisis de transferencia Western de extractos de proteínas de esplenocitos obtenidos de ratones inyectados con los ADNc designados, 12 vs 12 + 18, p & lt; 0,05. (C) La supervivencia monitoreado en B6 (WT) o iNOS KO ratones en los días posteriores a la IL-12 o IL-12 + IL-18 de inyección-cDNA. (D) la actividad de arginasa mide determinación de los niveles de urea en 1 × 10
6 esplenocitos. Los datos de A, B y D se expresan como la media de 2 experimentos diferentes con 4-5 ratones por grupo. Curva de supervivencia fue construido como un conjunto de 2 experimentos diferentes con 5 ratones por grupo. * 12 + 18 vs 12 p. & Lt; 0,05
La expresión de IFN, TNF e IL-10 después de IL-12 + IL-18 el tratamiento
Nos han informado de que en IL 12 + IL-18 tratadas con ratones, la expresión temprana de IL-10 controla los niveles de las citocinas inflamatorias IFN y TNF [10]. Sin embargo, a pesar de que hemos realizado estos experimentos por el agotamiento de las diferentes poblaciones de leucocitos y la evaluación de la supervivencia en cada caso, no hemos podido identificar las fuentes de las citoquinas [10]. Para investigar esta cuestión, se evaluó la producción de IL-10, IFN y TNF a partir de esplenocitos ordenados obtenidos de IL-12 + IL-18-ratones tratados en el día 3 post-tratamiento, un punto de tiempo en el que se había observado previamente la producción de estas citoquinas (Figura 3). Hemos observado que es muy TNFa producido por CD8
+ células T y CD11b
+ plus CD11c
+ células (Mφ, las células dendríticas (DC) y las células asesinas naturales (NK) ordenados juntos). Dado que las células NK y los DC representan una población muy pequeña de esplenocitos en estos ratones (Fig. 1 y datos no presentados), se solucionaron todas estas células en conjunto para aumentar el número de células recuperadas. Para determinar la contribución de Mφ solo, se evaluó la expresión de citoquinas en cultivos de esplenocitos adherentes enriquecidas (& gt; 85% Mφ) y observamos que estas células también expresan altos niveles de TNFa. Esta observación sugiere que la expresión de TNF puede provenir principalmente de Mφ en lugar de los otros tipos de células presentes 2 en el CD11b /c
+ grupo ordenado (Fig. 3A). Por el contrario, IFN se expresa por CD4
+ y CD8
+ células T, pero no de Mφ, demostrando que la expresión de CD11b /c es probablemente debido a la presencia de células NK en este grupo (Fig. 3B). Curiosamente, IL-10 se produce por CD4
+ células T y también por DCs o células NK, pero no por Mφ (Fig. 3C). Estos datos sugieren que la depleción de las células T, NK y NKT, podría eliminar las fuentes de IFN (como se informó anteriormente [10]), pero Mφ aún permanecen como una fuente muy importante de TNFa. Este hallazgo es probablemente la razón por agotamiento de los linfocitos sólo mejoró parcialmente la supervivencia en ratones tratados con IL-12 [10]. Por otra parte, el hecho de que el perfil de Mφ parece ser más inflamatorio basado en los datos de NO /arginasa, podría explicar por qué los ratones IL-12 tratadas exhiben supervivencia mucho menor que IL-12 + ratones-18 tratadas con IL.
esplenocitos de IL-12 + IL-se obtuvieron 18 ratones y se tiñeron con anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD11b /c fluorocromo marcado Abs y luego ordenados a una pureza de 97 a 99% usando un clasificador de MoFlo (Dako Cytomation). Las células clasificadas se cultivaron en presencia de Ab anti-CD3 recubierto (2 mg /ml) y LPS (1 mg /ml) durante 72 h. Los sobrenadantes se recogieron a continuación y (A) TNFa, (B) IFN y (C) IL-10 expresión se evaluaron por ELISA. Los datos se expresan como la media de 2 experimentos diferentes con 4-5 ratones por grupo. * Estimulado vs no estimulado, p. & Lt; 0,001
TNF es una citoquina importante que media la IL-12 toxicidad sistémica
Para investigar el papel de TNF como mediador tóxico después de IL -12 expresión sistémica, se analizó la supervivencia de TNF KO o ratones TNFαR1 KO después de tratamiento con IL-12. Como se ve en la figura 4A, la abrogación de TNF o de sus genes del receptor de tipo 1 aumentó significativamente la supervivencia de IL-12-ratones tratados en comparación con los ratones WT. Curiosamente, cuando se analizó la cinética de los niveles séricos de TNF, se observó que los picos de expresión de proteínas alrededor de día 4 tanto en IL-12 + IL-18 y IL-12 en ratones tratados; sin embargo, los niveles son mucho más bajos en IL-12 ratones tratados con IL-18 + (Fig. 6C). Por otra parte, el día 8 y hasta el día 12 post-tratamiento, los niveles de suero de TNF comienzan a declinar en ambos grupos; sin embargo, sigue siendo persistente y siempre mayor en el grupo de tratamiento con IL-12 (Fig. 4B).
(A) Se controló la supervivencia en WT, TNFa KO y ratones KO TNFRI en los días post-IL-12 tratamiento de ADNc. * WT vs TNF KO y TNFRI KO, p & lt; 0,01. (B) Los ratones de control, IL-12 o IL-12 + IL-18-cDNA grupos tratados se extrajo sangre y los niveles de TNFa de suero se determinaron en los días post-tratamiento. (C) Los esplenocitos de control, IL-12 o IL-12 + IL-18 ratones tratados de ADNc se obtuvieron y se cultivaron en la presencia de medios de comunicación (NS), anti-CD3 Ab recubiertos o LPS durante 72 h. Los sobrenadantes se recogieron a continuación y expresión TNFa se evaluó por ELISA. * IL-12 vs IL-12 + IL-18, p & lt; 0,05. (D) Los sueros se obtuvieron a partir de ratones B6 tratados con control o IL 12-cDNA y de los ratones KO TNFRI tratados con IL-12 cDNA en los días después del tratamiento. Los niveles de ALT se determinaron usando un kit colorimétrico específico. Los datos de A, B y C se expresan como la media de 2 experimentos diferentes con 4 ratones por grupo. Los datos de la D se expresan como la media de la piscina de 3 experimentos diferentes (WT n = 12, TNFR1 KO n = 9). * WT IL-12 vs ADNc TNFRI KO IL-12 ADNc, p. & Lt; 0,05
A continuación, se comparó TNFa
in vitro
expresión por esplenocitos obtenidos de los ratones tratados
in vivo
con IL-12 solo o con IL-12 + IL-18. Mientras TNFa produjo después de
in vitro
la estimulación con un Ab anti-CD3 (estimulación de las células T) es bastante similar entre las células obtenidas a partir de los dos grupos, es significativamente menor en IL-12 + IL-18-ratones tratados cuando es estimulado
in vitro
con LPS (es decir, las CD de estimulación y Mφ) (Fig. 4C). Estos datos sugieren que los niveles más bajos de TNF sistémica observada en IL-12 + IL-18-ratones tratados es probablemente debido a una contribución reducida de Mφ y DCS en la expresión de esta citocina en este grupo de tratamiento.
sistémica de IL-12 o IL-12 + IL-18 el tratamiento provoca efectos patológicos en los tejidos inmunes y el hígado
expresión sistémica de IL-12 se ha informado de inducir varios tipos de cambios patológicos en modelos de ratón y en el cáncer pacientes [2], [4], [6], [17]. Para evaluar la toxicidad general del tratamiento con IL-12, sacrificamos el control y enfermos IL-12 e IL-12 + IL-18 ratones tratados y se realizó un análisis completo de la patología de órganos. Como puede verse en la Tabla S1, las principales alteraciones observadas son atrofia del timo y el agotamiento linfoide, y estos cambios parecían similares en IL-12 y IL-12 + IL-ratones tratados 18.
Sin embargo, la análisis también reveló una histiocitosis más intensa en los ganglios linfáticos (LNS) obtenidos a partir de ratones IL-12-tratado en comparación con IL-12 + IL-18-ratones tratados. Histiocitosis se asocia con la presencia de macrófagos en el tejido, por lo que la patología exacerbado en los ratones tratados con IL-12 se asocia con una importante expansión /presencia de macrófagos en los LN.
Las alteraciones en el tejido hepático después de la expresión sistémica de IL -12 o IL-12 + IL-18
A pesar de que no se observan diferencias en la histiocitosis al comparar los hígados de IL-12 e IL-12 + IL-18 ratones, los resultados anteriores confirman que los niveles de suero de la enzimas hepáticas ALT y la aspartato aminotransferasa (AST) fueron significativamente mayores en los ratones tratados con IL-12 [10]. Siguiente decidimos evaluar la patología de este órgano en lugar del hallazgo de que uno de los efectos más indeseables de la terapia sistémica de IL-12 es la hepatotoxicidad observada después de la administración de esta citoquina [2], [4], [6], [17]. Curiosamente, como se muestra en la Figura 4D, IL-12 tratamiento de TNF tipo 1 receptor ratones KO abroga el pico ALT observado por día 15 en los ratones WT.
Las características histopatológicas presentes en los hígados de los ratones tratados con IL- 12 o IL-12 + IL-18 ADNc revelaron cambios importantes en el tejido, incluyendo la aparición de: células con una forma redonda (globo de células) (Fig 5B.) en comparación con la forma hexagonal clásica de los hepatocitos de ratones de control (Fig. 5A). Además, los hígados de ratones tratados muestran la pérdida de los sinusoides hepáticos que se pueden observar claramente en los ratones de control (Figs. 5A vs 5B). Además, se observó focos de hematopoyesis ectópico (Fig. 5C) con la presencia de megacariocitos (Fig. 5D) en todo el hígado en IL-12- o IL-12 + ratones tratados 18-IL, pero no en los ratones de control. Ambos cuerpos de Mallory (Fig. 5E) y cuerpos de Councilman (Fig. 5F) y focos de tejido necrótico (Fig. 5G) sólo se pueden ver en los ratones tratados con los ADNc de citoquinas. Finalmente, se observó que los depósitos de glucógeno son muy reducidos en los ratones tratados con IL-12 o IL-12 + IL-18 (Fig. 5I) en comparación con los ratones de control (Fig. 5H). A pesar de todas estas lesiones están presentes en todo el tejido del hígado en los ratones tratados con IL-12 cDNA solo o IL-12 + IL-18 ADNc (alcanzando un máximo entre los días 14 a 16), la coadministración de IL-12 y IL-18 es capaz de reducir la incidencia de estas alteraciones hepáticas IL-12-asociado (Tabla S2). Estas observaciones se correlacionan con nuestros datos anteriores que demostró niveles más bajos de ALT y AST en suero de 12 + IL-18 tratadas con ratones [10]. Por otra parte, los ratones TNFαR1 KO (Fig. 5K) exhibieron una menor incidencia de estas características patológicas después de IL-12 de tratamiento de ADNc de lo que se observó en los ratones WT tratados (Fig. 5J), especialmente en el número y tamaño de focos infiltrado (Tabla S2 ).
los hígados obtenidos de ratones en los diferentes grupos se obtuvieron en días 14-16 tratamiento post-cDNA. Se obtuvieron secciones de 6 micras y (A-G) hematoxilina /eosina (H /E) o (H-I) ácido periódico de Schiff (PAS) manchas se aplicaron a las secciones. (A) Los hepatocitos y sinusoides de un ratón de control, 100 ×. (B) los hepatocitos en globo y ausencia de sinusoides hepáticos en un IL-12-cDNA tratados ratón, 100 ×. (C) Enfoque de la hematopoyesis ectópico en un IL-12-cDNA tratado ratón, 100 ×. (D) megacariocitos en un IL-12-cDNA tratado ratón, 100 ×. (E) Mallory y (F) los organismos concejal en un IL-12-cDNA tratados ratón, 100 ×. (G) Enfoque de la necrosis; 10 ×. depósitos de glucógeno obtuvieron en un ratón a partir de (H) del grupo de control o (I) el grupo de IL-12-cDNA, 20 ×. secciones de hígado de (J) WT o ratones (K) TNFR1 KO 15 días después de la IL-12 de tratamiento de ADNc. Las imágenes son representativas de 2 experimentos diferentes con 4-5 ratones por grupo.
B6 ratones fueron tratados con IL-12 solo ADNc (círculo negro), IL-12 + IL-18 cDNA (círculo abierto